UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA Inativação de células planctônicas de candida albicans empregando terapia fotodinâmica JOÃO NILTON LOPES DE SOUSA Orientadora: Prof a Dra. Ângela Toshie Araki Co-Orientador: Prof o. Dr. Petrusk Homero Campos Marinho Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia. SÃO PAULO 2014

2 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL S716i Sousa, João Nilton Lopes de. Inativação de células planctônicas de candida albicans empregando terapia fotodinâmica / João Nilton Lopes de Sousa. -- São Paulo; SP: [s.n], p. : il. ; 30 cm. Orientadora: Ângela Toshie Araki. Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Candida albicans 3. Azul de metileno. I. Araki, Ângela Toshie. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título. CDU: : (043.2)

3 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Inativação de células planctônicas de candida albicans empregando terapia fotodinâmica JOÃO NILTON LOPES DE SOUSA Tese de doutorado defendida e aprovada pela Banca Examinadora em 16/10/2014. BANCA EXAMINADORA: Prof a Dra. Ângela Toshie Araki Universidade Cruzeiro do Sul Presidente Prof. Dr. Cacio Moura Netto Universidade Cruzeiro do Sul Prof. Dr. Igor Prokopowisch Universidade Cruzeiro do Sul Profa. Dra. Sueli Patrícia Harumi Miyagi de Cara Universidade de São Paulo Prof. Dr. José Luiz Lage-Marques Universidade de São Paulo

4 DEDICATÓRIA Dedico ao maior e precioso ser, que possui o poder da vida e do conhecimento. A força que me fez surgir e que, em nele, confio o meu existir e minha sabedoria. Dedico este trabalho e minha vida a meu primeiro pai: DEUS. A José Lopes e Rita Maria, meus pais, que apesar da sua insipiência no conhecimento científico; souberam, muito bem, conduzir-me nos princípios educativos e morais. Souberam abdicar de minha presença e entregar-me a outra família que me deu oportunidade de ser o que vocês desejavam. Muito obrigado papai e mainha. Às pessoas que fizeram de um sobrinho, um filho. Vocês são tão importantes para este momento, quanto um ser vivo precisa do oxigênio para existir. Vocês foram à base de tudo. Dependo de vocês todo o momento de minha vida, pois necessito disto para ser feliz. Tio Chagas e tia Kilma, muito obrigado por tudo. A meus irmãos Janetton, José Lopes Filho, Régia e Renato. Como também, aos meus irmãos primos, Chaguinha, Georgia, Marcília e Matheus. Vocês também fazem parte desta história. Divido minha felicidade com todos vocês. Muito obrigado por sempre confiar no meu crescimento. Amo vocês. A José Lopes Filho, Rita Maria e Francisco das Chagas, meu irmão, minha mãe e meu tio. Hoje agradeço a força que vocês deram em relação ao doutorado. No momento que senti o sonho distante, vocês mostraram que ele poderia ser real. À minha esposa, Lorena, e ao meu filho, João. Vocês foram as pessoas que sempre estiveram ao meu lado. Escutaram meus devaneios e meus estresses. Souberam suportar minha distância tanto presencial, quanto em pensamento. Sei que fiz deste trabalho uma prioridade momentânea da minha carreira profissional. Assim como sei que vocês serão a prioridade de toda minha vida. Amo vocês.

5 AGRADECIMENTOS A professora Dra. Ângela Toshie Araki, pela orientação, aprendizado, amizade e dedicação ao desenvolvimento deste trabalho. Meu profundo agradecimento. Ao professor Dr. Petrusk Homero Campos Marinho, pela co-orientação, simplicidade, amizade e por seu profundo interesse de sempre ensinar. Suas contribuições foram de suma importância para o desenvolvimento deste trabalho. A professora Dra. Patrícia Oliveira, pela dedicação, aprendizado no laboratório de ciências básicas do curso de biomedicina das Faculdades Integradas de Patos FIP. A José Alexandre de Morais, Coordenador dos laboratórios do curso de biomedicina das Faculdades Integradas de Patos - FIP, pelo apoio técnico no laboratório. A Patrícia Barbosa Pereira, Técnica do laboratório de ciências básicas do curso de biomedicina das Faculdades Integradas de Patos FIP, pelo apoio na preparação dos meios de cultura. A João Leuson Palmeira Gomes Alves, presidente das Faculdades Integradas de Patos - FIP, por permitir a realização deste estudo em sua instituição de ensino. Ao Prof. Dr. Michel Nicolau Youssef, coordenador do programa de pós-graduação do doutorado em Odontologia da Universidade Cruzeiro do Sul. Aos professores do corpo docente do Doutorado em Odontologia da Universidade Cruzeiro do Sul: Prof. Dr. Cacio Moura Netto; Prof. Dr. Danilo Antonio Duarte; Prof. Dr. Igor Prokopowitsch; Prof. Dr. Lúcio Frigo; Prof. Dr. Michel Nicolau Youssef; Prof. Dr. Walter João Genovese; Prof a. Dra. Adriana de Oliveira Lira Ortega; Prof a. Dra. Carina Sinclér Delfino; Prof a. Dra. Eliete Rodrigues de Almeida; Prof a. Dra. Giselle Rodrigues Sant Anna; Prof a. Dra. Michele Baffi Diniz; Prof a. Dra. Maria Teresa Botti; Prof a. Dra. Mariana Ferreira Leite; Prof a. Dra. Renata Oliveira Guaré e Prof a. Dra. Wanessa Christine de Souza Zaroni

6 A turma do Doutorado em Odontologia, com a qual convivi momentos de cumplicidade, descontração e amizade. Em especial a Rachel de Queiroz Ferreira Rodrigues, por sua demonstração de amizade, pelo companheirismo, incentivo, e compreensão dedicada a mim durante nosso convívio. A Profª Dra. Sueli Cristina Marquesi, Magnífica Reitora da Universidade Cruzeiro do Sul. A Prof a. Tania Cristina Pithon-Curi, Pró-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa da Universidade Cruzeiro do Sul. Aos funcionários da Universidade Cruzeiro do Sul que direto ou indiretamente fizeram parte desta jornada.

7 Tua palavra é lâmpada para os meus pés e luz para o meu caminho Salmo119

8 SOUSA, J. N. L. Inativação de células planctônicas de candida albicans empregando terapia fotodinâmica f. Tese (Doutorado em Odontologia)- Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, RESUMO Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da terapia fotodinâmica na inativação de células planctônicas de Candida albicans (ATCC10231), empregando azul de metileno como fotossensibilizador nas concentrações de 37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300 µg/ml. Alíquotas de 100 µg/ml da suspensão do fungo na concentração de 10 6 células/ml foram semeadas em placas de microtitulação com 96 poços, nos quais foram depositados o mesmo volume de azul de metileno, permanecendo por um período de pré-irradiação de 1, 5, 10 e 20 min. Em seguida, aplicou-se luz laser de baixa potencia (comprimento de onda = 660 nm, potência de 100 mw e dose de 426 J/cm 2 ) por 128s, utilizando um Laser semicondutor portátil (Laser DUO, GaAlAs, InGaAlP, MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP Brasil). Experimentos controles foram realizados, sem iluminação, na ausência e na presença de azul de metileno e, com iluminação, substituindo o fotossensibilizador por solução salina. De cada condição experimental, diluições em série (10-1, 10-2 e 10-3 ) foram obtidas e alíquotas de 25 µl foram plaqueadas em duplicata em Agar Sabouraud Dextrose. Após este período, o número de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) foi determinado e os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Kruskal Wallis (p <0,05). A terapia fotodinâmica, com azul de metileno na concentração de 37,5 µg/ml e tempos de incubação de 10 e 20 min, reduziu significativamente (p = 0,007) o número de UFC/mL. Nas concentrações de 75 µg/ml, 150 µg/ml e 300 µg/ml a redução foi significativa (p 0,05) já a partir de 5 min de incubação, não havendo diferença entre os tempos de 10 e 20 min de pré-irradiação. Na ausência de irradiação com laser, o azul de metileno não produziu redução de UFC/mL. A Terapia Fotodinâmica apresentou efeito antifúngico contra Candida albicans, podendo ser utilizada como coadjuvante ao tratamento convencional. Palavras-chave: Candida albicans, Terapia fotodinâmica, Azul de metileno.

9 SOUSA, J. N. L. Inactivation of planktonic cells of candida albicans using photodynamic therapy f. Tese (Doutorado em Odontologia)-Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, ABSTRACT The aim of this study is to evaluate the effect of photodynamic therapy in the inactivation of planktonic cells of Candida albicans (ATCC10231), using methylene blue as a photosensitizer at concentrations 37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml and 300 µg/ml. Aliquots of 100 mµ / ml suspension of the fungus in a concentration of 10 6 cells / ml were seeded in microtiter plates with 96 wells, onto which were deposited in the same volume of methylene blue, remained for a period of preirradiation of 1, 5, 10 and 20 minutes. Thereon, it was applied laser light of low power (wavelength = 660 nm, power 100 mw and a dose of 426 J/cm²) for 124s, using a portable semiconductor laser (Laser DUO, GaAlAs, InGaAlP, MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP - Brazil). Control experiments were developed, without illumination, in the absence and the presence of methylene blue with light, and with illumination, replacing the photosensitizer by saline solution. For each experimental condition, serial dilutions (10-1, 10-2 e 10-3 ) were obtained and aliquots of 25 µl were plated in duplicate on Sabouraud Dextrose Agar. After this period, the number of colony forming per milliliter (CFU / ml) units was determined and the data were subjected to analysis of variance and Kruskal-Wallis test (p <0.05). Photodynamic therapy, with methylene blue at a concentration of 37.5 mg / ml and incubation time of 10 and 20 min, reduced significantly (p = 0,007) the number of CFU/mL. In concentrations of 75 µg/ml, 150 µg/ml and 300 µg/ml reduction was significant (p< 0,05) at 5 min of incubation, with no difference between the periods of 10:20 min of pre -irradiation. In the absence of laser irradiation, methylene blue produced no reduction of CFU/mL. Photodynamic therapy showed an antifungal effect against Candida albicans, which might be used as an adjunct to conventional treatment. Keywords: Candida albicans, Photodynamic therapy, Methylene blue.

10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Ilustração esquemática do mecanismo de ação da PDTErro! Indicador não definido. Figura 2 Cepa de Candida albicans utilizada no estudo.erro! Indicador não definido. Figura 3 Preparo do meio de cultura nas placas de PetriErro! Indicador não definido. Figura 4 Em A, Azul de Metileno forma de apresentação em pó. Em B, o corante manipulado nas concentrações testes.erro! Indicador não definido. Figura 5 Placa de microtitulação na ausência de luz e envolvida por uma lâmina de papel alumínio.... Erro! Indicador não definido. Figura 6 Em A, aparelho de laser e, em B, calibração da potência do aparelho no comprimento de onda de 660 nm.... Erro! Indicador não definido. Figura 7 - Placas de microtitulação estéreis com 96 poçoserro! Indicador não definido. Figura 8 Desinfecção da ponteira do aparelho... Erro! Indicador não definido. Figura 9 Preparação do inóculo de Candida albicans com densidade celular de 106 unidades formadoras de colônias por ml (UFC/mL)... Erro! Indicador não definido. Figura 10 Câmara de fluxo laminar, onde foram realizados os experimentos. Erro! Indicador não definido. Figura 11 Ilustração esquemática do grupo terapia fotodinâmicaerro! não definido. Indicador Figura 12 Em A, Transferência de alíquotas de 100µL da suspensão do fungo para o poço da placa de microtitulação. Em B, transferência do mesmo volume de AM para o poço. Em C, placa no escuro durante o período de incubação e, Em D, irradiação do conteúdo do poço.. Erro! Indicador não definido. Figura 13 Ilustração esquemática do grupo Azul de MetilenoErro! Indicador não definido. Figura 14 Ilustração esquemática do grupo Laser... Erro! Indicador não definido.

11 Figura 15 Ilustração esquemática do grupo solução salinaerro! Indicador não definido. Figura 16 Ilustração esquemática das diluições seriadas pipetadas em duplicata... Erro! Indicador não definido. Figura 17 Contagem das UFC com auxílio de um contador de colônias... Erro! Indicador não definido. Gráfico 1 Avaliação do efeito citotóxico das concentrações (37,5; 75; 150 e 300µg/mL) de azul de metileno, na ausência de luz, com tempos de incubação de 1, 5, 10 e 20 min.... Erro! Indicador não definido. Gráfico 2 Comparação da média do log10ufc/ml entre os grupos PDT AM e grupos controles... Erro! Indicador não definido.

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) para os grupos controles nos diferentes tempos de incubação... Erro! Indicador não definido. Tabela 2 Comparação da média e desvio padrão do log10ufc/ml entre os grupos AM e PDT AM segundo as concentrações de AM e tempos de incubação... Erro! Indicador não definido.

13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AM ASD CCT CNV CUR FS HIV LASER LED PDT ROS TBO UFC Azul de metileno Agar Sabouraud Dextrose Coleção de culturas tropicais Neovascularização coroidal Curcumina Fotossensibilizador Vírus da Imunodeficiência Humana Light Amplification by Stimulated of Radiation (amplificação da luz por emissão estimulada de radiação) Light Emitting Diode (diodo emissor de luz) Terapia Fotodinâmica Espécies reativas de oxigênio Azul de toluidina Unidade formadora de colônia

14 LISTA DE SÍMBOLOS C Grau Celsius cm GaAlAs centímetro Arceneto de gálio e alumínio InGaAlP Índio Gálio Alumínio Fósforo g h J J/cm 2 L Log mw min ml NaCl nm OH - s grama (peso) horas Joule Joules por centímetro quadrado litro logaritmo miliwatts minutos Mililitro Cloreto de sódio nanômetro Íon hidroxila segundos µg micrograma µm micromolar µl Microlitros W watts aproximadamente % por cento 1 S * Fotossensibilizador no estado singleto

15 0 S Fotossensibilizador no estado fundamental 3 S * Fotossensibilizador no estado tripleto O 2 Oxigênio molecular 1 O 2 Oxigênio singleto Marca registrada

16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... ERRO! IND 2 REVISÃO DA LITERATURA... ERRO! IND 2.1 Efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (PDT)Erro! Indicador não definido. 2.2 Papel dos agentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmicaerro! Indicador não de 2.3 Etiologia e patogenia da Candidíase... Erro! Indicador não definido. 2.4 Inativação de Candida albicans por terapia fotodinâmica (PDT)Erro! Indicador não defin 3 OBJETIVOS... ERRO! IND 3.1 Objetivo Geral... Erro! Indicador não definido. 3.2 Objetivos Específicos... Erro! Indicador não definido. 4 MATERIAIS E MÉTODOS... ERRO! IND 4.1 Tipo e Local do Estudo... Erro! Indicador não definido. 4.2 Instrumentos... Erro! Indicador não definido Microrganismo e meio de cultura... Erro! Indicador não definido Preparo do fotossensibilizador (FS) e tempo de incubaçãoerro! Indicador não definido Fonte de irradiação para a terapia fotodinâmica (PDT)Erro! Indicador não definido Preparo do inóculo de Candida albicans... Erro! Indicador não definido. 4.3 Condições Experimentais... Erro! Indicador não definido Grupo Terapia fotodinâmica (Grupo PDT)... Erro! Indicador não definido Grupo Azul de Metileno (Grupo AM)... Erro! Indicador não definido Grupo Laser (Grupo L)... Erro! Indicador não definido Grupo solução salina (Grupo SS)... Erro! Indicador não definido Avaliação da viabilidade das células de Candida albicanserro! Indicador não definido Técnica de Contagem das UFC/mL... Erro! Indicador não definido Análise estatística... Erro! Indicador não definido. 5 RESULTADOS... ERRO! IND 6 DISCUSSÃO... ERRO! IND

17 7 CONCLUSÕES... ERRO! IND REFERÊNCIAS... ERRO! IND ANEXOS... 99

18 17 1 INTRODUÇÃO Fungos oportunistas podem provocar infecções superficiais ou invasivas graves, especialmente em pacientes debilitados ou imunocomprometidos. Devido a dificuldades no diagnóstico e a disponibilidade limitada de drogas antifúngicas eficazes, representam uma ameaça crescente para a saúde humana, podendo resultar em alta mortalidade atribuível (DAI et al., 2012). A infecção fúngica oportunista mais prevalente em pacientes HIV positivos é a candidíase, tanto na forma mucocutânea, quanto na forma invasiva. Várias espécies de Candida podem causar candidíase, embora a Candida albicans continue sendo a espécie mais comum responsável pela doença. Por esta razão, os crescentes casos de resistência à terapêutica antifúngica atual é um motivo de preocupação (LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005; ANWAR; MALIK; SUBHAN, 2012), pois ocorre a diminuição da eficiência das terapias convencionais, que na maioria das vezes são tratamentos demorados, os quais exigem maiores orçamentos e cuidados de saúde (CHIEN et al., 2013). Além disso, as drogas atuais apresentam toxicidade, espectro de ação limitado e as interações medicamentosas são comuns (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Infecções causadas por Candida albicans, como por outros fungos, continuam a representar um problema significativo de saúde pública, principalmente as espécies resistentes a drogas tradicionais, tais como os azóis e polienos (fluconazol e anfotericina B, respectivamente) (LAM et al., 2011). Por isso, é necessário o desenvolvimento de pesquisas científicas que busquem ampliar as formas de tratamento das lesões de Candida albicans, possibilitando um tratamento efetivo dos casos de insucesso e melhorando o bem estar dos pacientes acometidos por esta doença. Diante das limitações das terapias convencionais para o tratamento de infecções cutâneas superficiais causadas por Candida albicans (LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005), tratamentos alternativos devem ser estimulados (CADASTRO et al., 2008; SILVA MARTINS et al., 2011; CHIEN et al., 2013). A inativação antimicrobiana pela terapia fotodinâmica (PDT) pode ser uma alternativa

19 18 agente eficaz para eliminar estes microrganismos (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). A PDT, também conhecida como terapia de fotoirradiação, fototerapia, fotoquimioterapia (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007) e terapia fotodinâmica antimicrobiana (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010), é um tratamento à base de luz desenvolvido para várias aplicações na área da oncologia, dermatologia, oftalmologia. Recentemente, seus efeitos antimicrobianos têm sido testados (KATO et al., 2013). Consiste na administração de um fármaco não tóxico ou de um corante, conhecido como agente fotossensibilizante (FS), que pode ser aplicado sistemicamente, localmente ou por via tópica, seguida de iluminação da lesão, com luz visível (geralmente com longo comprimento de onda de luz vermelha) a qual, na presença de oxigênio, leva à formação de moléculas citotóxicas, tais como o oxigênio singleto e de radicais livres (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; KONOPKA; GOSLINSKI, 2007; DAI et al., 2011; HUANG et al., 2012; PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Estes estados moleculares são muito reativos e podem causar danos a lipídios, proteínas, ácidos nucleicos e outros componentes celulares (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007), o que desencadeia o fotoenvelhecimento oxidativo e subsequente morte celular dentro da célula ou microrganismo (CALZAVARA-PINTON; VENTURINI; SALA, 2005). Apesar de ainda não existir um protocolo definido, vários estudos têm relatado que a PDT pode ser uma alternativa eficaz na eliminação de vírus e protozoários, assim como bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e fungos (DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008; LYON et al., 2011). A PDT antifúngica tem sido empregado com sucesso contra Candida albicans, outras espécies de Candida e também contra dermatófitos (LYON et al., 2011). Segundo Jackson et al. (1999), o efeito antimicrobiano da PDT pode ser uma alternativa viável para substituir os antifúngicos tradicionais no tratamento da candidíase bucal. No tratamento de candidíase, a PDT utilizando azul de metileno (AM) como FS, apresenta algumas vantagens em relação à terapia medicamentosa tradicional, tais como: os mecanismos de ação são diferentes das drogas antifúngicas, o que atenua os casos de desenvolvimento de resistência ao medicamento; pode ser uma alternativa terapêutica eficaz contra cepas já resistente de Candida albicans

20 19 (TEICHERT et al., 2002) e o custo, pois diferentemente da terapia antifúngica convencional, que muitas vezes é um tratamento oneroso. O AM é uma substância simples que apresenta baixo custo, baixa toxicidade, comercialmente acessível e que já é utilizada, com segurança, na medicina há bastante tempo (TEICHERT et al., 2002). A PDT tem o potencial para se estabelecer como uma abordagem antimicrobiana alternativa para infecções orais e merece uma avaliação mais aprofundada (KOMERIK; MACROBERT, 2006). O AM, combinados com a luz de um comprimento de onda específico, pode ser usado como um agente antifúngico promissor (MUNIN et al., 2007). O grande interesse em terapias alternativas para o tratamento de infecções fúngicas vem do fato de que o número de agentes antifúngicos disponíveis no mercado é muito restrito quando comparado com o número de drogas antibacterianas (LYON et al., 2011). Os estudos já mostram que o AM é um fotossensibilizador eficaz na inativação fotodinâmica de Candida albicans. No entanto, alguns aspectos ainda precisam ser mais bem esclarecidos, antes de recomendá-lo para terapia clínica, tais como o protocolo adequado quanto ao tempo de pré-irradiação ou de incubação, como também a concentração de AM que apresente o melhor custo-benefício com relação à inativação de Candida albicans, sem apresentar efeito tóxico para as células. Desta forma, este estudo terá como objetivo avaliar, in vitro, os efeitos da terapia fotodinâmica em Candida albicans, variando o tempo de pré-irradiação e a concentração de azul metileno.

