APLICAÇÃO DE ENZIMAS HEMICELULOLÍTICAS NO PRÉ- TRATAMENTO DE FIBRAS DO PSEUDOCAULE DE BANANEIRA
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1 APLICAÇÃO DE ENZIMAS HEMICELULOLÍTICAS NO PRÉ- TRATAMENTO DE FIBRAS DO PSEUDOCAULE DE BANANEIRA A. I. S. BRÍGIDA 1*, N. F. VASCONCELOS 1, A. R. CASSALES 1, L. C. ALEXANDRE 1, M. F. ROSA 1, M. S. M. SOUZA FILHO 1, R. C. LEITÃO 1, G. S. PINTO 1 1 Embrapa Agroindústria Tropical CNPAT para contato: ana-iraidy@hotmail.com RESUMO Em processos que visam o aproveitamento de materiais lignocelulósicos, um dos grandes desafios é a remoção de lignina e hemicelulose sem a geração de elevadas cargas de poluentes como organoclorados, furfural e hidróximetil-furfural (HMF). O uso de tratamentos enzimáticos nestes materiais tem sido uma das propostas atualmente investigada de tecnologia de baixo impacto ambiental. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de um complexo hemicelulolítico e pectinolítico no pré-tratamento de fibras do pseudocaule de bananeira. A fim de obter uma polpa com maior área de contato, fibras com mesh entre 60 e 120 foram submetidas previamente a tratamento com ultrassom a uma frequência ultrassônica de 20 khz e 250 W de potência por 36 minutos. A hidrólise foi acompanhada através das concentrações de glicose, xilose, arabinose e celobiose no meio, quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A condição selecionada de hidrólise foi: reação catalisada por 0,5 % (v/v) de pectinases com 0,5 % (v/v) de hemicelulases, conduzida a 50 o C, sob agitação, em ph 5 por 4 horas. O sistema composto pelo consórcio de pectinases e hemicelulases proporcionou uma concentração de açúcares 2 vezes maior que sistemas apenas com hemicelulases e 4 vezes maior que sistemas apenas com pectinases. Estas características tornam o processo aplicável, especialmente na perspectiva de processos com o conceito de biorrefinaria, onde o hidrolisado poderia ser potencialmente utilizado na produção de biogás e bioetanol. 1. INTRODUÇÃO Em processos que visam à extração de celulose a partir de materiais lignocelulósicos, um dos grandes desafios é a remoção eficiente de lignina, hemicelulose e pectina. Alguns tipos de pré-tratamentos empregados, em especial os que se utilizam de altas temperaturas, longos tempos de reação e altas concentrações de reagentes, geram hidrolisados que, embora ricos em açúcares e outras matérias orgânicas, possuem concentrações elevadas de substâncias como derivados do furano e fenólicos que dificultam o tratamento biológico do mesmo (Mosier et al., 2005).