21 20 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (PDT) As propriedades curativas da luz têm sido apreciadas por milhares de anos. No entanto, segundo Allison; Mota e Sibata (2004), o aproveitamento da energia da luz para criar uma forma rigorosa e confiável para diagnosticar e tratar as doenças humanas é apenas um fenômeno relativamente recente. Apesar de excelentes resultados relatados na história antiga e do refinamento deste conhecimento ao longo dos últimos 100 anos subsequentes, o futuro do foto-diagnóstico e da terapia fotodinâmica está entregue ao acaso. A aplicação da luz com função antimicrobiana foi descoberta há mais de 100 anos devido à capacidade de alguns corantes eliminarem vários microrganismos quando ativados pela luz na presença de oxigênio. No entanto, apenas no passado relativamente recentemente, a PDT tem sido estudada com a finalidade de tratar diversas infecções. Este interesse crescente, em parte, é motivado pelo aumento exagerado de resistência a drogas antimicrobianas entre as bactérias e outros patógenos (KHARKWAL et al., 2011). A sua aplicação no campo das doenças infecciosas sofreu um grande revés com a descoberta dos antibióticos na década de Esta descoberta revolucionou o tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias patogênicas e, no devido curso, surgiram e tornaram-se disponíveis os antifúngicos, antiprotozoários, anti-helmíntico e os compostos antimalária. Assim, apesar de 100 anos de descobrimento, o avanço da PDT antimicrobiana tem sido bastante lenta. Mas com o recente aumento da resistência aos antibióticos em todo o mundo, tem havido um interesse renovado por terapias antimicrobianas alternativas (KHARKWAL et al., 2011). O tratamento antimicrobiano por meio de luz e corante foi descrito pela primeira vez, em 1890, por Oscar Raab quando observou a toxicidade do alaranjado de acridina, que é dependente de luz, contra Paramecium caudatum (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010). No entanto, apenas recentemente, com o início da busca

22 21 por tratamentos alternativos contra agentes patogênicos resistentes aos antibióticos, a PDT tem sido investigada mais profundamente (DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008). Na Odontologia, o LASER (Light Amplification by Stimulated of Radiation ou amplificação da luz por emissão estimulada de radiação) tem sido empregado em diversas situações clínicas, como em antissepsia de feridas, em preparos cavitários, na redução de populações bacterianas de canais radiculares e em bolsas periodontais (CADASTRO et al., 2008). No contexto das aplicações clínicas da PDT no combate as infecções, Kharkwal et al. (2011) realizaram uma busca na literatura dos artigos publicados sobre este tema, compreendendo o período entre os anos de 1960 e Ao finalizar a leitura de todas as fontes de informação científica, Kharkwal et al. observaram que, no campo do controle e tratamento de infeções, a PDT tem uma vasta aplicação clínica. Entre as indicações podem ser citadas as aplicações clínicas com do seu efeito antimicrobiano para infecções virais localizadas, tais como: as provocadas pelo herpes simples e papiloma vírus, e infecções dermatológicas não virais, como as causadas por acne e outras leveduras, fungos e infecções bacterianas da pele. A PDT também tem sido utilizada para o tratamento de infecções bacterianas em abscessos cerebrais e ulceras que não cicatrizam, para o tratamento da leishmaniose cutânea e infecções gástricas causadas por Helicobacter pylori. Na Odontologia, tem estudada como coadjuvante no tratamento de várias infecções dentárias, incluindo a periodontite e infecções endodônticas. Com estes disponíveis na literatura, é possível avaliar a terapia fotodinâmica como uma aliada promissora no tratamento infecções nas áreas odontológicas e médicas, apesar da maioria dos estudos mostrarem resultados promissores in vitro e de ainda existir uma carência de protocolos e estudos clínicos controlados. Carvalho et al. (2006) avaliaram, in vitro, o efeito antibacteriano do laser diodo com comprimento de onda de 650 nm, associado à substância fotossensível azul de toluidina sobre as bactérias de úlceras cutâneas infectadas. Foram coletadas amostras de material infectado de úlceras cutâneas através de um swab. Os materiais foram inoculados em meio de cultura contendo ágar sangue para o crescimento de bactérias gram-positivas e ágar Mac Conkey para as gramnegativas. Os autores observaram que houve uma redução significativa das unidades formadoras de colônias quando submetidas à terapia fotodinâmica.

23 22 Com o objetivo de encontrar uma fonte de luz alternativa, utilizada na clínica diária, que pudesse ser usada na terapia fotodinâmica contra a microbiota bucal, Krespi et al. em 2005, avaliaram a fotossensibilização de Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia utilizando luz halógena, transmitida através de um guia de luz flexível sobre placas de Petri contendo bactérias vivas. Os autores utilizaram a idéia de que a densidade de energia produzida por uma lâmpada halógena de alta intensidade poderia ser suficiente para ativar certos corantes e causar efeito bactericida sem produzir danos graves a bactérias comensais ou ao revestimento mucosa oral, diminuindo os potenciais perigos relacionados ao laser, como danos aos olhos. O tempo de irradiação, a que os microrganismos foram expostos foram 5, 10 e 20 min. O AM nas concentrações de 0,1, 0,075, 0,05, 0,025 e 0,01% foi utilizado como um agente de fotossensibilização. Os controles foram formados por microrganismos apenas irradiados com luz halógena e apenas pela aplicação de AM. A fotossensibilização letal de 50% das bactérias foi conseguida, utilizando no protocolo de 5 min de irradiação nas concentrações superiores a 0,05% de AM. As concentrações de 0,025% e 0,01% somente foram efetivas no tempo de irradiação de 20 min. A exposição à luz, na ausência de AM, não foi eficaz para matar as bactérias. Na ausência de luz, o AM, nas concentrações de 0,025, 0,001% e 0,05% não foi eficaz. No entanto, as concentrações de 0,075 e 0,1% de AM, mesmo na ausência de luz, apresentou poder bactericida. A PDT também tem sido utilizada para tratar a periodontite, como uma das alternativas para eliminar espécies bacterianas subgengivais resistentes à terapia antimicrobiana convencional. A capacidade da PDT de reduzir o número de bactérias no biofilme e na forma planctônica foi testada por Fontana et al. (2009). Coletaram amostras de biofilme dental de dez indivíduos com periodontite crônica com curetas Gracey. Em seguida, suspensões (10 9 células/ml) de microrganismos do biofilme de cinco sujeitos foram sensibilizadas com azul de metileno (25 µg/ml) durante 5 min, em seguida, expostos a luz vermelha de laser de argônio, com densidade de potência de 100 mw/cm 2 e fluência de energia de 30J/cm 2. Em seguida, cada amostra (indivíduos 1-5) foi dividida em duas partes. A primeira parte, em suspensão, foi exposta a PDT e a segunda parte foi utilizada para o desenvolvimento de biofilme e, em seguida, também exposta a PDT com AM na concentração de 25 µg/ml. A PDT eliminou aproximadamente 63% das bactérias

24 23 presentes na suspensão. Entretanto, nos biofilmes, a PDT foi menos eficiente, com uma de inibição de apenas 32% das bactérias no biofilme. As bactérias presentes nos biofilmes orais foram menos susceptíveis PDT quando comparadas de bactérias na forma planctônica. O efeito da PDT sobre bactérias da placa dentária humana foi avaliado por Klepac-Ceraj et al. (2011). O FS, AM-carregado poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) foi ativado com luz visível vermelha (λ=665 nm). Amostras de placa subgengival de 14 indivíduos com, periodontite crônica, foram coletadas dos sítios mesiovestibulares de pré-molares ou molares com curetas de Gracey e imediatamente colocadas em uma solução anaeróbica de Ringer (Sistemas anaeróbios, Morgan Hill, CA, EUA). As suspensões bacterianas (10 9 células/ml) foram sensibilizados com aniônico, as nanopartículas de PLGA catiônicos (50 µg/ml de equivalentes de AM) ou AM livre (50 µg/ml) durante 20 min, seguido por exposição à luz vermelha durante 5 minutos com uma densidade de potência de 100 mw/cm 2 e fluência de energia de 30 J/cm 2. Biofilmes orais polimicrobianos, que foram desenvolvidos em ágar sangue, em placas com 96 poços, a partir de inóculo de placa dental obtida a partir de sete pacientes. E, em seguida, também foram expostas a PDT como citado acima. Seguindo o tratamento, a sobrevivência das bactérias foi calculada por meio da contagem do número de unidades formadoras de colónias (UFC/mL). O AM-carregados com nanopartículas catiônicas apresentou maior fototoxicidade bacteriana, tanto na forma planctônica e como na forma de biofilme, quando comparada com AM-nanopartículas carregadas aniônicos e livre AM, embora os resultados não tenham sido significante (p> 0,05). Como a cavidade bucal é particularmente acessível e adequada à iluminação, a PDT também tem representado uma nova abordagem terapêutica no controle de biofilmes orais. Nesta linha de pesquisa, os estudos estão voltados para desenvolvimento ou descoberta de fotossensibilizantes mais seletivos (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007). A utilização de FS e doses de luz adequadas podem erradicar a praticamente todos os microrganismos na região. No entanto, na cavidade oral, onde existe um equilíbrio com microflora nativa, isto é um problema em potencial, pois pode conduzir à proliferação de organismos oportunistas. Este inconveniente pode ser superado utilizando um FS ligado a um anticorpo que reconhece apenas os organismos alvo (KOMERIK; MACROBERT, 2006). Com o desenvolvimento de

25 24 novos FSs mais seletivos e da fibra óptica, para melhorar o acesso da entrega de energia de excitação, o tratamento de infecções causadas por fungos, por meio da terapia fotodinâmica, pode tornar-se uma nova abordagem terapêutica (BLISS et al., 2004). 2.2 Papel dos agentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica Os fotossensibilizadores (FS) são geralmente compostos macrocíclicos que exibem nenhuma ou mínima toxicidade inerente, mas resultam na geração de moléculas reativas de oxigénio citotóxico quando ocorre excitação com luz de comprimento de onda adequado (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Para se fazer uma escolha racional entre os milhares de FSs e fontes de luz disponíveis, é necessário entender um pouco dos aspectos mecânicos de como o FS se comporta com a iluminação e o que acontece quando é colocado em contato com células de mamíferos em cultura de tecidos. A forma exata como a PDT influencia nas vias celulares, é fortemente regulada pela localização do FS na célula, que depende de sua natureza química, tais como: peso molecular, lipofilicidade, anfifilicidade, carga iônica e características de ligação às proteínas; a concentração de FS, o tempo de incubação, a concentração de soro e o fenótipo da célula alvo (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004). Através da Microscopia confocal, Lam et al. (2011) observou que os FSs podem localizar-se nas mitocôndrias, bem como de outras membranas intracelulares. Quando estes FSs são irradiados com luz ultravioleta ou visível em determinados comprimentos de onda, absorvem energia e passam a um estado excitado singleto ( 1 S * ). Este estado 1 S * pode decair para o estado fundamental ( 0 S) com emissão de fluorescência, ou cruzar para um estado tripleto excitado ( 3 S * ) por inversão espontânea do spin do elétron excitado. Uma vez formado, esta espécie de 3 S * pode participar em várias reações: pode decair ao estado 0 S com emissão de fosforescência, ou reagir por mecanismos fotoquímicos do tipo I ou II. Na reação do tipo I, o 3 S * pode reagir com um substrato orgânico ou uma segunda molécula fotossensibilizadora, por transferência de elétrons ou hidrogênio. No tipo II, o fotossensibilizador 3 S * pode transferir energia para o oxigênio molecular, gerando 0 S e 1 O 2. Estes processos podem ocorrer simultaneamente e a importância de cada um

26 25 depende da molécula alvo, da eficiência da transferência de energia do sensibilizador para o O 2, do solvente e da concentração de O 2 (RONSEIN et al., 2006; DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008; LYON et al., 2011). Este mecanismo está ilustrado no esquema abaixo (figura 1) adaptado de Pereira Gonzales; Maisch et al. (2012). Figura 1 - Ilustração esquemática do mecanismo de ação da PDT Fonte: Pereira Gonzales; Maisch et al. (2012) Geração de moléculas reativas de oxigênio (ROS) pode seguir dois caminhos alternativos após ativação da luz por um dado Fotossensibilizador (FS). Após a absorção de um fóton, o FS sai do estado fundamental e um estado animado do FS é formado. O estado animado é de curta duração e pode ser submetido a cruzamento intersistema para o estado tripleto de vida longa, ou, alternativamente, pode voltar ao o estado fundamental por emissão de fluorescência ou de calor, ou ambos. Geralmente, o estado tripleto atua como um mediador das reações tipo I e

27 26 Tipo II no processo de fotossensibilização. Tipo I: Geração de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), radical hidroxila (HO - ) e ânion superóxido (O - 2 ) pela transferência de carga do FS no estado animado. Tipo II: O estado tripleto do FS pode sofrer diretamente a troca de energia com o oxigénio no estado fundamental, conduzindo à formação de oxigénio singleto, 1 O 2. O ROS gerado reage rapidamente com o seu ambiente dependendo da localização do FS: paredes de microrganismos, membranas lipídicas, peptídios, e ácidos nucléicos. O oxigênio molecular, no estado fundamental, possui dois elétrons com spins paralelos ocupando dois orbitais p de mesma energia, chamados de degenerados, caracterizando, portanto, um estado tripleto ( 3 - g ). Consequentemente, a redução direta do oxigênio por dois elétrons é proibida pela regra de conservação do spin. Uma forma mais reativa de oxigênio, conhecida como oxigênio singleto, pode ser gerada por um acréscimo de energia. Nela, a restrição da regra de conservação do spin é removida. Sendo assim, o oxigênio singleto é muito mais oxidante que o oxigênio molecular no seu estado fundamental. Existem dois estados singleto do oxigênio: o primeiro estado excitado, 1 g, tem dois elétrons com spins opostos no mesmo orbital, possui uma energia de 22,5 kcal acima do estado fundamental e tempo de meia vida em solvente aquoso de aproximadamente 10-6 s; o segundo estado excitado, 1 - g, tem um elétron em cada orbital degenerado, com spins opostos, e possui uma energia de 37,5 kcal acima do estado fundamental. O estado 1 - g tem um tempo de vida muito curto (10-11 s) em meio aquoso, sendo rapidamente desativado para o estado 1 g. Portanto, apenas o primeiro estado apresenta interesse em sistemas biológicos e será denotado por 1 O 2 (RONSEIN et al., 2006). Os FS têm estruturas moleculares que são tipificadas por ligações duplas conjugadas que contêm um sistema deslocalizado de π-elétrons. No estado neutro (singleto), estes elétrons são emparelhados em orbitais de spin de baixa energia. Após a aplicação da luz correspondente ao pico de absorção do FS, o elétron que ocupa o orbital molecular de maior energia do FS fica animado e salta para o orbital molecular desocupado, excitando o FS a um estado singleto animado, instável e de vida curta. O mais importante para o processo da PDT é a inversão do spin do elétron animado, conhecido como cruzamento intersistema para originar o estado tripleto do FS. Este estado tripleto é menos enérgico do que o estado

28 27 singleto animado, mas tem uma vida útil muito mais longa (microssegundos). O elétron animado, agora com um spin paralelo, ao contrário da sua antiga forma (elétron emparelhado), pode não reverter imediatamente para um nível mais baixo de energia, de acordo com o Princípio de Exclusão de Pauli. Assim, o elétron animado no estado tripleto do FS pode mudar sua orientação de spin (um processo relativamente lento) e emitir sua energia como fosforescência, ou, alternativamente, o FS pode interagir imediatamente com moléculas em seu ambiente, tais como o oxigênio molecular (DAI et al., 2012). O efeito fotodinâmico da substância fotossensível específica é atribuído à sua capacidade de penetrar nos microrganismos susceptíveis, para absorver a luz de determinado comprimento de onda, e para gerar produtos reativos de oxigénio citotóxico (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010). Os FS absorvem energia diretamente de uma fonte de luz e pode, em seguida, transferir esta energia para a molécula de oxigênio para criar uma forma ativada de oxigênio, chamado de oxigênio singleto ( 1 O 2 ). O 1 O 2 é extremamente electrófilo e pode oxidar diretamente ligações saturadas nas moléculas e macromoléculas biológicas, sendo o principal agente citotóxico relacionado com a PDT (OCHSNER, 1997). O FS, por si só, não tem ou apresenta um insignificante efeito antimicrobiano. No entanto, após a irradiação com luz visível de comprimento de onda apropriado, a substância em estado de repouso inicial torna-se instável. Durante este processo, fótons (energia) são absorvidos pelo FS. Produtos citotóxicos altamente reativos podem ser produzidos quanto houver a presença de oxigênio. O resultado da reação do FS com o oxigênio molecular é a produção de radicais Hidroxila (OH - ) e superóxidos, radicais de oxigênio ou oxigênio singleto ( 1 O 2 ). O oxigênio molecular no estado primário contém 6 elétrons na última camada de energia, sendo dois desemparelhado. A transferência de energia pelo FS promove a inversão do spin de um dos elétrons da molécula de oxigênio transformando-a do estado tripleto para singleto. O oxigénio Singleto tem um período de meia vida muito curto (nanosegundos) e sua difusão limita-se a uma distância de até 100 nm. Por isso, sua atividade citotóxica é confinada somente ao local onde é produzido. Em consequência disto, para que fotoativação tenha sucesso, é necessário um período de pré-irradiação, após a aplicação, para que o FS possa acumular-se na célula-alvo (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010).

29 28 Em laboratório, o 1 O 2 é frequentemente gerado por reações de fotossensibilização. Nestas reações, são utilizadas moléculas conhecidas como Fotossensibilizadores (FSs), tais como: derivados de fenotiazinas (azul de toluidina e azul de metileno); porfirinas (hematoporfírina, ácido delta-aminolevulínica), xantinas (rosa bengala), clorinas (de clorina (e6)), derivados de clorina (e6) (como poli-l-lisina e polietilenoimina); ftalocianinas (disulphonated ftalocianina de alumínio, ftalocianinas catiónicas de zinco, disulphonated ftalocianina de zinco) (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010). O tetrapirrol, como porfirina, clorinas e bacterioclorinas, é uma classe de FS que apresenta características promissoras para ser utilizado na terapia fotodinâmica antimicrobiana (HUANG et al., 2010). Para que a PDT seja realizada com sucesso, in vivo, é necessário assegurar que uma quantidade suficiente de luz atinja todo o tecido doente. Isto envolve a compreensão de como a luz se propaga dentro dos tecidos e dos efeitos relativos absorção e dispersão da luz. O fato de a maioria dos FSs serem tanto fluorescente, quanto fotoquimicamente ativo, permite que várias estratégias e protocolos possam ser combinados na terapia fotodinâmica. O fator mais importante que regula os resultados da PDT é forma como o FS interage com as células no tecido ou lesão alvo, e o aspecto chave desta interação está relacionado à localização intracelular do FS. Existem exemplos de FSs que se localizam nas mitocôndrias, lisossomos, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e membranas plasmáticas (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004). Para a que as substâncias fotossensíveis possam ser ativadas é necessário que sejam expostas a luz visível com um determinado comprimento de onda. A maioria destas substâncias é ativada pela luz entre nm. Isto corresponde ao feixe de luz que penetra no tecido em até 0,5-1,5 cm, e, ao mesmo tempo, representa o limite para efeito terapêutico da PDT (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010). Um estudo, realizado por Huang et al. (2012), examinou as contribuições do oxigênio singleto ( 1 O 2 ), obtido pelo mecanismo tipo II e radicais de hidroxila (HO - ), pelo mecanismo tipo I, no efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica em bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis), e as bactérias gram-negativas (Escherichia coli, Proteus mirabilis, e Pseudomonas aeruginosa).

30 29 Utilizaram como FSs duas substâncias: Tris-catiónico-buckminsterfulereno (BB6) e o conjugado de clorina e polietilenimina (E6) (PEI-CE6). O conjugado PEI-CE6 produziu principalmente oxigênio singleto, enquanto que o BBB6 produziu principalmente radicais de Hidroxila (OH - ). Com relação a sensibilidade das bactérias, as Gram-negativas foram mais susceptíveis aos radicais de HO -, e as bactérias Gram-positivas foram mais susceptíveis ao oxigênio singleto ( 1 O 2 ). Vários estudos mostraram a utilização de FSs e luz visível para destruir fungos. No entanto, as propriedades físico-químicas necessárias para tornar mais efetiva à terapia fotodinâmica têm sido pouco estudadas (DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008). Segundo Castano; Demidova; Hamblin, (2004), as características ideais dos FSs são: Devem ter baixos níveis de toxicidade para os seres humanos e animais experimentais no escuro e baixa incidência de toxicidade de funcionamento durante a irradiação; Devem absorver a luz em comprimentos de onda no vermelho ou entre a luz vermelha e infra-vermelha, que tem a finalidade de penetrar nos tecidos; Eles devem ter faixas de absorção relativamente elevadas (> M -1 cm- 1 ) para minimizar a dose do FS necessária para alcançar o efeito desejado. A síntese do FS deve ser relativamente fácil e a matéria-prima disponível para sua produção deve ser viável em larga escala. Devem ser um composto puro com uma composição constante, prazo de validade estável e ser solúvel em água ou em uma mistura de solventes aquosos inofensivos. Não devem agregar indevidamente em ambientes biológicos, pois isso reduz sua eficiência fotoquímica. A eliminação farmacocinética do paciente deve ser rápida, ou seja, deve ser menor que um dia para que não seja necessária a proteção pós-tratamento à exposição prolongada da luz com a pele. Deve apresentar um intervalo de tempo curto entre a aplicação e a eliminação para facilitar o tratamento ambulatorial que é mais agradável para o paciente e de baixo custo. Não trazer dor ao paciente, já que a terapia fotodinâmica, normalmente, não requer anestesia ou sedação profunda.

31 30 Em uma revisão da literatura, que revisou os artigos publicados durante 51 anos ( ), sobre as aplicações clínicas da PDT no combate as infecções, Kharkwal et al. (2011) verificaram que vários corantes mostraram-se ser muito eficazes in vitro e in vivo em modelos de infecção em animais, mas a maioria destes FSs ainda está sendo testada em ensaios clínicos. Os FS que têm sido utilizados em estudos clínicos são restritos, entre eles podem ser citados os corantes Phenothiazinium (azul de metileno, azul de toluidina, e PP904 phenothiazinium); as porfirinas, incluindo ALA-PPIX e derivados de hematoporfirina; vermelho neutro e polyethylenimine clorina conjugado (e6). Os resultados preliminares dos estudos demonstram que os dermatófitos e leveduras podem ser eficazmente sensibilizados in vitro e in vivo através da administração de FSs, pertencentes a quatro grupos químicos: corantes de fenotiazina, porfirinas e ftalocianinas, bem como de ácido aminolevulínico, que, embora não seja por si só um FS, é metabolizado de forma eficaz em protoporfirina IX (CALZAVARA-PINTON, P. et al., 2012) As ftalocianinas são compostos heterocíclicos de um núcleo de tetrapyrrole ligados por pontes de nitrogênio. Alguns de seus derivados são usados como corantes para impressoras (cor azul), tintas ou plásticos. São capazes de permanecer no estado animado por um período mais longo em comparação com azul de metileno ou azul de toluidina. Além disso, são mais resistentes à degradação química ou fotoquímica. Absorvem a luz a um comprimento de onda entre nm, que beira a extremidade do espectro infravermelho. As ftalocianinas já foram estudadas para promover descontaminação sanguínea e para a terapia fotodinâmica de cânceres (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010). Para que uma molécula possa atuar como um eficiente FS, deve possuir a capacidade de absorver a luz visível, passando para um estado excitado e transferindo esta energia para o oxigênio molecular. Moléculas que possuem tais características são tipicamente estruturas planares rígidas possuindo um alto grau de conjugação. Os FSs mais empregados na PDT incluem as phenothiazinium, porphyrin e phthalocyanine que apresentam estruturas planas, simples e tricíclicas, tipicamente de natureza catiônica. Os compostos mais amplamente usados são o azul de metileno (AM) e azul de toluidina (TBO). Ambos são eficientes na produção

32 31 de oxigênio singleto e apresentam absorção máxima de luz com comprimento de onda de 656 nm, para AM, e 625, para TBO (DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008). Desde que foi sintetizado pela primeira vez em 1876, AM tem sido utilizado em diferentes áreas da Medicina clínica, que vão desde a quimioterapia do cancro à desinfecção do sangue. Além disso, o AM formou a base da quimioterapia antimicrobiana, em particular na zona dos antimaláricos. Mais recentemente, o potencial efeito fotossensibilizante do AM e de seus congêneres foi reconhecido, fazendo com que fossem aplicados em associação com a luz com intuito de produzir efeito antimicrobiano, especialmente na desinfecção do sangue. A vasta utilização do AM, como agente FS, está relacionada à combinação da sua estrutura química simples com facilidade de produzir reações de oxidação-redução in situ (WAINWRIGHT; CROSSLEY, 2002). O AM tem sido amplamente utilizado desde o final do século XIX em investigações biomédicas. Foi o composto utilizado em várias áreas clínicas importantes, incluindo o tratamento da malária e esquizofrenia. A PDT do cancro e, mais recentemente, de infecções microbianas (quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana) também tem utilizado o AM e os seus congêneres, entre outros tipos de produtos químicos, devido à baixa toxicidade humana e as propriedades fotoativas deste grupo (WAINWRIGHT, 2005). O AM tem uma forte absorção da luz em comprimentos de onda maiores do que 620 nm, em que a penetração de luz no tecido é a ideal. Características como baixa toxicidade, forte potencial antimicrobiano fotoativo e utilização e aceitação no campo da Medicina, faz do AM um FS ideal para ser utilizado na terapia fotodinâmica contra fungos (TEICHERT et al., 2002). O AM é uma molécula, de baixa toxicidade e efeitos colaterais reduzidos, que tem sido utilizada com diferentes finalidades na microbiologia e farmacologia há bastante tempo. Entre suas indicações tradicionais, pode-se utilizar para corar organismos vivos e para tratar a Metemoglobinemia, doença caracterizada pela quantidade anormal no sangue de metemoglobina, que é a forma oxidada da hemoglobina.ultimamente, tem sido utilizada na PDT como droga fotossensibilizante

33 32 em associação com uma fonte de luz contínua. Suas principais indicações incluem o tratamento de carcinoma de células basais, sarcoma de Kaposi, melanoma, infecções virais e fúngicas. Tem características interessantes que conferem a esta molécula um grande potencial de aplicação em PDT. Ele absorve luz intensa na janela terapêutica e desencadeia os mecanismos tipo I e tipo II, que danifica biomoléculas e induz a morte em vários locais nas células alvo, tecidos e organismos. Portanto, como a irradiação, pode ser utilizado para tratar uma variedade de doenças cancerosas e não cancerosas (TARDIVO at al., 2005). Zeina et al. (2003) avaliaram a genotoxicidade imediata e tardia da PDT utilizando uma combinação de luz visível (42 mw/cm 2 ) e AM (100 µg/ml). Para testar os efeitos tóxicos da terapia foi utilizada uma linhagem celular de queratinócitos humano (H103) por meio do ensaio cometa. Os resultados desta pesquisa mostraram que espécies microbianas associadas à pele foram susceptíveis a PDT, utilizando luz visível e AM, sem apresentar efeitos genotóxicos detectáveis imediatos ou tardios sobre queratinócitos. Os autores ainda concluíram que a PDT aplicada in vivo pode representar uma alternativa de baixo risco e ser útil para o tratamento antimicrobiano convencional na dermatologia. Em 2005, Lambrechts et al. avaliaram a citotoxicidade, in vitro, da PDT a fibroblastos da derme humana utilizando porfirina, como FS. Estas células foram submetidas a um protocolo de terapia fotodinâmica conhecido por ser efetivo para a inativação de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, e Cândida albicans. A viabilidade celular subsequente à exposição ao FS foi avaliada após 0 h, 6h, 18h e comparada com os valores do pré-tratamento. Os autores concluíram que a terapia fotodinâmica, utilizando a porfirina, deve ser realizada com uma dosagem que não cause efeitos citotóxicos nas células dérmicas. Para que a PDT possa ser eficaz contra fungos, o FS deve ser capaz de atravessar através da parede da célular e chegar às organelas citoplasmáticas. Vários fármacos FSs, incluindo o Photofrin, TMP-1363, porfirina catiónico 5-fenil-10,15,20-tris (N-metil-4-piridil) porfirina cloreto (ida [4]) e clorina e6, têm afinidade a diferentes estruturas celulares, tais como a membrana do plasma ou mitocôndrias (LAM, M et al., 2011).

34 33 Fotossensibilizadores fenotiazínicos (azul de metileno e azul de toluidina) e verde de malaquita foram utilizados por Vilela et al. (2012) para avaliar a ação da PDT contra biofilmes de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os biofilmes foram cultivados em peças de amostra de resina acrílica e submetidos à terapia fotodinâmica, usando um laser índio-gálio-alumínio-fosforado (InGaAlP) (660 nm,100 mw; 18,8 J; 20 J/cm 2 e 105 mw/cm 2 ) e as concentrações dos FSs variando 37,5 a µm, que permaneceram no escuro por 5 min antes da iluminação. Após a terapia fotodinâmica, as células dos biofilmes foram dispersos num homogeneizador e cultivadas em caldo Brain Heart Infusion para quantificação de unidades formadoras de colónias. Para cada microrganismo testado, existiram dois grupos controles: exposto à radiação laser sem o FS (L+FS-) e o outro tratado com o FS, sem exposição à luz laser vermelha (L-FS+). Os melhores resultados da PDT contra biofilmes de S. aureus e E. coli foram obtidos com a concentrações de 300 µm do AM, com reduções microbianas de 0,8-1,0 log 10 ; 150 µm de azul toluidina, com reduções microbianas de 0,9-1,0 log 10, e 3000 µm de verde malaquita, com reduções microbianas de 1,6-4,0 log 10. Com os resultados, foi possível observar que a maior redução microbiana foi alcançada com o FS verde malaquita quando utilizados em concentrações mais elevadas do que as utilizadas para os corantes fenotiazínicos. A eficácia da seletividade do FS para os microrganismos, mas não para os tecidos, também é uma preocupação importante para evitar efeitos tóxicos e danos aos tecidos do hosédeiro na área da infecção. Com relação aos FSs, existem vários fatores que ainda precisam ser bem definidos, incluindo as propriedades físicoquímicas do FS, a dose de aplicação, a taxa de absorção da droga, a sua estabilidade e facilidade de aplicação e remoção após o uso. O efeito da PDT sobre o sistema imune do hospedeiro é caminho que requer muitas investigações científicas e pode ser um elo de ligação para o tratamento de infecções sistêmica com esta modalidade de tratamento. Outro aspecto importante que necessita ser estudado é a capacidade da PDT em destruir fatores de virulência segregados, como lipopolissacáridos e outras proteínas que podem ser altamente vulneráveis a oxidação por radicais reativos de oxigênio gerados durante a PDT (KHARKWAL et al., 2011).

35 Etiologia e patogenia da Candidíase A PDT antifúngica é uma área de crescente interesse. As pesquisas avançam no sentido de identificar os mecanismos fotoquímicos e fotofísicos envolvidos na fotoinativação; de desenvolver fotossensibilizantes potentes e clinicamente compatíveis; de entender como fotoinativação é afetada por elementoschaves microbianos como fenotípicos resistentes, sistemas de efluxo multidroga, formação de biofilmes, virulência e determinantes patogênicos; de explorar novas plataformas de distribuição de FS e de identificar aplicações da fotoinativação além do ambiente clínico, tais como desinfetantes ambientais (DAI et al., 2012; VERA et al., 2012). Em muitos casos, os resultados são promissores, mas ainda preliminares, necessitando de uma investigação mais aprofundada (VERA et al., 2012). Candida albicans é o principal tipo de fungo capaz de causar infecções superficiais da pele e mucosas, bem como infecções profundas, especialmente em pacientes imunocomprometidos (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). A baixa contagem de linfócitos T CD 4 + (menor que 200 células/ml) tem sido tradicionalmente citada como o maior fator de risco para o desenvolvimento de candidíase orofaríngea. O surgimento gradativo de outras espécies, além da Candida albicans, causa preocupação, principalmente aquelas resistentes a azólicos e outros agentes antifúngicos (ANWAR; MALIK; SUBHAN, 2012). A candidíase, cuja etiologia está relacionada a Candida ssp., que colonizam geralmente as superfícies epiteliais corpo, é muito mais prevalente em indivíduos imunocomprometidos, como portadores de câncer, HIV/AIDS, diabetes, lactentes prematuros e pacientes de internados em UTI, em comparação com os pacientes saudáveis (CHABRIER-ROSELLÓ et al., 2010). Embora a PDT tenha sido desenvolvida principalmente para combater as lesões cancerosas, esta terapia pode ser empregada para o tratamento de várias condições, incluindo doenças infecciosas. Um grande número de microrganismos, incluindo bactérias Grampositivas e Gram-negativas, vírus, protozoários e fungos, apresenta susceptibilidade à terapia fotodinâmica antimicrobiana, fazendo desta modalidade de tratamento uma alternativa para o tratamento de infecções fúngicas (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010).