2 O uso de tratamentos enzimáticos em materiais lignocelulósicos tem sido uma das propostas atualmente investigada de tecnologia de baixo impacto ambiental, especialmente em processos de sacarificação completa da biomassa visando produção de etanol de segunda geração (Van Dyk e Pletschke, 2012). Dentre as enzimas estudas para a hidrólise de materiais lignocelulósicos, as celulases são a de maior destaque. Contudo, novos enfoques, especialmente visando o aproveitamento das pentoses liberadas pela hidrólise de hemicelulose, têm levado ao estudo da aplicação do complexo hemicelulolítico na hidrólise destes materiais (Sills e Gossett, 2011; Spagnuolo et al., 1997). No desenvolvimento desta tecnologia, a otimização de fatores como concentração de enzima, ph de reação, tempo de reação e sinergia entre enzimas é fundamental para a viabilidade técnico-econômica do processo (Van Dyk e Pletschke, 2012; Qing e Wyman, 2011; Sills e Gossett, 2011; Spagnuolo et al., 1997). Dentre os resíduos agroindustriais com potencial para fonte de celulose, tem-se a fibra do pseudocaule da bananeira (PCB). Segundo Fernandes et al. (2011), para cada tonelada de banana colhida, são geradas 3 toneladas de pseudocaule, o que representa, aproximadamente, 0,5 tonelada de fibra seca. Estudos de aproveitamento das fibras de pseudocaule da bananeira vêm demonstrando bons resultados em diversas áreas de pesquisa. Por exemplo, na produção de nanocelulose (PEREIRA, 2010) e na fabricação de papel através da utilização da celulose (Li et al., 2010). Contudo, estudos que visem melhorar os rendimentos de extração, bem como reduzir os impactos ambientais provocados pelos efluentes gerados no processo de extração, devem ser realizados. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi investigar a aplicação de complexos hemicelulolítico e pectinolítico comerciais no pré tratamento para a remoção de hemicelulose de fibras do pseudocaule de bananeira. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Materiais Foram utilizadas fibra de pseudocaule da bananeira (Musa spp.), cultivar Prata Anã, com tamanho de 60 a 120 mesh. As enzimas investigadas neste trabalho foram adquiridas pela Novozymes: complexo hemicelulolítico (NS22002) e pectinases (Pectinex XXL). Padrões para CLAE de xilose, arabinose, glicose e celobiose foram adquiridos pela Sigma- Aldrich Obtenção de Polpa com Ultrassom Utilizando-se um ultrassom de ponteira da marca UNIQUE, com frequência ultrassônica de 20 khz e operando com potência ultrassônica de 250 W, promoveu-se a polpação de fibras de pseudocaule com mesh entre 60 e 120. Para tanto 1 g de fibras foi imerso em 20 ml de água destilada e submetido a ultrassom de alta potência por 36 minutos. Além de obter um meio reacional mais homogêneo, buscou-se aumentar a área de contato fibra:enzima com este tratamento. O ph da polpa obtida após ultrassom foi ajustado com solução de NaOH ou HCl. A diluição da polpa ocorreu de forma a manter sempre 12,5 g de sólidos totais por litro de polpa.
3 2.3. Tratamento Enzimático da Fibra de Pseudocaule Visando a obtenção de uma fibra com menor teor de hemicelulose, investigou-se a utilização de hemicelulases e pectinases no pré-tratamento de fibra de pseudocaule de bananeira. Concentrações de 0,1, 0,5 e 1% (v/v) de hemicelulases foram testadas. Avaliou-se também o efeito de pectinases em consórcio com hemicelulases, ambas na concentração de 0,5% (v/v) em meio reacional. Ambos os experimentos foram conduzidos tanto em ph 5 quanto em ph 6, a fim de estudar a influência do ph de reação. A reação foi conduzida a 50 o C em sistemas reacionais de 50 ml sob agitação por 6 horas. Alíquotas de 4 ml de meio foram retiradas a cada 2 horas para acompanhar a reação. A hidrólise foi acompanhada pelo teor de xilose, arabinose, glicose e celobiose no meio reacional. O rendimento de hidrólise foi calculado com base na massa total dos 4 açúcares quantificados no hidrolisado frente aos sólidos totais presentes na polpa Tratamento com Ácido Diluído da Fibra de Pseudocaule Para comparar o pré-tratamento via rota enzimática com uma rota