36 35 A incidência de micoses invasivas tem aumentado significativamente ao longo das últimas 3 décadas e agora representa uma ameaça em crescimento exponencial para a saúde humana devido a uma combinação de difícil diagnóstico e uma escassez de drogas antifúngicas eficazes. Assim, infecções fúngicas sistêmicas resultam em alta mortalidade. Candida albicans é a espécie de levedura patogênica mais comum, representando cerca de 60% de todas as leveduras isoladas em amostras clínicas (PRATES et al., 2011). Como exemplo dessa escassez de drogas antifúngicas pode-se citar o caso da anfotericina B. Esta droga, que foi descoberta em 1950, ainda tem sido o medicamento de escolha para pacientes imunocomprometidos afetados por infecções fúngicas. O fluconazol, introduzida em 1988, tem sido amplamente utilizado para o tratamento de infeções causadas por leveduras; no entanto, a resistência a este fármaco pode limitar o seu uso no futuro (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Em 2012, Anwar; malik; subhan realizaram estudo prospectivo durante um período de 2 anos ( ) para verificar a presença de infecção por cândida em pacientes acometidos por AIDS. Após os exames clínicos completos, foram coletadas amostras para verificar a presença de Candida. As espécies foram isoladas e testes de sensibilidade antifúngica foram realizados. As contagens de células CD4 + de todos os pacientes foram correlacionadas com a presença (ou ausência) de candidíase. De um total 165 pacientes com HIV positivo emaninados, 80 (48,8 %) dos pacientes tiveram diagnóstico definitivo de candidíase. Candida albicans foi a espécie mais comum de levedura isolada. Os pacientes com candidíase tinham contagem de CD4 inferior a 200 células/mm 3. A resistência máxima foi observada com fluconazol, enquanto nenhuma resistência foi vista com voriconazol. A alta prevalência de resistência a drogas requer o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos contra infecções causadas por fungos patogênicos oportunistas, tais como Candida albicans (DOVIGO et al., 2011b; LAM et al., 2011). O uso descontrolado de antifúngicos azólicos, como fluconazol, itraconazol, cetoconazol e voriconazol, para o tratamento de infecções de mucosa e sistêmica de Candida ssp. pode resultar na seleção e/ou aparecimento de cepas resistentes. Apesar da natureza multifatorial da resistência à azólicos, acredita-se que pode está relacionada alterações nos genes do fungo, que codificam a enzima alvo do azol e o

37 36 papel da regulação positiva de bombas de efluxo (SANGUINETTI, 2005). Várias abordagens têm sido propostas para superar a resistência antifúngica mediada por efluxo da droga, tais como: utilização de antifúngico alternativo que não apresente substrato para bomba de efluxo (como equinocandinas, uma nova classe de antifúngico); bloqueio do fornecimento de energia ao fungo e inibição farmacológica direta das bombas de efluxo (PRATES et al., 2011). Há uma necessidade urgente de buscar e implantar novas e eficazes contra medidas antifúngicas alternativas. A PDT foi estabelecida como uma modalidade de sucesso no tratamento das patologias citadas acima, mas a inativação fotodinâmica só recentemente foi intensamente investigada como uma descoberta antimicrobiana alternativa (DAI et al., 2012). O conceito de inativação fotodinâmica requer exposição de células à energia da luz, normalmente com comprimentos de onda na região do visível que faz com que a excitação de moléculas de FS, exógenas ou endógenas, o que resulta na produção de moléculas reativas de oxigénio (ROS). Os ROS produzem inativação e morte celular através da modificação de componentes intracelulares. As características versáteis da PDT levaram a sua investigação como uma descoberta para o tratamento anti-infeccioso (VERA et al., 2012). Os fungos são importantes agentes de doenças humanas. Entre os fungos patogênicos mais importantes são as espécies de leveduras pertencentes ao gênero Candida (SILVA MARTINS et al., 2011). A Candidíase orofaríngea, causada predominantemente por Candida albicans, é uma infecção frequente em pacientes com imunodeficiência, como o HIV, deficiências nutricional, doenças metabólicas, como diabetes, malignidades, xerostomia (secundária à terapia de radiação), efeitos colaterais de medicamentos, envelhecimento, síndrome sjögren e próteses dentárias. O desenvolvimento de candidíase depende do sistema de defesa do hospedeiro e é considerado um preditor, independente de imunodeficiência, em pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (MANG; MIKULSKI; SALA, 2010). Também pode está associada a dispositivos médicos de longa permanência (por exemplo, implantes dentários, cateteres, válvulas cardíacas, enxertos vasculares, lentes oculares, articulações artificiais e derivações do sistema nervoso central), que podem atuar como substratos para o crescimento do biofilme (LAM, M et al., 2011).

38 37 Candida albicans é um patógeno oportunista, capaz de produzir ambas as infecções superficiais e sistêmicas, em hospedeiros imunocomprometidos (MUNIN et al., 2007; MITRA et al., 2011). O controle de rotina das infecções oportunistas, incluindo candidíase orofaríngea, é importante e deve ser realizado, pois ajuda a monitorizar a progressão da doença e evita complicações, tais como a candidemia (ANWAR; MALIK; SUBHAN, 2012). A Candida albicans é o principal tipo de fungo capaz de formar biofilme, causando infecções superficiais na pele e nas mucosas, bem como micoses profundas, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Nesses pacientes, infecções invasivas são frequentemente associadas com alta morbidade e mortalidade. Além disso, o aumento da resistência antifúngica diminuiu a eficácia de terapias convencionais. Os tratamentos são demorados e exigem, portanto, maiores gastos para saúde. Além disso, as atuais drogas antifúngicas têm um espectro limitado de ação e apresenta toxicidade. O uso da PDT, como um agente antimicrobiano tópico, contra doenças cutâneas superficiais, representa um método eficaz para a eliminação de microrganismos (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). A parede celular fúngica é constituída por uma camada espessa de betaglucano e quitina e também proporciona uma barreira à permeabilidade do agente FS (KHARKWAL et al., 2011). Os fungos apresentam uma estrutura celular muito mais complexa que as bactérias. As leveduras constitui um grande grupo de microrganismos eucariontes, que são envolvidas por uma parede celular externa composta por glucano, quitina e lipoproteínas e é separada da membrana plasmática por um espaço periplasmático. A absorção de substâncias exógenas por fungos é geralmente afetada pela lipofilicidade e pela hidrofilicidade do seu revestimento celular. Após a captação, o FS é direcionado a alvos intracelulares. A presença do agente nestes alvos é importante, pois o oxigênio singleto é altamente reativo e apresenta um tempo de vida curto após a sua produção quando é irradiado. Assim que o oxigênio singleto é formado pela excitação da luz no FS, apresenta efeito oxidante contra as enzimas do fungo, tais como superóxidos dismutase e catalase, que são uma importante defesa antioxidante na maioria das células expostas ao oxigénio. Isto explica o fato

39 38 de não existir diferença na susceptibilidade à PDT entre organismos resistentes aos antifúngicos convencionais e os não resistentes estudadas (DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008). A levedura, Candida albicans, não é apenas a principal espécie associada a micoses orais em humanos, mas a mais comum em pacientes com HIV, em quem candidíase orofaríngea, em particular, é uma importante causa de morbidade (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Candidíase orofaríngea é uma das infecções oportunistas mais comuns que acompanham os pacientes com AIDS (LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005). 2.4 Inativação de Candida albicans por terapia fotodinâmica (PDT) Em 1993, Wilson e Mia avaliaram a inativação fotodinâmica com laser de baixa potência de cepas de Candida spp coletadas de lesões de candidose em a pacientes com HIV. Suspensões de Candida albicans foram tratados com uma série de FSs e expostos a luz de laser hélio/neon (HeNe) ou laser arseneto de gálio de alumínio (GaAs) por 120s e, em seguida, foi avaliada a vitalidade dos microrganismos. O azul de toluidina (TBO), tionina e cristal de violeta fotoativados por laser HeNe (dose de energia=876 mj e densidade de 66,36J/cm 2 ). O éster dihematopofirina não foi um FS eficaz sob as condições empregadas e já citadas acima. O azul de metileno (AM) foi capaz de sensibilizar e matar Candida albicans quando ativado por luz laser de GaAs (energia dose de 1,32 J, com uma densidade de 2,04 J/cm 2 ). Neste estudo os pesquisadores também observaram que a viabilidade da levedura não foi afetada pela exposição à luz laser na ausência de FSs. Em 1999, Jackson et al. avaliaram o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica contra Candida albicans, utilizando o laser de baixa potência Hélio Neon (HeNe), com energia de 35 mw e comprimento de onda de 632,8 nm, e azul de toluidina como FS. As variáveis estudadas foram a concentração do azul de toluidina, a dose de luz laser e o tempo pré-irradiação. Os resultados deste estudo demonstraram que ambas as formas de Candida albicans, levedura e hifas, bem como cepas resistentes aos antifúngicos azólicos, podem ser sensibilizadas com baixas doses de luz laser quando associadas a azul de toluidina em curto período de

40 39 tempo (2-5 min). A maior redução microbiana observada foi alcançada com a dose de 42 J. Teichert et al. (2002) avaliaram a eficiência da terapia fotodinâmica, utilizando o AM nas concentrações 250, 275, 300, 350, 400, 450, ou 500 µg/ml, no tratamento da candidíase oral induzida em ratos imunodeficientes. Setenta e cinco animais foram incubados, por via oral, com Candida albicans coletadas de pacientes HIVpositivos três vezes ao dia por 4 semanas. Para o tratamento, foi realizada uma administração tópica de 0,05 ml de uma solução de AM nas concentrações já citadas. Após 10 minutos, as lesões de candidíase, do grupo experimental, foram submetidas a terapia fotodinâmica com 664 nm de luz laser de diodo a 275 J/cm 2 e 400 mw durante um tempo de 687,5 segundos. Decorrida a terapia fotodinâmica, realizou-se uma cultura das lesões e exame histopatológico do tecido da área afetada. Os resultados indicaram que o efeito que foi diretamente proporcional à concentração do agente FS, quando nas concentrações ente 250 e 400 µg/ml, reduziu o crescimento do fungo, mas não eliminou totalmente a Candida albicans. Já nas concentrações de 450 e 500 µg/ml de AM, a C. Candida albicans foi totalmente erradicada da cavidade bucal. Para os autores deste estudo, a terapia fotodinâmica mediada por AM pode ser usada potencialmente para o tratamento de candidíase oral em pacientes imunodeficientes. A demonstração científica da susceptibilidade de Candida ssp. à PDT, usando um corante ou FS que já está sendo utilizado na clínica médica, é um passo importante para que esta modalidade de tratamento se torne uma nova estratégia terapêutica com potencial para tratar a infecção fúngica. Claramente, seletividade destes agentes é uma questão importante, pois as células humanas saudáveis podem ser suscetíveis a danos causados por eles. A aplicação tópica do FS e da luz, apenas nas áreas afetadas por candidíase mucocutânea, faz com que essas infeções possam ser tratadas com PDT com o mínimo de efeitos colaterais locais (BLISS et al., 2004). Para avaliar a susceptibilidade de Candida ssp (Candida albicans; Candida krusei e Candida glabrata) à terapia fotodinâmica, Bliss et al. (2004) utilizaram o Photofrin, como agente FS, e uma lâmpada de argônio, como luz vivível. As células foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas no escuro durante 30

41 40 min a 37 C com Photofrin em concentrações que va riaram 10-0,01 ug/ml. A iluminação foi realizada durante 10 min à temperatura ambiente com uma fluência total de 9J/cm 2. A irradiação das células fotossensibilizadas levou a uma inibição dose-dependente da atividade metabólica das espécies de Candida albicans e Candida krusei. A Candida glabrata foi resistente a PDT, produzindo reduções modestas de sua atividade, mesmo em altas concentrações do FS, provavelmente devido a pouca absorção do Photofrin por esta espécie de Candida. Lambrechts; Aalders; Van Marle (2005) estudaram os mecanismos de inativação fotodinâmica em Candida albicans utilizando uma porfirina catiônica 5- fenil-10,15,20-tris (N -metil-4-piridil) porfirina cloreto TRIP ([4]) por meio das técnicas de microscopia eletrônica e fluorescência confocal. Os autores observaram que TRIP [4] liga-se a membrana celular das cepas de Candida albicans, e nenhum ou muito pouco do FS entra na célula. Concluíram que a PDT pode inativar com sucesso Candida albicans e que a membrana citoplasmática é a organela alvo da porfirina catiônica. As imagens de microscopia eletrônica mostraram claramente que os danos induzidos pela PDT ocorrem da camada externa da membrana citoplasmática para o interior da célula. As imagens de fluorescência confocal mostraram que ocorreu um efluxo maciço do FS após a morte celular. Souza et al. (2006) estudaram os efeitos da terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de diferentes espécies de Candida. Foram preparadas suspenções de Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida krusei e Candida tropicalis, contendo 10 6 células/ml. De cada uma das espécies, 10 amostras da suspensão de células foram irradiadas com laser de diodo (λ = 685 nm e densidade de energia de 28 J/cm 2 ) na presença de AM (0,1 mg/ml) por 5 minutos; 10 amostras foram apenas tratados com AM (0,1 mg/ml por 5 min), sem exposição à luz laser; 10 amostras foram irradiadas com o laser na ausência do corante e 10 amostras não foram expostas luz de laser, nem ao corante AM. De cada amostra, uma série de diluições de 10-2 e 10-3 foram obtidos e alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram plaqueadas em duplicata em ágar dextrose Sabouraud. Após incubação a 37 º C por 48 horas, o número de unidades formadoras de colônia (UFC/ml) foi obtido e os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (p <0,05). Os pesquisadores observaram que a fotoativação do AM na concentração de 0,1mg/mL reduziu o

42 41 número de UFC/ml em 88 Candida krusei e 82,3% para a Candida tropicalis. A radiação laser ou AM sozinho não reduziu significativamente o número de UFC/mL em todas as amostras de Candida, com exceção de Candida tropicalis, que foi a única espécie apresentou susceptibilidade à luz lazer na ausência do FS. Neste estudo a PDT apresentou efeito fungicida em todas as espécies de Candida pesquisadas. Munin et al. (2007) estudaram o efeito da PDT na inibição da formação de tubo germinativo por Candida albicans, que é um estado de transição entre células e brotamento de hifas e representa uma etapa essencial para a virulência do fungo. As culturas de Candida albicans foram semeadas em ágar dextrose Sabouraud e incubadas a 37 o C por 48 h. Após a incubação, amostra de colónias foi removido da superfície do ágar e preparadas suspensões solução fisiológica estéril (0,85 %) com densidade células viáveis de 1-5 x A suspensão de Candida foi semeada em placas de microtitulação com 96 poços, nos quais foi adicionado AM com concentrações que variaram entre 0,027 a 13,37 mm. Após um período de incubação de 5 min as placas foram iluminadas com laser de diodo com área do feixe de 0,38 cm 2, potência de 0,035 W, comprimento de onda de 683 nm e densidade de energia de 28 J/cm 2. Alíquotas dos poços foram diluídas 100 vezes com solução fisiológica estéril e uniformemente espalhada em uma placa de Petri, que formam novamente incubadas (37 o C por 48 h). Após este período, o número de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) foi determinado. O aumento da concentração de AM de 0,027 a 0,27 mm reduziu drasticamente o número de UFC/mL após a irradiação. Concentrações de AM superiores a 0,27 mm diminuíram progressivamente o efeito do laser. Na ausência de irradiação com laser, o AM não produziu redução de UFC/mL nas concentrações variando entre 0,027 a 13,37 mm. As células tratadas com AM (0,013Mm) associada com a irradiação com luz Laser apresentaram mínima ou nenhuma formação de tubo germinativo Peloi et al. (2008) testaram um diodo emissor de luz (LED), como fonte de luz alternativa, associada com o AM, na PDT contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans e Artemia salina. A luz LED apresentava comprimento de onda 663 nm e doses de 2, 4, 6 e 12 J/cm 2, resultando em um tempo de exposição de 10, 20, 30 e 60 min respectivamente. Os grupos teste foram

43 42 preparados adicionando-se 400µl da suspensão celular (10 8 UFC/mL) a 100µl do AM em diferentes concentrações variando de 7 a 140,8µM. No tempo de irradiação de 20 min e concentração de AM de 42,2 mm, a PDT resultou em uma taxa de inativação de 93,05% para S. aureus e, na concentração de 35,2 mm de AM, houve uma taxa de inativação de 93,7% para E.coli e 93,33% para Candida albicans. Concluíram que o LED vermelho pode ser um dispositivo de luz promissor para PDT. Chabrier-Roselló et al. (2008) avaliaram o efeito da terapia fotodinâmica sobre Candida albicans e Candida glabrata, que apresentavam deficiência respiratória e, portanto um padrão de resistência a família antifúngicos azólicos, peptídeos antimicrobianos, histamina salivares e a outros tipos de estresse tóxico. Utilizaram o Photofrin como FS. Em contraste com este padrão de resistência, ambos as espécies de Candida albicans e a Candida glabrata foram significativamente mais sensíveis à PDT em comparação com as espécies não resistentes. Estes dados sugerem que a função mitocondrial normal pode fornecer um nível basal de defesa anti-oxidante contra a fototoxicidade induzida pela PDT. Cadastro et al. (2008) tratou um paciente leucoderma, do sexo feminino, com 56 anos de idade e com diagnóstico de lesões orais recidivantes localizadas nas comissuras labiais. Na anamnese, o paciente relatou possuir diabetes mellitus, hipertensão controlada, que as lesões recidivavam frequentemente há mais de dois anos e que já tinha realizado diversas manobras terapêuticas que resultaram em insucesso, como aplicação tópica de miconazol três vezes ao dia por um longo período, e por vezes associado de forma sistêmica. Ao exame clínico intra e extra bucal observou-se lesões acometendo bilateralmente a região de comissura labial, com úlceras fissurais, leito hiperêmico, hemorrágico e halo eritematoso com presença de descamação e ruptura do epitélio, seguido de intensa dor. O diagnóstico das alterações foi baseado nas características clínicas, confirmados por exame citológico. Foi realizado o teste para avaliação do fluxo salivar, que resultou em valor moderado, confirmando presença de xerostomia leve. Como conduta de tratamento, aplicou-se com swab estéril, com leves toques, o agente azul de metileno a 0,1 mg/ml em toda extensão da lesão seguido da aplicação única do laser de baixa intensidade de potência (Arseneto de Gálio e Alumínio GaAlAs) a 790nm e 30 mw de potência, durante 2 minutos e 20 segundos, de forma pontual

44 43 até contemplar toda área da lesão clínica, gerando uma densidade de energia de 4 J/cm². A paciente foi avaliada no 3º e no 7º dia e após uma proservação de mais de seis meses não houve a presença de recidivas. Concluíram que o tratamento da queilite angular, utilizando a terapia fotodinâmica, evidenciou ausência de lesões clínicas e citológicas, reforçando fácil aplicabilidade, sem a presença de efeitos colaterais adversos, tornando-se um método alternativo de tratamento efetivo e recomendado. Donnelly; McCarron; Tunney (2008) analisaram pesquisas publicadas, até esta data, sobre as aplicações antifúngicas da PDT. Os resultados destas pesquisas experimentais demonstraram, de forma conclusiva, que dermatófitos e leveduras podem ser destruídos efetivamente por meio da PDT, empregando phenothiazinium, porphyrin e phthalocyanine como fotossensibilizadores. Estes FS apresentaram seletividade para os fungos, não induziram resistência fúngica e não produziram efeitos genotóxicos, nem mutagênicos para os fungos ou para as células humanas. No entanto, os pesquisadores observaram a carência de estudos publicados do tipo ensaios clínicos com seres humanos. Cormick et al. (2009) estudaram o efeito da fotoativação com luz visível de duas porfirinas catiônicos: TFAP 3+ (5 (4-trifluorophenyl)-10,15,20-tris(4 trimethylammoniumphenyl)porphyrin iodeto) e TMAP 4+ (5,10,15,20-tetra(4-N,N,N trimethylammonium phenyl) porphyrin p-tosylate) na viabilidade de Candida albicans. Os resultados dessas porfirinas catiónicos foram comparados com os da 5,10,15,20-tetra (4-sulfonatofenil) porfirina (TPPS 4- ), que é um FS aniônico. Diferentemente da porforina anônica (TPPS 4- ), as porfirinas catiônicos ligaram-se rapidamente a células de Candida albicans, alcançando um valor de aproximadamente 4 nmol/10 6 células quando as suspenções celulares foram incubadas com 5 µm dos FSs durante 30 min. Esta ligação dependeu da concentração do FS (1-5µM) e da densidade celular (10 6 a 10 8 células por ml). A inativação fotodinâmica das células de Candida albicans aumentou com o aumento da concentração do FS, causando uma redução de aproximadamente 5 log 10 na viabilidade celular, quando as culturas foram tratadas com 5 µm de porfirina catiónica e irradiada durante 30 min. As Porfirinas catiônicos produziram uma redução de crescimento das colónias de Candida albicans e a viabilidade das

45 44 células não foi observada depois de 3 horas de irradiação, indicando uma inativação completa das células de levedura. Portanto, estes resultados indicam que estas porfirinas catiônicos são sensibilizadores importantes para inativação fotodinâmica de leveduras em suspensões líquidas ou localizadas em focos de infecção. Carvalho; Felipe; Costa (2009) estudaram os efeitos das condições do meio ambiente durante a terapia fotodinâmica antimicrobiana em Candida albicans; Usando azul de metileno e azul de toluidina como agentes FSs. Neste estudo foi observada a redução na inibição do crescimento de cândida em um meio tamponado, com ph maior que 6.0 e manutenção dos efeitos fototóxicos apenas na presença de solução salina (meio não tamponado). Diferentes membros da mesma classe de microrganismo parecem ter diferentes padrões de suscetibilidade à terapia fotodinâmica antimicrobiana devido a determinantes metabólicos intrínsecos, tais como: defesa enzimática contra moléculas reativas de oxigênio e bombas de efluxo que reconhecem as moléculas do FS (PRATES et al., 2011). A PDT, com AM, aumenta a permeabilidade da membrana celular em Candida albicans, o que poderia reduzir a resistência deste microrganismo contra outras drogas. Desta forma, a PDT pode também ser empregada como um coadjuvante da quimioterapia antifúngica convencional (LYON et al., 2011). Estudando os mecanismos pelos quais a PDT produzem efeito antimicrobiano contra Candida albicans, Giroldo et al. (2009) utilizaram suspensão Candida albicans (ATCC ), com uma densidade 1-5 x 10 7 células viáveis/ml, que foram semeadas em placas de microtitulação com 96 poços. Em seguida, foi adicionado às suspensões AM nas concentrações entre 0,01 mg/ml e 0,5 mg/ml, resultando em um volume final de 0,2 ml por cada poço. Após um período de incubação de 5 min, foi aplicada a luz de um laser de diodo, com potência de 35 mw de saída e comprimento de onda de 684 nm. A área iluminada pelo feixe de laser foi de 0,38 cm 2, resultando em uma dose de energia de 28 J/cm 2. Alíquotas de 50 µl foram retiradas antes e após a iluminação para determinar o número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL). O aumento da concentração do AM aumentou o efeito da PDT no crescimento de Candida albicans, mas este resultado não foi observado na ausência de irradiação. Na presença de AM a 0,05 mg/ml, houve uma

46 45 redução de 50% da UFC/mL. No entanto, em concentrações superiores a 0,05 mg/ml, ocorreu uma redução progressiva na inibição do crescimento do fungo. A inativação do crescimento foi associada ao aumento da permeabilidade da membrana plasmática, o que sugere que após a irradiação, AM pode levar à produção de oxigénio singleto e outras moléculas reativas de oxigênio, que podem danificar a membrana da célula e, por conseguinte, promover a morte celular. Em 2009, Junqueira et al. testaram os efeitos da PDT, utilizando 0,1 mg/ml de AM, como FS, e lazer de diodo (660nm, 50mw, 10J, 26J/cm 2 ) em um modelo experimental de candidíase bucal induzida no dorso da língua de ratos. De acordo com as modalidades de tratamento, 72 animais, utilizados para o experimento, foram distribuídos em quatro grupos: grupo (L+FS+), lesões tratadas com PDT, aplicação de AM por 5 minutos e irradiação com luz laser; grupo (L-FS+), lesões tratadas apenas com o AM, grupo (L+FS-), lesões tratadas apenas com laser e grupo (L-FS-), lesões que não receberam tratamento algum. Em seguida, os animais foram sacrificados imediatamente, com 1 e 5 dias após o tratamento para a análise microscópica do dorso da língua. O grupo tratado com PDT apresentaram menor resposta inflamatória crônica e alterações epiteliais amenas em comparação com o grupo que não recebeu tratamento. As lesões tratadas apenas com laser ou somente com o AM apresentaram uma resposta inflamatória e alterações epiteliais mais severas em comparação com o grupo tratado com PDT. Os ratos tratados com a terapia fotodinâmica (PDT) desenvolveram lesões candidíase mais discretos do que os demais grupos. A eficácia de diferentes FSs na terapia fotodinâmica contra Candida albicans foi testada, em 2010, por Souza et al.. Para realizar o experimento, utilizaram laser de baixa potência (AsGaAI), com densidade de energia de 15,8 J/cm 2, 26,3 J/cm 2 e 39,5 J/cm 2, e azul de metileno, azul de toluidina e verde de malaquita, na concentração de 0,1 mg/ml, como fotossensibilizantes. Com auxílio de um espectofotômetro, suspensões de Candida albicans, com 10 6 células por ml, foram padronizadas, as quais foram adicionadas o corante e aplicada a luz laser. Para cada corante, foram realizados 120 ensaios, que foram divididos em quatro grupos de acordo com as seguintes condições experimentais: irradiação com laser na presença do FS, irradiação apenas com laser, o tratamento apenas com o FS e sem exposição à luz laser e nem ao FS. Com os resultados dos testes, observou-se que

47 46 a terapêutica fotodinâmica, usando os FSs testados, foi eficaz na redução do número de UFC/ ml de Candida albicans entre 0,54 log 10 e 3,07 log 10 e que esta redução dependeu da densidade de energia do laser utilizado. A redução do log UFC/mL de Candida albicans cresceu com o aumento da densidade de energia do laser de 15,8 J/cm 2 a 39,5 J/cm 2 para todos os FSs testados. No grupo tratado com laser, na ausência de FS, houve uma redução do número de UFC/mL, sugerindo que a levedura apresenta susceptibilidade à luz laser. Nenhum dos FSs testados (azul de toluidina, azul de metileno ou verde malaquita) exerceu um efeito citotóxico em Candida albicans na ausência de luz. Com a idéia de que a deficiência respiratória aumenta os níveis intracelulares de moléculas reativas de oxigênio em leveduras, Chabrier-Roselló et al. (2010) usaram um inibidor do metabolismo respiratório (antimicina A) e cepas alteradas geneticamente, com deficiência na função respiratória, para determinar se a interferência na cadeia de transporte de elétrons e de sua função resulta em sensibilidade aumentada à terapia fotodinâmica (PDT) sobre Candida albicans, Candida glabrata, e ema levedura não patogênica, S. cerevisiae. Utilizaram porfirina catiônica meso-tetra como FS (N-metil-4-piridil) Porphine tetra tosilato (TMP-1363), que foi ativado por luz visível a partir de lâmpadas fluorescente (4,0 mw/cm 2, 4 J/cm 2 e nm) por 10 min. A inibição metabólica da respiração aumentou a sensibilidade de Candida ao estresse oxidativo induzido pela PDT, resultando em uma redução de 2 log 10 de UFC/mL em comparação com as cepas sem deficiência respiratória. As cepas alteradas geneticamente com deficiência respiratória também apresentaram uma maior sensibilidade à PDT e isto não foi resultado do aumento do acúmulo de porfirinas endógenas. Os resultados do estudo demonstram que a inibição seletiva do ETC (Complexos III e IV) aumenta significativamente a sensibilidade de Candida albicans, Candida glabrata, e S. cerevisiae à PDT quando sensibilizadas com TMP Mang; Mikulski; Sala (2010) testaram o efeito da terapia fotodinâmica (PDT) sobre espécies de Candida (Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida krusei e Candida tropicalis) resistentes e sensíveis ao fluconazol e a anfotetricina B, que foram isoladas de pacientes adultos com AIDS. Utilizaram o Photofrin (25 µg/ml), como FS, e luz lazer KTP: YAG (comprimento de

48 47 onda = 630 nm, densidade de potência = 150 mw/cm 2 e doses de = 45, 90, 135 J/cm 2 ). Os resultados mostraram uma significativa redução na viabilidade de Candida em todas as doses de luz. Este estudo demonstrou que a PDT, induzida por Photofrin, pode eliminar espécies de Candida com eficiência significativa. As cepas, que tinham demonstrado resistência antifúngica a fluconazol e anfotericina B, isoladas de pacientes com AIDS, apresentaram sensibilidade equivalente à PDT, assim como os controles formados por cepas ATCC, não resistentes, da mesma espécie. Os controles foram formados pelas culturas que não foram tratadas com PDT, que foram apenas irradiadas, sem o Photofrin, e por as que foram tratadas apenas com o FS. Porficenos catiônicos (Py3MeO-TBPO), derivados de porfirina, foram testados, in vitro, como FSs na PDT contra espécies de leveduras (Cândida albicans e Candida krusei), assim como contra diferentes bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis) e Gram-negativas (Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, Proteusmirabilis e Pseudomonas aeruginosa). Suspensões de bactérias (10 8 CFU/mL) e de levedura (10 7 UFC/mL), foram incubadas em no escuro à temperatura ambiente durante 30 min com concentração de Dimetilacetamida (DMA) gradativamente aumentada a partir de 5 mm. Todas as bactérias e Candida albicans foram irradiadas com uma luz não coerente de 652 nm ± 15 nm e taxa de fluência de 125 mw/cm 2. A Suspensão de C. krusei foi irradiada por meio de Photocare (Sorisa) a 635 ± 10 nm e taxa de fluência de 35 mw/cm 2. Todas as espécies bacterianas Gram-positivas foram completamente eliminadas pela PDT com Py3MeO-TBPO. E. faecalis foi a espécie mais sensíveis com redução de 6 log 10 na viabilidade bacteriana na concentração de 0,5 µm e uma dose de energia de 30 J/cm 2 cm. Para a inativação de espécies gram-negativas foi necessário concentrações do FS e doses de luz maiores para reduzir de 6 log 10 na viabilidade bacteriana. Ambas as espécies de Candida foram completamente eliminadas por Py3MeO-TBPO com concentração do FS e dose de luz dependente. A concentração de 50 µm e uma dose de luz de 30 J/cm 2 produziu uma redução de 5 log 10 na viabilidade de Candida albicans. Apenas uma concentração de 10 µm e dose de luz de 15 J/cm 2 foram necessárias para produzir a mesma redução na viabilidade celular de Candida krusei (RAGAS et al., 2010).

49 48 Quiroga et al. (2010) avaliaram o efeito da fotoativação, in vitro, de 5,10,15,20 - tetra (4-N-metilpiridil) porfirina (TMPyP) contra células de Cândida albicans sob diferentes condições experimentais. Suspensões celulares (10 6 CFU/mL) foram incubadas, no escuro, com 1, 5 e 10 mm do FS pelo período de 30 min. Depois disso, as culturas foram expostas a visível luz por diferentes intervalos de tempo. Experimentos controles foram realizados sem iluminação na ausência e na presença do sensibilizador. As suspensões de células irradiadas e controles foram diluídas em série com solução salina, cada solução foi semeada em triplicada em meio Sabouraud e o número de colónias formadas após de 48 h de incubação a 37 o C foram contadas. Com os resultados, foi possível observar que o aumento na quantidade de FS ligado a Células de Candida albicans não foi observada quando o tempo de incubação foi estendido para 30 min. O FS apresentou um efeito tóxico contra as células de Candida albicans, produzindo uma redução de 1,5 log 10 de sobrevivência celular, apenas na concentração de 10 mm. Por isso, foi escolhida a concentração de 5 mm do FS para as experiências nas suspensões de células. A viabilidade de Candida albicans não foi afetada quando aplicada a luz na ausência do FS. Quando a concentração do FS variou de 1 mm para 5 mm, houve uma redução de 3,5 log 10 para 5 log 10. Sob estas condições, a inativação de Candida albicans foi proporcional ao tempo de irradiação. O estudo concluiu que o TMPyP é um sensibilizador efetivo para aplicação na PDT de Candida albicans em suspensões celulares e em focos de infecções localizadas. Em um estudo que utilizou Fotogem, como FS, e diodo emissor de luz (LED), como luz visível (λ 455 nm e 12,5 mw/cm 2 ), Dovigo et al. (2010) avaliaram o efeito da PDT na susceptibilidade, in vitro, de quatro espécies de Candida (Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida tropicalis e Candida krusei). Suspensões de cada espécie (10 6 UFC/mL) foram tratadas, no escuro, com três concentrações diferentes de FS (10, 25 e 50 mg/l) durante 30 minutos. Em seguida, foram irradiadas com três fluências ou doses de luz: 18,0; 25,5 e 37,5 J/cm 2 de luz LED, que corresponde aos tempos de 50, 34 e 24 minutos. As suspenções controles foram tratadas apenas com FS, apenas expostas à luz ou nem expostas luz, nem ao FS. Dezesseis condições experimentais foram obtidas e cada condição foi realizada em triplicata. De cada exemplo, diluições em série foram obtidas e as alíquotas foram plaqueadas em Agar Sabouraud Dextrose. Depois a incubação das placas (37

50 49 C durante 48 horas), as colónias foram contadas (U FC/mL). Foi observada a eliminação completa de Candida albicans com uma dose de luz de 18,0 J/cm 2, em associação com 50 mg/l de FS. C. dubliniensis foram inativadas após 18,0 J/cm 2, utilizando 25 mg/l do FS. A inativação de Candida tropicalis, foi observada após a fotossensibilização com 25 mg/l e subsequente iluminação de 25,5 J/cm 2. Para Candida krusei, nenhuma das associações entre FS e luz resultou em completa inativação desta espécie. PDT se mostrou eficaz para a inativação de Candida albicans, Candida dubliniensis e Candida tropicalis e redução significativamente a viabilidade celular de Candida krusei. Dovigo et al. (2011a) avaliaram o efeito da fotoativação do Photogem com luz LED (diodo emissor de luz), com comprimento de onda de 630 nm, sobre cepas (ATCC) de Candida albicans e Candida glabrata resistente ao fluconazol. Suspenções (10 6 células/ml) de cada espécie de Candida foram tratadas com cinco concentrações de Photogem (2,5, 5, 10, 25 e 50 mg/ml) por 30 min e irradiadas com uma intensidade de luz LED de 12,5 mw/cm 2 e comprimento de onda de 450 nm, com quatro densidades 10,5; 18,0; 25,5 e 37.5 J cm 2, resultando respectivamente nos seguintes tempos de iluminação: 14, 24, 34 ou 50 min. Também foi avaliado o efeito na viabilidade das espécies de Candida apenas a luz LED e somente ao Photogem. O controle constitui-se de suspenções de Candida que não foram expostas nem a luz LED, nem ao FS. Após a PDT, foram obtidas diluições seriadas de cada amostra (10-1 e 10-3 ), e alíquotas de 25µl dessas diluições foram plaqueadas em ASD. As placas foram incubadas a 37 C por 48horas. Após a incubação, foi realizada a contagem de UFC/mL. Para avaliar o efeito da PDT contra biofilmes de Candida, alíquotas da cultura de células foram transferidas para a superfície de filtros de membrana de nitrato de celulose para formar o biofilme, que tratados com 25 mg/ml do FS e irradiado com 37,5 J/cm 2. Suspensões planctônicas de Candida resistente ao fluconazol foram efetivamente inativadas após PDT. O efeito fungicida da PDT foi dependente da espécie. Reduções significativas na viabilidade do biofilme foram observadas para as três cepas de Candida albicans e por duas cepas de Candida glabrata. Os resultados demonstraram que a dose de luz mínima que promoveu a completa inativação das duas cepas de Candida albicans foi 18J/cm 2, em associação com 50mg/L de Photogem. Observou-se diferenças estatisticamente significantes na obtenção da inativação total das duas cepas de

51 50 Candida glabrata. Para as espécies ATCCs, não houve crescimento de colônias viáveis após o tratamento com 10, 25 e 50mg/L de Photogem seguido de iluminação a 37,5J/cm 2. No entanto, somente as concentrações de 25 e 50mg/L foram capazes de eliminar a Candida glabrata resistente a fluconazol nas doses de 25,5 e 37,5J/cm 2. Além disso, na forma de biofilmes as espécies foram menos suscetíveis à PDT do que nas formas planctônicas. Em 2011, Pupo et al. avaliaram a susceptibilidade de Candida albicans à terapia fotodinâmica e, paulatinamente, comparou a eficácia dos agentes fotossensibilizantes azul de metileno e azul de toluidina, ambos na concentração de 100 µg/ml. Como fonte de luz, foi utilizado o laser índio-gálio-alumínio (InGaAI) com densidade de energia de 53 J/cm 2. Foram preparadas suspensões de 10 8 células/ml de Candida albicans e colocadas em placas de microtitulação de 96 poços, nas quais foram adicionados os corantes. Em seguida, foi aplicada a luz laser por 5 minutos e as placas foram incubadas por 48 horas a 37 o C. Os resultados foram obtidos pelo número de unidades formadoras de colônia por ml (UFC/mL). Os resultados mostraram que o número de células viáveis de Candida albicans reduziu significativamente após a aplicação da luz laser associada ao azul de metileno e azul de toluidina. Martins et al. (2011) verificaram o efeito da terapia fotodinâmica antimicrobiana em lesões de Candida albicans induzidas no dorso da língua de ratos, utilizando AM como FS. Cinquenta e seis animais foram submetidos ao desenvolvimento da candidíase no dorso da língua por meio de inoculações Candida albicans. Após 5 dias, os animais foram divididos em quarto grupos de acordo com o tratamento recebido: FS e Laser (FS+L+), somente laser (L+FS-), apenas o FS e apenas solução fisiológica (L-FS-). Após a PDT, foram coletadas amostras das lesões da cavidade oral para contagem das unidades formadoras de colônia por ml (UFC/mL). Colônias foram isoladas para avaliação das atividades de protease e fosfolipase. Os ratos foram sacrificados para análise microscópica do dorso da língua. Com os resultados encontrados, os autores concluíram que a terapia fotodinâmica reduziu as lesões microscópicas de candidíase experimental em ratos e inibiu a atividade de proteinase de Candida albicans.