química, selecionouse uma rota tipicamente produtora de baixas concentrações de furfural e hidróximetil-furfural (HMF) baseada na hidrólise de hemicelulose da fibra de pseudocaule com ácido sulfúrico diluído em autoclave (121ºC, 1 atm). As condições de reação foram H 2 SO 4 a 1,75 % (m/v) e razão líquido:sólido de 12,5:1 por 120 min de reação. Ao fim da hidrólise, as fibras foram lavadas até ph do efluente se equiparar ao da água de lavagem e, posteriormente, submetidas a secagem a 40 o C Branqueamento O branqueamento das fibras pré-tratadas via rota química e enzimática foi realizado utilizando-se peróxido de hidrogênio. Para cada 5g de fibras em suspensão, 100 ml de H 2 O 2 20 % (v/v) e 30 ml de NaOH 4% (m/v) foram adicionados. A reação ocorreu por 90 minutos a 55 o C. Após a reação, as fibras foram filtradas e lavadas até ph da água de lavagem ser igual ao ph da água destilada utilizada neste processo. Ao fim da lavagem as fibras foram submetidas a secagem em estufa a 40 o C Análises das Fibras Tratadas Calorimetria diferencial de varredura: Medidas de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizadas em um calorímetro de fluxo de calor da marca TA Instruments, modelo Q20. Utilizou-se massa aproximada de 4 mg de amostra, realizando medidas na faixa de 25 C a 400 C sob fluxo constante de nitrogênio a 50mL/min e taxa de aquecimento a 20 C/min. Teste de colorimetria: O teste de colorimetria foi realizado em um colorímetro da HunterLab, modelo MiniScan EZ. O ensaio de alvura, que mede a refletância de ondas eletromagnéticas na faixa do azul (457 nm), foi realizado segundo a metodologia ISO 2470:1977. Cálculos de diferença de cores seguiram método descrito na TAPPI T 524 om-07 (TAPPI, 1994).
4 2.7. Análise de Açúcares Teor de açúcares no meio foi quantificado por CLAE, em equipamento Varian, com coluna modelo Varian PL Hi-Plex Ca 8um (300 x 7.7mm) mantida a 60 ºC utilizando detector de índice de refração, fase móvel água grau Mili-Q filtrada com fluxo de 0,5 ml/min. As amostras analisadas por CLAE foram previamente filtradas em membrana de acetato de celulose ME25 com 0,45 µl e D13 mm e, posteriormente, submetidas à filtração em cartucho C RESULTADOS 3.1. Hidrólise das Fibras com Enzimas Hemicelulolíticas Inicialmente, avaliou-se o efeito da concentração de hemicelulase na hidrólise de fibra de pseudocaule da bananeira (Figura 1). Na faixa de concentração estudada, o aumento da quantidade de hemicelulase disponibilizada no meio promoveu maior rendimento de hidrólise, sendo esta diferença observada especialmente em tempos mais longos de reação. Qing e Wyman (2011) também observaram maior efeito nas taxas de conversão provocado pelo aumento da quantidade de hemicelulases nos tempos de 4 a 24 horas de reação. Figura 1 Efeito da concentração de hemicelulases (%, v/v) e do ph do meio reacional no rendimento de hidrólise da fibra de pseudocaule da bananeira (%, ST), em reação conduzida a 50 o C, sob agitação. Em ph 5, o ganho de rendimento foi mais expressivo quando elevou-se de 0,1% para 0,5% a concentração de enzima, havendo pouca diferença entre 0,5% e 1%, especialmente quando se leva em consideração os custos de aplicação de 1% frente aos de 0,5%. Outros trabalhos também reportam que, dependendo da condição de hidrólise, há pouca ou nenhuma
5 interferência da concentração de hemicelulases no rendimento de hidrólise, especialmente pela interação destas com os xilo-oligômeros a serem hidrolisados (Qing e Wyman, 2011). Já para as reações conduzidas em ph 6, observou-se um aumento de 1,5% para 4% de rendimento quando elevou-se de 0,5% para 1% a concentração de enzima no meio. Como o complexo enzimático de hemicelulase utilizado é na verdade uma mistura de atividades de β- glucanase, xilanases e outras, tal diferença frente à mudança de ph está relacionado, principalmente, aos pontos de atividade ótima para cada enzima presente. Por fim, comparando as hidrólises nos diferentes valores de ph de reação, melhores rendimentos foram encontrados a ph 5. Este valor está dentro da faixa de ph recomendado pra uso deste complexo enzimático (Novozyme, 2012) Hidrólise das Fibras com Consórcio de Pectinases e Hemicelulases Com base nos resultados obtidos no estudo de concentração de hemicelulases na hidrólise de fibra de pseudocaule, selecionou-se a concentração de 0,5% para avaliar o efeito do consórcio de pectinases com hemicelulases. E, embora tenha-se observado maior rendimento em hidrólise a ph 5, optou-se por realizar os testes em ph 5 e ph 6, haja vista que o comportamento das pectinases e da sinergia destas com hemicelulases frente aos ph s estudados na hidrólise de fibra de pseudocaule eram desconhecidos. A Figura 2 mostra os rendimentos de hidrólise enzimática utilizando pectinases e hemicelulases em ph 5 e 6. Figura 2 Efeito do consórcio de 0,5 % (v/v) de pectinases com 0,5 % (v/v) de hemicelulases e do ph do meio reacional no rendimento de hidrólise da fibra de pseudocaule da bananeira (%, ST), em reação conduzida a 50 o C, sob agitação. Em ambos os valores de ph estudados, o uso de hemicelulases em consórcio com pectinases promoveu um aumento no rendimento de hidrólise quando comparado à hidrólise apenas com enzimas hemicelulolíticas. Menor ganho foi observado em ph 6, onde também se observou menores rendimentos para as enzimas aplicadas de forma individual. Em ph 5,
6 teve-se rendimento de 11,1% para o consórcio hemicelulases-pectinases, aproximadamente, o dobro do rendimento utilizando apenas hemicelulases (5,1%). O rendimento teórico obtido, soma dos efeitos individuais de hemicelulases e pectinases na hidrólise de pseudocaule, foi de 7,8 e 2,2 %, para ph 5 e 6, respectivamente. Para ph 6, o valor foi bem próximo ao obtido quando utilizou-se as duas enzimas, 2,4%. Outros trabalhos também observaram valores de efeito combinado próximos ao da soma de efeitos, especialmente em estudos de consórcio de hemicelulases com celulases (Spagnuolo et al., 1997). Na hidrólise a ph 5, o efeito combinado foi maior que a soma dos efeitos, o que representa uma sinergia no uso destas enzimas em conjunto neste valor de ph. Em estudos de hidrólise de polpa de beterraba com hemicelulases e pectinases, também observou-se um ganho do efeito combinado frente à soma dos efeitos, especialmente quando o preparado Pectinex foi utilizado, representando uma diferença de, aproximadamente, 4% percentual de sacarificação (Spagnuolo et al., 1997), valor um pouco inferior ao encontrado no presente estudo (3,3 %). Com base nestes resultados, a condição selecionada de hidrólise enzimática da fibra de pseudocaule da bananeira foi: reação catalisada por 0,5 % (v/v) de pectinases com 0,5 % (v/v) de hemicelulases, conduzida a 50 o C, sob agitação, em ph 5 por 4 horas. A concentração de açúcares totais quantificados nestas condições foi de 1,4 g/l. Outros tipos pré-tratamentos de pseudocaule de banana obtiveram uma concentração máxima de 5,5 g/l (El-Zawawy et al., 2011), enquanto que no pré-tratamento ácido utilizado neste trabalho como comparativo, a concentração de açúcares foi de 7,2 g/l. Contudo, considerando as devidas diferenças de massa de fibra utilizada para cada sistema reacional, o rendimento da hidrólise enzimática em massa bruta (11,1 %) foi um pouco maior do que o rendimento da hidrólise com ácido sulfúrico (9 %), utilizado como padrão. A Figura 3 mostra as curvas de DSC das fibras de pseudocaule de bananeira naturais ultrassonicadas e pré-tratadas com complexo enzimático apresentando eventos térmicos tanto de natureza endotérmica quanto exotérmica. O primeiro evento endotérmico é relativo à evaporação de água em ambas as fibras. O segundo endotérmico está relacionado à vaporização de extrativos residuais que não foram removidos pós ultrassonicação, nem pós pré-tratamento enzimático. Já os eventos exotérmicos e endotérmicos observados a partir de 250 o C estão relacionados à degradação de hemicelulose, lignina e celulose. As pequenas variações energética presentes nestes últimos eventos mostram que o tratamento enzimático, embora tenha apresentado baixo rendimento, promoveu modificação na proporção dos teores de hemicelulose e celulose presentes na fibra de pseudocaule.