52 51 O PDT entre bactérias e fungos foi comparado no estudo de Huang et al. (2010), em que investigaram a efetividade de 4 novas bacterioclorinas estáveis sintéticas, com 2, 4 ou 6 grupos de quaternário de amônia ou 2 grupos básicos de amina. A mostra foi composta por uma bactéria gram-positivas (Staphylococcus aureus), uma bactéria gram-negativas (Escherichia coli) e uma levedura de fungos dimórficos (Cândida albicans). Foram preparadas suspenções, com densidade celular de 10 8 células/ml para as bactérias, e de 10 7 células/ml, para Candida albicans. Alíquotas (1 ml) foram transferidas para uma placa de 24 poços e foram iluminadas à temperatura ambiente com uma fonte de laser de diodo (comprimento de onda de 732 nm, irradiância de 130 mw/cm 2 e fluência de 10 J/cm 2 ) por 77 s. Em seguida, as células foram tratadas com bacterioclorina e incubadas, no escuro por 30 min. Após a irradiação, alíquotas de 100 µl foram retirados de cada poço para determinar o número de unidades formadoras de colônias por ml (UFC/mL). A seletividade foi avaliada pela determinação da fototoxicidade contra células cancerosas humanas, nas mesmas condições. Todos os quatro compostos foram altamente ativos contra S. aureus e apresentaram seletividade tanto para as bactérias, quanto sobre as células humanas. Observou-se que o aumento da carga catiônica, melhorou a inativação de E. coli. e apenas o composto com grupos básicos foram altamente ativos contra Candida albicans. Queiroga et al. (2011) avaliaram a fotoinativação de espécies de Candida (Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei e Candida guillermondii), utilizando, como FS, o azul de metileno e o lazer de diodo, com comprimento de onda de 660 nm e potência de 40mW, como fonte de luz visível. Foram obtidas suspensões de espécies de Candida, contendo 10 6 UFC/mL. Alíquotas de 100µL foram transferidas para placas de microtitulação de 96 furos e foram expostas a 03 doses de luz laser (60 J/cm 2, 120 J/cm 2 e 180 J/cm 2 ), resultando em 1, 2 e 3 minutos de irradiação respectivamente, na presença de AM (150µg/mL). Suspensões adicionais foram tratadas apenas com o AM, somente com luz de laser ou com 0,85% de solução salina (grupo de controle). Após os tratamentos, alíquota de 1µl das suspensões foram transferidas para placas de petri e preparadas em duplicada. As placas foram incubadas a 37 C durante horas e, após este período, foi realizada a contagem de colónias (UFC/mL). A dose de luz laser a

53 J/cm 2 de foi a mais eficaz, resultando em inativação de 78% de UFC/mL. Nesta dose, a Candida albicans foi a espécie mais suscetível. Os efeitos da PDT sobre a patogenicidade de Candida albicans, em um modelo de candidíase bucal desenvolvida no dorso da língua de ratos, foram avaliados por Silva Martins em Cinquenta e seis ratos foram submetidos ao desenvolvimento da candidíase no dorso da língua por inoculações Candida albicans. Após 5 dias, os animais foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais: tratados com laser e FS (L+FS+); Tratados somente com laser (L+FS-); tratada somente com FS (L-FS+) e controle, que foram tratados somente com uma solução fisiológica (L-FS-). O FS utilizado foi uma solução de 0,1 mg/ml de AM preparado através da dissolução do pó (Sigma, São Paulo, Brasil) em uma solução fisiológica de cloreto de sódio a 0,85 % (NaCl). A fonte de luz utilizada foi o laser a de gálio - alumínio arseneto (GaAlAs), com um comprimento de onda de 660 nm, potência de saída 100 mw, a densidade de energia de 245 J/cm 2 e tempo de 69 segundos. A irradiação laser foi aplicada no dorso da língua por contato. O AM foi aplicado no dorso da língua e, após 1 min (tempo de pré-irradiação), duas aplicações de 69 segundos foram feitas. Em seguida, as amostras da cavidade oral foram coletadas para a contagem de unidades formadoras de colônias por ml. Colônias foram isolados para avaliação das atividades de proteinase e fosfolipase. O número de C. albicans recuperadas a partir da cavidade bucal dos ratos foram semelhante entre os grupos (P = 0,106). O grupo PDT mostrou menos lesões microscópicas de candidíase do que o grupo sem tratamento (P = 0,001) e também apresentou menor atividade de proteinase em comparação com os demais grupos. A terapia fotodinâmica reduziu as lesões microscópicas de candidíase experimental em ratos e inibiu a atividade de protease de Candida albicans. No estudo de Dai et al. (2011), infecções cutâneas por Candida albicans em camundongos foram tratadas com PDT, utilizando os FSs: o azul de toluidina a 82% (TBO), o azul de metileno a 85% (AM) e um novo azul de metileno (NAM) a 70%, que foram ativados com luz vermelha emitida não-coerente (LumaCare, Newport Beach, CA), com espectro de luz visível de 635 ± 15nm para TBO-NAM, 660 ± 15nm para AM. Para a inativação fotodinâmica de Candida albicans, in vitro, foram adicionados às suspensões de Candida albicans (10 7 UFC/mL) os FS na

54 53 concentração de 20 µm e, em seguida, foi realizada a irradiação com luz visível (32,5 mw/cm 2 ) nos tempos de 0, 1, 2, 3, 4, e 5 min, que correspondem respectivamente as doses de luz de 0; 1,95; 3,90, 5,85, 7,80, e 9,75 J/cm 2. Os resultados, in vitro, da PDT produziu uma inativação de 4,43 log 10 CFU de Candida albicans quando foi utilizado o NAM como FS na uma dose de luz de 9,75 J/cm 2. Nas condições equivalentes, o AM e TBO apresentaram uma inativação modesta. As feridas produzidas abrasão da pele foram inoculadas com uma gota (40 µl) da suspensão de cultura preparada, contendo 10 6 ou 10 7 UFC/mL de Candida albicans. A PDT, in vivo, foi iniciada entre 30 min e 24 h após a inoculação do fungo. Foi aplicada uma dose de luz de 78 J/ cm 2 ) (30 min após a infecção) ou 120 J/cm 2 (24 h pós-infecção). Os resultados mostraram que o NAM foi superior a TBO e AM como a FS na inativação fotodinâmica de Candida albicans in vitro. A eficácia da PDT foi diretamente proporcional a concentração de FS e a densidade de células fúngicas. Estes dados sugerem que a PDT é uma abordagem viável para a profilaxia e tratamento de infecções cutâneas de Candida albicans. Mitra et al. (2011) investigaram a eficácia do FS meso-tetra (N-metil-4-piridil)- porfina de tetra tosilato (TMP-1363) para o tratamento fotodinâmico de Candida albicans, in vitro, e da sua seletividade em um modelo animal. A eficácia de TMP na PDT de Candida albicans, in vitro, foi comparada com a do AM. As células foram incubadas por 30 minutos com ambos os FS na concentração de 10 mm e, em seguida, irradiadas com luz visível a partir de uma caixa com um banco de lâmpadas fluorescentes (4,0 mw/cm 2, 2,4 J/cm 2 ) por 10 min. A infecção, in vivo, no rato foi estabelecida por inoculação de levedura Candida albicans no espaço intradérmico do pavilhão auricular. Dois dias após a infecção, 0,3 mg/ml de TMP foi administrado por via tópica. Trinta minutos após a aplicação de TMP-1363, as orelhas foram irradiados a 514 nm, utilizando uma fluência de 90 J/cm 2 aplicada com uma irradiação de 50 mw/cm 2. As orelhas foram excisadas 2 horas após a irradiação, homogeneizados e a carga de organismo foi determinada através de um ensaio de UFC. In vivo, a localização do FS em relação a Candida albicans foi avaliada por imagens de fluorescência confocal. In vitro, a Fotossensibilização com TMP-1363 resultou em inativação de Candida albicans 3 log 10 maior em comparação com AM. In vivo, as imagens de fluorescência demonstraram um elevado grau de marcação seletiva de Candida albicans por TMP A PDT da infecção usando

55 54 TMP-1363 resultou numa redução significativa em CFU/orelha em relação aos controlos não tratados. Ouvidos infectados submetidos à PDT exibiram cura completa ao longo do tempo, sem danos observáveis ao pavilhão auricular. O estudo de Mima et al. (2011) provou que a terapia fotodinâmica pode reduzir a carga de fungos em dentaduras, podendo ser usada como um tratamento coadjuvante da estomatite protética. Para a realização desta pesquisa utilizaram: o FS (Fotogem ), que foi iluminado com luz LED, e diferentes espécies de Candida (Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida dubliniensis e Candida krusei) em próteses totais superiores. 34 próteses, confeccionadas para o estudo e esterilizadas com óxido de etileno, foram inoculadas individualmente com uma das espécies de Candida e incubadas a 37 o C por 24h. As dentaduras submetidos a PDT (FS+L+) foram pulverizadas individualmente com 50 mg/l de FS e, após 30 min, iluminadas por uma luz de LED por 26 min (37,5 J/cm 2 ). Próteses adicionais foram tratados apenas com o FS (FS+ L-) ou LED (FS- L+) ou não tratadas (FS- L-). As amostras das diluições em série foram espalhados em agar Sabouraud dextrose e incubadas a 37 C durante 48 h. As colónias foram contadas e os valores de log (UFC/mL) foram analisados. Com resultados encontrados, foi possível observar que todas as espécies de Cândida tratadas com PDT apresentaram redução significativa que variou entre 1,73 a 3,99 log 10 nos valores de UFC/mL em comparação com o grupo que não recebeu o tratamento. Reduções significativas (p <0,05) também foram observadas nos grupos tratados apenas com o FS (FS+ L-) ou somente com Luz (FS -L+) em comparação o grupo sem tratamento (FS-L-). Esta investigação demonstrou que a PDT, através da aplicação tópica de Photogem seguido pela iluminação de com luz LED azul, aplicada às dentaduras, promoveu uma redução significativa na viabilidade das diferentes espécies de Cândida comumente encontradas em próteses dentárias. Nas células dos mamíferos, a PDT tem sido aplicada para obter moléculas reativas de oxigénio, resultando em modificações oxidativas imediata de moléculas biológicas e na morte celular por apoptose (LAM, M et al., 2011). Estes autores verificaram, por meio de um estudo in vitro, a citototoxicidade e o mecanismo de ação da PDT, usando o FS silício ftalocianina (Pc 4), em células planctônicas de Candida albicans. As mitocôndrias foram os sítios de localização do Pc 4

56 55 em Candida albicans, evidenciada por ensaios de co-localização, bem como por ensaios XTT e FUN-1, o que indica que a via mitocondrial pode estar envolvida na morte celular induzida pela PDT com Pc 4. Em comparação com células de mamíferos, a dose de fotoirradiação de PC 4-PDT (1,0 mm e 2 J/cm 2 ) eficaz foi maior para C. ablicans (reduziu a sobrevivência da célula por 4 log 10 ). A necessidade de doses mais elevadas de PDT em fungos pode ser devido à presença de morfologia diferente, ou seja, a estrutura de hifas, a qual poderia ser mais resistente ao tratamento de outras formas de levedura. Os resultados da atividade metabólica e ensaios clonogênicos demonstram que Pc 4-PDT foi eficaz em matar células planctônicas de Candida albicans in vitro. Além disso, semelhante aos efeitos observados em células de mamíferos, Pc 4-PDT causa apoptose de Candida albicans, como mecanismos de morte celular. Além disso, observou-se mudanças na morfologia e característica nuclear da apoptose, que foram justificados pelo aumento da externalização de fosfatidilserina e fragmentação do DNA. Os dados demonstram que Pc 4-PDT pode ter potencial para se tornar um tratamento antifúngico, apesar de ainda ser necessário investigar os efeitos do PC 4-PDT em biofilmes de Candida. O efeito da terapia fotodinâmica, mediada por eritrosina, foi testada em culturas planctônicas e biofilmes de Candida albicans e Candida dubliniensis. Como fonte de luz, foi utilizado um diodo emissor de luz verde (LED) com um comprimento de onda 532 ± 10 nm, uma potência de 90 mw, uma energia de saída de 16,2J e um tempo de 3 min, de um ritmo de fluência de 237 mw/cm 2 e uma fluência de 42,63 J/cm 2. A área irradiada para as culturas planctônicas e biofilmes foi de 0,38 cm 2. Culturas de suspensões planctônicas padronizadas (10 6 células/ml) de Candida ssp.,em placas de microtitulação de 96 poços, foram tratadas com concentrações de eritrosina de 0, µm. Os biofilmes formados no fundo de uma placa de microtitulação de 96 poços foram tratados com 400 µm de eritrosina e luz LED. Depois da PDT, os biofilmes foram analisados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O efeito antimicrobiano da PDT contra culturas planctônicas e biofilmes foi verificada através da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC /ml). Não foram detectáveis após PDT a presença de culturas planctônicas de Candida albicans e Candida dubliniensis nas concentrações de eritrosina maiores ou igual a 3,12 µm. Os valores de UFC/mL obtidos a partir de biofilmes foram

57 56 reduzidos em 0,74 log 10 para Candida albicans e 0,21 log 10 para Candida dubliniensis. Em conclusão, Candida albicans e Candida dubliniensis foram sensíveis à ativação eritrosina com LED, mas os biofilmes de ambas as espécies foram mais resistentes do que suas formas planctônicas (COSTA et al., 2011). Um melhor conhecimento dos mecanismos de resistência da Candida albicans pode proporcionar o desenvolvimento de novos tratamentos, como também a combinação da Inativação fotodinâmica antimicrobiana com outras terapias (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Prates et al. (2011) investigaram se o principais sistemas de efluxo multidroga (MFS e ABC) afetam a eficiência da terapia fotodinâmica antimicrobiana, utilizando AM e luz laser de diodo GaAIAs (660nm; 50 mw; 0 a 60 J/cm 2 ; 165 mw/cm 2 ), contra fungos patogênicos. Testaram ainda inibidores específicos do efluxo com o objetivo potencializar a PDT. Suspensões de Candida albicans (10 7 células/ml) do tipo selvagem e alteradas geneticamente que expressavam duas classes de MES [cassete de ligação a ATP (ABC) e grande superfamília facilitador (MFS)] foram tratadas com PDT com e sem a adição de inibidores de sistema de efluxo. A absorção e a localização do FS no citoplasma foram conseguidas, utilizando microscopia confocal a laser. A associação da PDT com verapamil, inibidor da bomba de efluxo ABC, aumentou a absorção de AM e potencializou a inativação do fungo. Quando a PDT foi associada com INF, inibidor MFS, a captação de AM e inativação do fungo foram inibidas o que não era esperado. Os autores justificam que última descoberta pode ser explicada pela hipótese de que o canal MFS também pode servir como um mecanismo de absorção para AM. O estudo conclui que as bombas ABC estão diretamente relacionadas com o efluxo do AM do citoplasma celular. Tanto o influxo e efluxo de AM podem ser regulados pelos sistemas de MFS. O bloqueio da bomba MFS, antes da incubação com AM, pode diminuir a absorção e os efeitos da PDT. Um inibidor ABC poderia ser útil para potencializar a PDT em infecções de Candida albicans. Utilizando o AM, como FS, luz visível de baixa potência do laser InGaAlP (660 nm; 100 mw e 350 J/cm 2 ) por 98s, Pereira et al. (2011) avaliaram o efeito da terapia fotodinâmica (PDT) sobre a viabilidade e Candida albicans, S. aureus e S. mutans na forma de biofilme. Os biofilmes foram cultivados em discos de acrílico imersos em

58 57 caldo estéril de infusão de cérebro e coração (BHI) contendo 5% de sacarose, inoculados com suspensão microbiana (10 6 células/ml) e incubou-se durante 5 dias. No quinto dia, foram avaliados os efeitos do AM a uma concentração de 0,1 mg/ml, durante 5 min e laser AlGaInP (660 nm) durante 98 s. Diluições em série de dez vezes foram realizados e as alíquotas semeadas em ágar seletivo, que foram, então, incubadas durante 48 h. Posteriormente, a quantidade de UFC/mL (log 10 ) foram contados e analisados estatisticamente. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos discos tratados com PDT e dos grupos controles foi realizada. Observaram-se reduções significativas na viabilidade de todos os microrganismos expostos a PDT, mediada pelo corante AM. O biofilme formado por apenas um tipo de espécies foram mais sensíveis ao PDT (redução na viabilidade celular de 2,32 a 3,29 log 10 ) em comparação com os formados por dois e três espécies de microrganismos (redução na viabilidade celular de 1 a 2,44 log 10 ). Estes dados demonstram que a maior complexidade na composição dos biofilmes parece tornar os microrganismos mais resistentes a PDT. Micrografias de microscopia eletrônica de varredura sugeriram que a fotossensibilização letal ocorreu predominantemente nas camadas mais externas dos biofilmes. Os resultados mostraram que a PDT mediada pelo corante AM, pode ser uma abordagem útil para o controle de biofilmes orais. A curcumina (CUR), na concentração de 600 µm, foi fotoirradiada com luz de LED (440 a 460 nm; 22 mw/cm 2 ) por Dovigo et al., (2011b) com o objetivo de avaliar o efeito da PDT contra isolados clínicos de Candida albicans, Candida tropicalis e Candida glabrata, tanto em formas planctônicas e quanto de biofilmes. Alíquotas 100 µl de suspensões celulares de Candida (10 7 células/ml) foram transferidas individualmente para placas de microtitulação de 96 poços, em que foram adicionadas soluções a cumarina para resultar em concentrações finais de 5 (1,8), 10 (3,7) e 20 (7,4) µm (mg/l). Depois de um tempo de pré-irradiação de 20 min, a placa foi colocada no dispositivo de diodo emissor de luz e a iluminação foi realizada em 5,28; 18; 25,5; e 37,5 J/cm 2. Diluições em série de dez vezes a partir de alíquotas do conteúdo de cada poço foram obtidas e semeadas em placa de petri. Após incubação (37 o C e 48 h), a contagem de colônias foram quantificadas e as unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/ml) foram determinadas e transformadas em logaritmo (log 10 ). A concentração de CUR (20 µm) e fluências

59 58 leves (5,28 e 18 J/cm 2 ) foram as que apresentaram os resultados mais promissores contra culturas planctônicas e foram selecionadas para ser testado contra biofilmes de Candida. Quando foi utilizado 40 µm e fluência de18 J/cm 2 de CUR, a atividade metabólica de Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis e biofilmes foi reduzida em 85%, 85%, e 73%, respectivamente. A PDT, mediada por CUR, também diminuiu a biomassa do biofilme de todas as espécies avaliadas. Os resultados da presente investigação demonstraram que baixas concentrações CUR podem ser altamente eficazes para a inativação de isolados de Candida, quando associado com a excitação de luz. Já em 2012, Costa et al. avaliaram os efeitos da terapia fotodinâmica em culturas de Candida albicans nas formas planctônica e biofilme, utilizando os FSs, rosa bengala e eritrosina, ativados com luz LED. Sete espécies de origem clínica e uma cepa padão (ATCC 18804) foram usadas no estudo. As culturas planctônicas e biofilmes de cada Candida albicans foram submetidos às seguintes condições experimentais: (a) tratamento com rosa bengala e LED (RB+L+), (b) o tratamento com eritrosina e LED (E+L+) e (c) grupo controle, sem irradiação LED ou sem tratamento com FS (FS-L-). Após a irradiação das células planctônicas e biofilmes, as culturas foram semeadas em ágar dextrose Sabouraud (37 C a 48 h) para contagem de unidades formadoras de colónias (CFU/mL). Os biofilmes foram analisados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados revelaram uma redução significativa de 3,45 log 10 e 1,97 log 10 para as culturas planctônicas e <1 log 10 para biofilmes quando tratadas com PDT, mediada por eritrosina ou rosa bengala, respectivamente. Os dados do MEV revelaram que a PDT foi eficaz na redução e destruição de Candida albicans na forma de blastoconídeos e hifas. Os resultados mostram que eritrosina e rosa bengala com irradiação LED foi eficaz no tratamento de Candida albicans. Um FS natural, que é considerado uma droga da nova geração para PDT, denominado de Hipericina, foi utilizado por Rezusta et al. (2012) para avaliar os efeitos da PDT contra várias espécies de Candida. Para determinar possíveis efeitos colaterais do FS, avaliaram sua fototoxicidade aos queratinócitos (HaCaT) e aos fibroblastos dérmicos (hndf). Um efeito fungicida 3 log 10 foi observado para duas espécies de Cândida albicans, Cândida parapsilosis e Cândida krusei nas concentrações de hipericina de 0,625, 1,25, 2,5 e 40 µm, respectivamente, a uma

60 59 fluência de 18 J/cm 2 (lâmpada LED emitindo em 602 ± 10 nm). Para conseguir uma redução de 6 log 10, foi necessário uma dose de luz de 37 J/cm 2 e concentrações de hipericina significativamente mais elevados, tais como: 5 µm para Candida albicans; 320µM para C. parapsilosis e C. krusei. Os queratinócitos e fibroblastos podem ser preservados, mantendo a concentração de hipericina abaixo de 1 µm e a dose de luz inferior a 37 J/cm 2. Após concluir uma revisão dos artigos publicados sobre Inativação fotodinâmica antimicrobiana para controlar infeções por Candida albicans tanto na forma planctônica quanto de biofilme, Pereira Gonzales; Maisch (2012) concluíram que o aumento mundial de resistência aos antimicrobianos tem resultado na busca por terapias antimicrobianas alternativas, tal como a terapia fotodinâmica antimicrobiana para o tratamento de infecções por Candida albicans susceptíveis ao tratamento tópico. Segundo os autores, a ausência de genotoxicidade e mutagenicidade de fungos ou células humanas favorece a segurança da terapia em longo prazo. Observaram ainda que os estudos demonstram que nem o FS, nem as subsequentes reações localizadas, em virtude da fotoativação, podem causar danos aos tecidos circundantes ou perturbar a flora residual do tecido. As indicações promissoras desta terapia seria para erradicar infecções orais em uma única sessão principalmente em pacientes mais susceptíveis e particularmente propensos a desenvolver resistência, como HIV positivos ou doentes submetidos à quimioterapia. O desenvolvimento da resistência microbiana a fotossensibilização ainda está em debate. Se os microrganismos podem desenvolver resistência aos radicais de oxigênio, como por exemplo, o oxigênio singleto, é questionável, uma vez que o processo fotodinâmico é tipicamente multialvo e o mecanismo de ação é diferente do da maioria dos medicamentos antimicrobianos. A ação da fotoativação do AM, conjugado com nanopartículas de ouro, com luz laser de diodo (densidade de energia = 38,2 J/cm 2 ; 660- nm) foi avaliada como uma nova abordagem terapêutica para inibir biofilmes de Candida albicans. Ensaios antibiofilme, laser confocal e a microscopia eletrônica de varredura foram utilizados para investigar os efeitos do conjugado. As características físicas das nanopartículas de ouro (21 ± 2,5 nm e 0,2 mg/ml) e AM (20 µg/ml) de conjugação foram confirmadas por meio de técnicas físico-químicas e de microscopia eletrônica. Estes ensaios mostraram redução significativa do biofilme e efeitos adversos contra

61 60 células de Candida na presença do conjugado. O estudo espectroscópico de fluorescência confirmou a toxicidade contra o biofilme de Candida (KHAN, S. et al., 2012) Para Snell; Foster; Haidaris (2012), a aplicação clínica da PDT depende de estratégia para melhorar o poder inibição microbiana e minimizar os danos teciduais do hospedeiro. Para os autores supracitados, aumentar a sensibilidade dos agentes infecciosos para a PDT poderá alcançar estes objetivos, tais como interferir no metabolismo respiratório do fungo. A partir destes conceitos os pesquisadores avaliaram compostos de uso clínico para aumentar o estresse oxidativo causado pela PDT, contribuindo para formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). Utilizaram o FS catiônico meso-tetra (N-metil-4-pyridyl) porphine Tetra tosilato (MP- 1363) e luz visível a partir de uma caixa equipada com um banco lâmpadas fluorescente (1,0 J/cm 2 ; nm). Foram testados vários antifúngicos, miconazol, clotrimazol, cetoconazol, e fluconazol, para avaliar sua capacidade para aumentar a o efeito PDT in vitro. Apesar do miconazol e cetoconazol terem estimulados a produção de ROS, somente o miconazol potencializou a inativação das células de Candida albicans. Os dados sugerem que o miconazol poderia ser utilizado para aumentar a eficácia da PDT contra Candida albicans. Os biofilmes formados por leveduras oportunistas funcionam com um reservatório persistente de infecção e prejudicam o tratamento das doenças fúngicas. A inativação pela PDT foi testada em um modelo experimental de biofilme de Candida spp e de patógenos emergentes, como Trichosporon mucoides e Kodamaea ohmeri. Uma nanoemulsão catiônica de zinco 2,9,16,23-tetraquis (feniltio)-29h, 31H-ftalocianina (ZnPc) foi fotoativada com um laser GaAIAs (26,3 J/cm 2 ). A eficiência da inativação fotodinâmica foi avaliada por meio da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC/mL). Todos os biofilmes estudados foram suscetíveis a PDT com diferenças estatisticamente significativas. As cepas do gênero Candida foram mais resistentes à PDT do que os patógenos emergentes T. mucoides e K. ohmeri. Uma redução média de 0,45 log foi conseguida para biofilmes Cândida spp., e uma redução de 0,85 e 0,84, foram atingidos por biofilmes formados por T. mucoides e K. ohmeri, respectivamente. Assim, a PDT, mediada por ZnPc e um laser, reduziu o número de células nos biofilmes formados por espécies de

62 61 Candida albicans e não-candida albicans, bem os patógenos emergentes T. mucoides e K. ohmeri (JUNQUEIRA et al., 2012) Para avaliar a eficácia da PDT na desinfecção de próteses totais, Ribeiro et al. (2012) coletaram amostras de biofilme de 60 pacientes usuários de próteses, os quais foram aleatoriamente em quatro grupos experimentais de 15 indivíduos cada um. Estes grupos foram divididos de acordo com o tratamento recebido: indivíduos cujas próteses totais superiores foram pulverizadas com 50 e 100 mg/l de suspensão Photogem (grupos FS 50 e FS 100) e pacientes cujas dentaduras foram tratadas com 50 e 100mg/L de gel Fotogem (grupos P50G e P100G). As próteses com FSs foram deixadas no escuro durante 30 minutos (tempo de préirradiação) e, em seguida, irradiada com luz LED azul a 37,5 J/cm 2 por 26 min. Amostras das dentaduras foram tiradas com cotonete estéril antes (superfícies laterais esquerdas) e depois (superfícies do lado direito) da PDT. Todo o material microbiano foi diluído e semeado em meio seletivo para a Cândida spp., Staphylococcus spp. e Estreptococos mutans. Após incubação (48 h/37 C), o número de unidades formadoras de colónias (ufc/ml) foi contado. Os microrganismos cultivados em meios seletivos foram identificados utilizando métodos bioquímicos antes e depois da PDT. Nenhum crescimento após PDT foi observada em 60, 53, 47, e 40% das próteses dos P100G, P50G, FS100, e grupos FS50, respectivamente. Nos casos em que foi observada evidência de crescimento de microrganismos, os protocolos da PDT eliminaram mais de 90% dos microrganismos nas dentaduras. Este estudo clínico demonstrou que PDT foi eficaz para a desinfecção de próteses totais. Em 2013, Kato et al. realizaram um estudo cujo o objetivo foi avaliar se a exposição a PDT pode alterar as características de patogenicidade de células de Candida albicans. Diferentes métodos de análise foram empregados para avaliar o efeito da PDT, mediada pelo AM, sobre a capacidade de crescimento celular, sobre a formação de tubos germinativos e sobre o potencial para causar infecção sistêmica ou patogenicidade. Também foram avaliados a susceptibilidade de Candida albicans ao fluconazol e sua sensibilidade a diferentes agentes indutores de stress, como dodecilsulfato de sódio (SDS), a cafeína, o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 ), menadiona e NaCl. Candida albicans foi exposta a PDT subletal usando AM como um FS (0,05 mm por 10 min), combinada com um laser de diodo GaAIAs (λ

63 nm, 75 mw/cm 2, 9 a 27 J/cm 2 ). In vitro, avaliou-se os efeitos da PDT sobre crescimento de Candida albicans, formação de tubo germinativo, a sensibilidade para o estresse oxidativo e osmótico, a integridade da parede celular, e suscetibilidade fluconazol. In vivo, avaliou a patogenicidade de Candida albicans com um modelo de infecção sistêmica em rato. A sobrevivência dos animais foi avaliada diariamente. A PDT, com AM, reduziu a taxa de crescimento e a capacidade de Candida albicans para formar tubos germinativos em comparação com células não tratadas (P <0,05). A sobrevivência de ratinhos infectados sistemicamente com Candida albicans e pré-tratados com PDT foi significativamente aumentada em comparação com ratinhos infectados com levedura e não tratados (P <0,05). PDT aumentou a sensibilidade de Candida albicans ao sulfato de dodecilo de sódio, cafeína, e peróxido de hidrogénio. A concentração inibitória mínima (MIC) do fluconazol para Candida albicans também foi reduzida após a PDT. No entanto, nenhum desses parâmetros patogênicos foi alterado nas células filhas de Candida albicans submetidas à PDT. Estes dados sugerem que PDT pode inibir os fatores de virulência e reduzir in vivo a patogenicidade de Candida albicans. A ausência de alterações em células-filhas indica que os efeitos PDT são transitórios. A redução de valores de MIC para fluconazol sugere que este antifúngico pode ser combinado com PDT para o tratamento de infecções de Candida albicans. Com o objetivo de buscar alternativas para potencializar os efeitos da PDT e, assim, diminuir os feitos tóxicos da terapia as células eucarióticas humanas, Chien et al. (2013) avaliaram a capacidade da quitosana, um biopolímero policatiônico, para aumentar susceptibilidade de espécies de Candida á PDT. Culturas de Candida albicans e de Candida de origem clínica resistente ao fluconazol nas formas planctônicas e biofilme foram utilizadas no estudo. A quitosana, mesmo em baixas concentrações (0,25%), potencializou o efeito da PDT, mediada por azul de toluidina (TBO), em células planctônicas e biofilmes de Candida albicans, que foram incubadas com o quitosano durante 30 minutos antes da PDT. No entanto, a quitosana sozinha, sem a PDT, não apresentou atividade antimicrobiana significativa para os mesmo 30 minutos de incubação. Estes resultados sugerem que a quitosana só aumentou o efeito fungicida depois de as células terem sido danificadas pela PDT. O aumento da dosagem de quitosana ou do tempo de incubação prolongando reduziu completamente a viabilidade Candida albicans pela

64 63 PDT. Estes resultados indicam claramente que a combinação de quitosana com PDT pode ser abordagem antimicrobiana promissora para o tratamento de doenças infecciosas. Devido às características de biocompatibilidade e salinidade, a quitosana é bastante promissora para aumentar a eficácia da PDT para erradicar infecção por Candida albicans.

65 64 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral - Avaliar o efeito da terapia fotodinâmica na Inativação de células planctônicas de Candida albicans com terapia fotodinâmica empregando azul de metileno como fotossensibilizador. 3.2 Objetivos Específicos - Avaliar o efeito de diferentes concentrações (37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300 µg/m) de azul de metileno na inativação fotodinâmica de Candida albicans; - Avaliar a toxicidade do azul de metileno em diferentes concentrações de azul de metileno e ausência de luz laser em células planctônicas de Candida albicans; - Verificar o efeito da luz laser na viabilidade celular de Candida albicans; - Observar a relação entre o tempo de incubação (tempo de pré-irradiação) do azul e a fotoinativação de células planctônicas de Candida albicans.

66 65 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Tipo e Local do Estudo Esta pesquisa tratou-se de uma pesquisa experimental que foi realizada no laboratório do curso de biomedicina das Faculdades Integradas de Patos-FIP/ PB no período de abril a julho de Instrumentos Microrganismo e meio de cultura Foram utilizadas cepas de Candida albicans (ATCC10231) adquiridas da coleção de culturas tropicais (CCT) da fundação André Tosello (Figura 2). O certificado da cultura encontra-se no anexo A. Figura 2 - Cepa de Candida albicans utilizada no estudo. Fonte: Do autor Para a realização dos experimentos, utilizou-se o meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose - ASD (União Química, São Paulo, Brasil) com 5 µg/ml cloranfenicol, conforme preconiza Pereira et al. (2011). O ASD contendo 5 µg/ml de cloranfenicol é um meio seletivo para fungos e será usado nas semeaduras das placas de Petri após procedimentos experimentais envolvendo as culturas planctônicas. Para o preparo do meio de cultura, foram utilizados 65 g do pó para 1 L de água destilada, conforme a proporção

67 66 recomendada pelo fabricante. Após dissolução completa do meio de cultura, o béquer contendo a mistura foi levado à autoclave vertical para esterilização a 121 C por 15 minutos. Após a esterilização, ainda na fase líquida, cerca de 20 ml do meio foi vertido em placas de Petri estéreis descartáveis, mantendo proximidade de 10 cm da chama do bico de Bunsen (Figura 3). As placas de Petri foram individualmente fechadas e mantidas em temperatura ambiente até a completa solidificação do meio de cultura. Após a solidificação, todas as placas de Petri foram devidamente identificadas e datadas. Figura 3 - Preparo do meio de cultura nas placas de Petri Fonte: Do autor Preparo do fotossensibilizador (FS) e tempo de incubação O agente FS (Figura 4A) utilizado foi o azul de metileno (AM) PA (Sigma- Aldrich, São Paulo, Brasil). Soluções de estoque a partir de AM PA, nas concentrações 75 µg/ml; 150 µg/ml; 300 µg/ml e 600 µg/ml (Figura 4B) foram preparadas por dissolução do pó em solução salina estéril (0,85% de Na Cl) em ph 7 (SOUZA et al., 2006). As soluções com o FS foram filtradas através de uma membrana de filtro estéril de 0,22 mm e armazenadas em recipiente de cor âmbar por no máximo 14 dias a 4 C no escuro antes de usar. Durante o experimento, em poços de placas de microtitulação, 100 µl das soluções de estoque do FS, em temperatura ambiente, foram novamente diluídas pelo acréscimo 100 µl de suspenção de Candida albicans em solução salina a 0,85% (QUEIROGA et al., 2011), resultando em um volume final de 200 µl. Como o volume do poço é duplicado (100 µl de FS e 100 µl de suspenção celular), a concentração do FS é reduzida a metade: 37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300 µg/ml (concentrações de trabalho)

68 67 Figura 4 - Em A, Azul de Metileno forma de apresentação em pó. Em B, o corante manipulado nas concentrações testes. Fonte: Do autor Em seguida, o corante AM ficou em contado com as células de Candida albicans, no escuro e a temperatura ambiente, antes da iluminação, por um período de incubação de 1, 5, 10 e 20 minutos (tempo de pré-irradiação). Com este propósito, as placas ficaram em um ambiente sem luminosidade e evolvidas por uma lâmina de papel alumínio, como pode ser observado na Figura 5 abaixo. Figura 5 - Placa de microtitulação na ausência de luz e envolvida por uma lâmina de papel alumínio. Fonte: Do autor

69 Fonte de irradiação para a terapia fotodinâmica (PDT) A fonte emissora de luz (Figura 6A) foi um Laser semicondutor portátil (Laser DUO, GaAlAs, InGaAlP, λ880nm e λ660nm, MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP Brasil). Este aparelho apresenta potência de saída constante em 100 mw e área do feixe de laser de 3 mm 2, a qual coincide com a área da abertura de cada um dos 96 poços de fundo em U das placas de microtitulação (Figura 7) utilizadas neste estudo. Para o protocolo de irradiação, o equipamento foi ajustado para um comprimento de onda de 660 nm, que correspondente à faixa de absorção do AM, e para o tempo de iluminação de 128s, resultando em uma influência de energia de 426 J/cm 2. Antecipadamente à realização dos experimentos, o laser foi calibrado com auxílio de um dispositivo (Check MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP Brasil) como mostra a figura 6B. Figura 6 - Em A, aparelho de laser e, em B, calibração da potência do aparelho no comprimento de onda de 660 nm. Fonte: Do autor

70 69 Figura 7 - Placas de microtitulação estéreis com 96 poços Fonte: Do autor Antes de cada irradiação, a ponteira do aparelho ficou imersa em solução de digluconato de clorexidina a 2% por 5 min para promover a sua desinfecção. Após este período, o agente antimicrobiano era removido do dispositivo por meio de irrigação com 10 ml de solução salina estéril (0,9%) e secado com gaze autoclavada (Figura 8). Figura 8 - Desinfecção da ponteira do aparelho Fonte: Do autor

71 Preparo do inóculo de Candida albicans Conforme pode ser observado na Figura 9, células de Candida albicans (ATCC ) foram subcultivadas a partir de frascos estoques em Agar Sabouraud Dextrose ASD sob condições aeróbicas a 37 o C. Após 24 h de incubação, uma amostra de colónias foi removido da superfície do agar da placa e suspensas em solução fisiológica estéril a 0,85 % de NaCl (MUNIN et al., 2007) a uma densidade celular de 10 6 células viáveis/ml. Após agitação com o auxílio do aparelho Vortex (Vision ) durante 2 minutos, a turbidez da suspensão de células foi ajustada com auxílio de um espectrofotômetro a 530 nm para obter suspensões com densidade óptica de 0,284, que corresponde a uma concentração de fungos de 10 6 unidades formadoras de colônias por ml (UFC/mL) (PEREIRA et al., 2011; QUEIROGA et al., 2011; KATO et al., 2013)

72 Figura 9 - Preparação do inóculo de Candida albicans com densidade celular de 106 unidades formadoras de colônias por ml (UFC/mL) Fonte: Do autor 71

73 Condições Experimentais Todas as condições testadas foram realizadas no escuro à temperatura ambiente e em condições assépticas no interior de uma câmara de fluxo laminar (Figura 10). As placas microtitulação foram cobertas com lâminas de papel alumínio para impedir a penetração da luz do ambiente. Figura 10 - Câmara de fluxo laminar, onde foram realizados os experimentos. Fonte: Do autor Grupo Terapia fotodinâmica (Grupo PDT) No grupo terapia fotodinâmica (Figura 11), grupo PDT (FS+L+), as cepas de Candida albicans foram sensibilizadas com o FS, azul de metileno, e expostas ao laser (L). Com agitação constante, alíquotas de 100µL da suspensão do fungo (10 6 UFC/mL) foram transferidas individualmente para um poço de uma placa de microdiluição com 96 poços. Em seguida, foi acrescentado o mesmo volume de AM (100µl) em uma das concentrações testadas (75; 150, 300 e 600 µg/ml), resultando em um volume final de 200 µl por cada poço e concentrações finais de 37,5µg/ml (grupo PDT AM-37,5µg/ml), 75µg/ml (grupo PDT AM-75µg/ml), 150µg/ml (grupo PDT AM-150µg/ml) e 300µg/ml (grupo PDT AM-300µg/ml). Posteriormente, as placas contendo as suspensões resultantes foram deixadas em repouso, no escuro,

74 73 durante um dos tempos de incubação (1, 5, 10 e 20 min.). Após cada tempo de préirradiação, as placas foram abertas e as células da levedura foram continuamente irradiadas, a partir do topo da placa de microtitulação, com um diodo laser (comprimento de onda de 660nm; potencia de 100mW e dose de 426 J/cm 2 ) por 128s (Figura 12). O conteúdo dos poços foi devidamente homogeneizado antes da iluminação e da amostragem. Figura 11 - Ilustração esquemática do grupo terapia fotodinâmica Fonte: Do autor A ponteira do equipamento foi posicionada perpendicularmente a abertura dos poços e a irradiação foi efetuada com ângulo de incidência de Para evitar um possível efeito cumulativo devido ao espalhamento da irrradiação, cada amostra será irradiada e coletada individualmente (QUEIROGA et al., 2011).