7 Figura 3 Curvas de DSC das fibras de pseudocaule da bananeira natural e tratada com enzima obtidas em atmosfera inerte (N 2 ) Efeito do Tratamento no Branqueamento Definidas as condições de hidrólise enzimática da polpa de fibra de pseudocaule de bananeira, avaliou-se, por colorimetria, a influência deste pré-tratamento nos resultados de branqueamento das fibras (Tabela 1). As fibras naturais e pré-tratadas apresentaram índice de alvura semelhante, contudo, observou-se uma pequena redução nos valores de a e b, refletindo numa leve perda de brilho, indicada pela redução no valor de croma (C). Tabela 1 Teste colorimétrico de fibras de pseudocaule da bananeira submetidas a diferentes tratamentos Amostra Alvura (% ISO) a * b * C ** h ** Natural 55,5 6,1 18,0 19,0 1,2 Trat. c/ Enzima 55,5 0,2 14,6 14,6 1,6 Branqueada 68,2-0,4 15,5 15,5-1,6 Trat. c/ Ácido & Branqueada 82,3-1,3 10,3 10,3-1,4 Trat. c/ Enzima & Branqueada 83,7-0,1 4,1 4,1-1,5 * a e b duas gamas de cor que vão respectivamente do verde ao vermelho e do azul ao amarelo com valores que vão de -120 a +120; ** C e h são croma (ou saturação) e hue (ou tonalidade), respectivamente. Após o pré-tratamento via rota enzimática, as fibras foram branqueadas (Figura 4) e os resultados de colorimetria foram comparados aos de fibras branqueadas sem pré-tratamento e de fibras branqueadas pós pré-tratamento via rota química (Tabela 1). O branqueamento sem pré-tratamento apresentou um ganho de 12,7% de alvura, mas, ao realizar o pré-tratamento enzimático o ganho passa para 28,2%. A alvura da polpa obtida por branqueamento de fibra pré-tratada via rota enzimática (83,7%) está próxima ao valor mínimo de alvura exigido em
8 indústrias de papel (>87%), o que reflete que com pequenas otimizações no processo de branqueamento espera-se obter um material com elevado teor de celulose. Figura 4 Aspecto visual das polpas de pseudocaule da bananeira obtidas por branqueamento de fibra: (a) natural e (b) tratada com ultrassom e enzima Ao comparar os resultados de branqueamento das fibras pré-tratadas via rota enzimática com os das fibras pré-tratadas por rota química, observou-se índice de alvura um pouco mais elevado para fibras pré-tratadas via rota enzimática. Esta diferença é coerente com o maior rendimento de hidrólise encontrado para este processo, apresentado no item 3.2. O valor de croma (C) das fibras branqueadas pré-tratadas via rota enzimática foi reduzido para mais da metade, quando comparado aos das fibras branqueadas pré-tratadas por rota química, indicando acentuada perda de brilho após esse tratamento. A redução do ângulo hue (h) para as fibras branqueadas representa a redução do tom verde que contribui para a coloração final das fibras, confirmado pelo valor negativo do índice a, na Tabela CONCLUSÕES Dentro da faixa de concentração de enzimas estudada, observou-se que o rendimento de hidrólise é diretamente proporcional à concentração de hemicelulase. Maiores rendimentos foram obtidos em ph 5 após 4 horas de reação. O consórcio de pectinases e hemicelulases representou uma concentração de açúcares 2 vezes maior que sistemas apenas com hemicelulases e 4 vezes maior que sistemas apenas com pectinases. Desta forma, a condição selecionada de hidrólise enzimática da fibra de pseudocaule da bananeira foi: reação catalisada por 0,5 % (v/v) de pectinase com 0,5 % (v/v) de hemicelulase, em sistema reacional com 12,5 g de sólidos totais por litro, conduzida a 50 o C, sob agitação, em ph 5 por 4 horas. Ao comparar as fibras branqueadas pós pré-tratamento enzimático com as fibras branqueadas pré-tratadas por rota química, pode-se afirmar que os dois métodos são eficientes para obtenção de uma polpa branca, com índice de alvura e rendimento de hidrólise bastante próximos, apropriada para obtenção de nanocelulose. Estas características tornam o processo aplicável, especialmente na perspectiva de processos com o conceito de biorrefinaria, onde o líquido do hidrolisado poderia ser potencialmente utilizado na produção de biogás e bioetanol, haja vista que nesse processo não se espera a formação de HMF e furfural.
9 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a EMBRAPA e Rede AgroNano pelo auxílio financeiro e ao CNPq pela bolsa PNPD (processo n o /2011-7). 6. REFERÊNCIAS EL-ZAWAWY, W.K.; IBRAHIM, M.M.; ABDEL-FATTAH, Y.R.; SOLIMAN, N.A.; MAHMOUD, M.M. Acid and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materials into glucose for ethanol production. Carbohydrate Polymers, v.84, p , FERNANDES, E.R.K.; AFUSO, R.K.S.; SCHMITT, C.C.; SELLIN, N.; SOUZA, O.; MEDEIROS, S.H.W. Avaliação do potencial para reaproveitamento de resíduos da bananicultura por pirólise. In: II Simpósio Internacional sobre Gerenciamento de Resíduos Agropecuários e Agroindustriais. 2011, Foz do Iguaçu. Anais... Foz do Iguaçu.1 CD-ROM. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Paper and board: measurement of disuse blue reflectance factor (ISO brightness). Genève, p. (ISO 2470:1977). LI, K.; FU, S.; ZHAN, H.; ZHAN, Y. LUCIAM L.A. Banana pseudo-stem chemistry, structure, Bioresource Technology, v. 5, p , MOSIER, N.; WYMAN, C.; DALE, B.; ELANDER, R.; LEE, Y.Y.; HOLTZAPPLE, M. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, v. 96, p , Novozyme, Disponível em: samples/documents/application_sheet_cellulosic%20ethanol_enzyme_kit_final.pdf, Acessado em: 10 de fevereiro de PEREIRA, A. L. S. Nanocelulose do pseudocaule da bananeira Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em Engenharia Química) - Universidade Federal do Ceará. Orientador: Morsyleide de Freitas Rosa. QING, Q.; WYMAN, E. Hydrolysis of diferente chain lenght xylooligmers by celulase and hemicellulase. Bioresource Technology, v. 102, p , SILLS, D. L.; GOSSETT, J. M. Assessment of commercial hemicellulases for saccharification of alkaline pretreated perennial biomass. Bioresource Technology, v. 102, p , SPAGNUOLO, M.; CRECCHIO, C.; PIZZIGALLO, M.D.R.; RUGGIERO, P. Synergistic effects of cellulolytic and pectinolytic enzymes in degrading sugar beet pulp. Bioresource Technology, v. 60, p , Technical Association for the woldwide pulp, paper and converting industry. TAPPI Standard Test Methods. Atlanta VAN DYK, J.S.; PLETSCHKE, B.I. A review of lignocellulose bioconversion using enzymatic hydrolysis and synergistic cooperation between enzymes Factors affecting enzymes, conversion and synergy. Biotechnology Advances, PRELO, 2012.
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