75 74 Figura 12 - Em A, Transferência de alíquotas de 100µL da suspensão do fungo para o poço da placa de microtitulação. Em B, transferência do mesmo volume de AM para o poço. Em C, placa no escuro durante o período de incubação e, Em D, irradiação do conteúdo do poço. Fonte: Do autor Grupo Azul de Metileno (Grupo AM) No grupo AM (Figura 13), grupo AM, o efeito do FS sozinho, na inativação de células de Candida albicans, foi testado pela a aplicação da solução de AM seguindo o mesmo protocolo estabelecido para o grupo PDT (FS+L+), principalmente com relação ao volume (100µL), a concentrações testadas (37,5; 75; 150 e 300 µg/ml) e tempos de incubação (1, 5, 10 e 20 min.) com ausência de luz, porém sem o tratamento com o laser. Neste grupo foi possível avaliar a toxicidade das diferentes concentrações de AM de acordo com o tempo de contato direto.

76 75 Figura 13 - Ilustração esquemática do grupo Azul de Metileno Fonte: Do autor Grupo Laser (Grupo L) No grupo laser (Figura 14), grupo L, as cepas de Candida albicans foram expostas à luz laser (L), mas não foram sensibilizadas pelo FS. Com este grupo foi possível avaliar o efeito da luz laser isoladamente na inativação das células da levedura. Alíquotas de 100µL da suspensão celular foram transferidas individualmente para um dos poços de uma placa de microtitulação. Em seguida seguir, o mesmo volume de solução salina 0,85% estéril foi transferido para o poço. O sistema de ensaio foi mantido no escuro pelos mesmos tempos de incubação dos grupos anteriores (1, 5, 10 e 20 min.). Após cada período de pré-irradiação, as placas foram abertas e o mesmo protocolo de iluminação do grupo PDT foi aplicado.

77 76 Figura 14 - Ilustração esquemática do grupo Laser Fonte: Do autor Grupo solução salina (Grupo SS) No grupo solução salina (Figura 15), grupo SS, as células de Candida albicans não receberam nenhum tratamento, ou seja, nem foram sensibilizadas pelo FS, nem foram expostas à luz. Alíquotas de 100 µl da suspensão (10 6 UFC/mL) foram transferidas para os poços da placa de microtitulação e, em seguida, o mesmo volume de solução salina a 0,85% foi depositado no poço e a placa ficou é em repouso no escuro pelos mesmos tempos de incubação dos grupos anteriores (1, 5, 10, 20 e 30 min.).

78 77 Figura 15 - Ilustração esquemática do grupo solução salina Fonte: Do autor Os resultados obtidos com as culturas dessas amostras foram utilizados como parâmetro para comparação com aqueles que foram obtidos com as culturas das amostras submetidas às condições experimentais Avaliação da viabilidade das células de Candida albicans Para todas as condições avaliadas, foram realizadas diluições seriadas de 1:3 a partir das amostras contidas nos poços das placas. Para isso, uma alíquota de 100 µl foi removida de cada poço e transferida para um tubo de ensaio contendo 900 µl de solução salina (0,85%) autoclavada. Este tubo foi agitado vigorosamente em agitador de tubos (Vortex - Vision ) e uma nova alíquota de 100 µl foi removida do mesmo e colocada em outro tubo de ensaio contendo 900 µl de solução salina autoclavada. Esse procedimento foi realizado três vezes para cada amostra e, desta

79 78 forma, as diluições seriadas de 10-1 a 10-3 foram obtidas. Foram utilizadas as diluições seriadas (10-1, 10-2, e 10-3 ) para a realização da semeadura nas placas de Petri contendo o meio de cultura Ágar Sabouraud Dextrose. A seguir, alíquotas de 25 µl de cada diluição seriada foram pipetadas em duplicata. Adicionalmente, alíquotas de 25 µl foram removidas do poço das placas e transferidas diretamente para uma da placa de Petri, sem a realização de diluição (Figura 16). Uma alça de Drigalsky estéril foi utilizada para espalhar a solução sobre o meio de cultura na placa. Também os procedimentos de semeadura foram realizados em duplicata. Após 48 horas de incubação a 37 o C, as placas de Petri referentes às amostras das condições experimentais avaliadas foram submetidas à contagem de colônias. Para este procedimento, a quantificação das colônias foi realizada e os números de unidades formadoras de colônias foram calculados.

80 Figura 16 - Ilustração esquemática das diluições seriadas pipetadas em duplicata Fonte: Do autor 79

81 Técnica de Contagem das UFC/mL A leitura das placas foi efetuada pela contagem padrão de colônias de Candida albicans (Unidade Formadora de Colônias - UFC/mL) com o auxílio de um contador de colônias (Figura 17). Figura 17 - Contagem das UFC com auxílio de um contador de colônias Fonte: Do autor Para a contagem, selecionaram-se placas que continham um número de colônias que se encontrava dentro do intervalo de precisão e repetibilidade de 30 a 300 colônias conforme o método de Swanson; Petran; Hanlin (2001). Para cada diluição (10-1 ; 10-2 e 10-3 ), os resultados do número de colônias foi obtido pela média aritmética dos resultados das placas em duplicata multiplicada pela diluição correspondente (10, 100 ou 1000). O resultado de cada grupo foi encontrado por meio da média aritmética das três diluições. Em seguida, para encontrar o número UFC por ml, converteu-se resultado de cada grupo a partir da quantidade inoculada de 25µL para 1 ml, dividindo o resultado por 0,025, obtendo o resultado final de UFCs/mL em potência de 10. Para a análise da contagem de UFC/ml de Candida albicans, optou-se por transformar os valores em potência de 10, utilizando-se o logarítimo decimal deste número para a análise estatística, como pode ser observado no exemplo abaixo:

82 81 Exemplo: Nas situações em que todas as placas apresentaram menos que 30 colônias, o resultado foi expresso pelo número de colônias da placa de menor diluição. Quando todas as placas apresentaram mais de 300 colônias na maior diluição e foi possível realizar a contagem, o resultado foi encontrado multiplicando o valor do número de colônias em cada placa pelas respectivas diluições e, em seguida, calculando a média aritmética. Quando o número de colônias foi excessivamente alto para contar, escolheu-se uma porção representativa da distribuição das colônias em toda placa e estimou-se o número de colônias presentes (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001) Análise estatística Os resultados dos log 10 (UFC/mL) para cada condição testada foram comparados utilizando teste estatístico Kruskal-Wallis e no caso de diferença significativa foram utilizadas comparações múltiplas do referido teste. Valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos. A escolha do teste Kruskal-Wallis foi devido ao número de grupos. A margem de erro utilizada nas decisões dos testes estatísticos foi de 5%. Os dados foram digitados na planilha EXCEL e o programa utilizado para obtenção dos cálculos estatísticos foi o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 21.

83 82 5 RESULTADOS Os resultados desta pesquisa foram expressos através das medidas estatísticas: média, desvio padrão (DP) e mediana. Na Tabela 1, apresentam-se as estatísticas do logaritmo decimal (log 10 ) do número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) para cada grupo controle em relação ao tempo de incubação. Ao comparar os resultados da contagem de UFC/ml entre os grupos que avaliaram a toxicidade no escuro do azul de metileno (Grupo AM) e da luz na dose empregada (Grupo laser) com o grupo que não recebeu nenhum tratamento (Grupo solução salina), observou-se que somente o AM ou somente a luz não exerceu efeito inibitório contra as células de Candida albicans. Tabela 1 Comparação da média e desvio padrão do log 10 do número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) para os grupos controles nos diferentes tempos de incubação. Tabela 1- Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) para os grupos controles nos diferentes tempos de incubação Tempo de incubação (minutos) Grupos Valor de p Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Sol. S. 5,68 ± 0,79 (5,89) (A) 5,51 ± 0,67 (5,60) (A) 5,54 ± 0,72 (5,60) (A) 5,62 ± 0,75 (5,74) (A) p (1) = 0,955 Laser 5,62 ± 0,75 (5,78) (A) 5,57 ± 0,71 (5,69) (A) 5,47 ± 0,64 (5,56) (A) 5,49 ± 0,66 (5,57) (A) p (1) = 0,937 AM 5,68 ± 0,71 (5,87) (A) 5,58 ± 0,64 (5,69) (A) 5,51 ± 0,59 (5,60) (A) 5,60 ± 0,65 (5,72) (A) p (1) = 0,699 Valor de p p (1) 0,05 p (1) 0,05 p (1) 0,05 p (1) 0,05 (*): Diferença significativa ao nível de 5,0%. (1): Através do teste de Kruskal Wallis. Obs.: Se todas as letras entre parênteses não são iguais, comprova-se que não houve diferença significativa entre as avaliações correspondentes pelas comparações pareadas do referido teste. Conforme pode ser observado no gráfico 1, na ausência de luz, o aumento da concentração do corante AM e do tempo de contato deste fotossensibilizador com as células do fungo (tempo de pré-irradiação ou de incubação) também não reduziu a

84 83 viabilidade celular da cepa de Candida albicans em comparação o grupo controle (p > 0,05). (*): Diferença significativa ao nível de 5,0%. Teste de Kruskal Wallis. Obs.: Se todas as letras são iguais, comprova-se que não houve diferença significativa entre as avaliações correspondentes pelas comparações pareadas do referido teste. Figura 18 - Avaliação do efeito citotóxico das concentrações (37,5; 75; 150 e 300µg/mL) de azul de metileno, na ausência de luz, com tempos de incubação de 1, 5, 10 e 20 min. A partir de 5 min de incubação, os grupos irradiados com luz laser, associada a concentrações de 75, 150 e 300 µg/ml de azul de metileno como fotossensibilizador (grupo PDT AM), apresentaram uma menor média no valor de log 10 UFC/mlL em relação aos grupos tratados com azul de metileno sem iluminação (p 0,05) (Tabela 2). No grupo PDT AM, com azul de metileno na concentração 37,5 µg/ml, não foi observada diferença significante no tempo de incubação de 5 min (p = 0,089), apresentando efetividade apenas após 10 min de incubação. Nenhuma das concentrações de AM testadas inibiu o crescimento de Candida albicans no tempo de incubação de 1 minuto. Não houve diferença significativa entre os tempos de incubação de 10 e 20 min em todas as concertações de AM avaliadas. No gráfico 2, observam-se que a redução na média de log 10 UFC/ml foi mais acentuada nos grupos PDT AM-37,5µg/mL, com 10 min incubação; PDT AM- 75µg/ml, PDT AM-150µg/ml, em 5,10 e 20 min de incubação, e PDT AM-300µg/ml (com 10 e 20min de incubação). Esta redução foi significativa (p = 0,019) quando

85 84 comparada estes grupos com todos os grupos PDT AM nos tempos de 1 min e em 5 min de incubação para os grupos PDT AM - 37,5µg/ml e PDT AM- 300µg/ml. Tabela 2 - Comparação da média e desvio padrão do log10ufc/ml entre os grupos AM e PDT AM segundo as concentrações de AM e tempos de incubação Tempo de incubação (minutos) Concentração Grupo Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) 37,5 µg/ml 5,68 ± 0,79 (5,88) AM 5,55 ± 0,69 (5,71) 5,46 ± 0,64 (5,55) (A) 5,66 ± 0,79 (5,78) (A) AM PDT 2,39 ± 2,77 (2,30) 3,70 ± 2,49 (4,76) 1,02 ± 2,04 (0,00) (B) 3,55 ± 2,39 (4,48) (B) Valor de p p (1) = 0,053 p (1) = 0,089 p (1) = 0,007* p (1) = 0,030* 75 µg/ml 5,71 ± 0,81 (5,94) AM 5,54 ± 0,68 (5,67) (A) 5,49 ± 0,65 (5,61) (A) 5,56 ± 0,69 (5,72) (A) AM PDT 3,94 ± 2,67 (4,95) 2,37 ± 2,74 (2,26) (B) 2,14 ± 2,48 (2,12) (B) 2,34 ± 2,71 (2,21) (B) Valor de p p (1) = 0,104 p (1) = 0,031* p (1) = 0,008* p (1) = 0,016* 150 µg/ml 5,66 ± 0,78 (5,84) AM 5,64 ± 0,77 (5,76) (A) 5,57 ± 0,68 (5,76) (A) 5,65 ± 0,77 (5,78) (A) AM PDT 3,91 ± 2,65 (5,04) 2,10 ± 2,42 (2,04) (B) 2,32 ± 2,69 (2,17) (B) 2,21 ± 2,56 (2,04) (B) Valor de p p (1) = 0,298 p (1) = 0,012* p (1) = 0,014* p (1) = 0,031* 300 µg/ml 5,69 ± 0,80 (5,87) AM 5,61 ± 0,73 (5,76) (A) 5,53 ± 0,65 (5,70) (A) 5,55 ± 0,66 (5,75) (A) AM PDT 3,94 ± 2,68 (4,94) 3,71 ± 2,53 (4,64) (B) 2,30 ± 2,67 (2,13) (B) 2,22 ± 2,59 (2,04) (B) Valor de p p (1) = 0,163 p (1) = 0,020* p (1) = 0,017* p (1) = 0,032* (*): Diferença significativa ao nível de 5,0%. (1): Através do teste de Kruskal Wallis com comparações múltiplas do referido teste. Obs.: Se todas as letras entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre concentrações correspondentes.

86 (*): Diferença significativa ao nível de 5,0%. Teste de Kruskal Wallis com comparações múltiplas do referido teste Figura 19 - Comparação da média do log10ufc/ml entre os grupos PDT AM e grupos controles 85

87 86 6 DISCUSSÃO As propriedades terapêuticas da luz têm sido estudadas há anos, mas sua aplicação com finalidade antimicrobiana é relativamente mais recente (ALLISON; MOTA; SIBATA, 2004). Os estudos nesta área são motivados principalmente pelos casos de resistência aos antimicrobianos convencionais (TEICHERT et al., 2002; DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008; DOVIGO et al, 2011b; KHARKWAL et al., 2011; LAM et al., 2011; PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Estratégias antimicrobianas convencionais tornaram-se cada vez mais ineficazes devido ao surgimento de resistência a múltiplas drogas entre os microrganismos patogênicos. A necessidade de superar essas deficiências provocou a exploração de tratamentos alternativos e abordagens não convencionais para o controle de infecções microbianas (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Atualmente, o tratamento antimicrobiano a base de luz é denominado de terapia fotodinâmica (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007; RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010; KATO et al., 2013), que utiliza um corante fotossensível, que na presença de oxigênio, produz radicais reativos letais para os microrganismos (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; KONOPKA; GOSLINSKI, 2007; DAI et al., 2011; LYON et al., 2011; HUANG et al., 2012; PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Candida albicans é um patógeno oportunista mais comum na cavidade bucal (SILVA MARTINS et al., 2011). Pode causar infecções locais e sistêmicas (MUNIN et al., 2007; MITRA et al., 2011) e está associada principalmente a imunodepressão (MANG; MIKULSKI; SALA, 2010). O aumento da resistência antifúngica muitas vezes diminui a eficácia das terapias convencionais (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012). Vários trabalhos, que avaliaram espécies de Candida resistente azólicos, observaram que estas cepas eram sensíveis a PDT (JACKSON et al., 1999; CHABRIER-ROSELLÓ et al., 2008; DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008; MANG; MIKULSKI; SALA, 2010; DOVIGO et al., 2011a; LYON et al., 2011). A aplicação do fotossensibilizador e da luz especificamente no local afetado pela candidíase reduz drasticamente os efeitos colaterais locais e sistêmicos (BLISS et

88 87 al., 2004), fazendo com que a terapia fotodinâmica possa ser vista como um tratamento promissor contra Candida albicans (PELOI et al., 2008; CHIEN et al., 2013). As fontes de luz utilizadas com mais frequência na PDT contra Candida albicans foram o LED (PELOI et al., 2008; DOVIGO et al., 2010; DOVIGO et al., 2011, MIMA et al., 2011) e o laser de baixa intensidade, destacando-se o laser de diodo (TEICHERT at al., 2002; SOUZA et al., 2006; MUNIN et al.; 2007; GIROLDO et al., 2009; QUEIROGA et al., 2011). Nesta pesquisa foi utilizado laser de diodo da MM OPTICS (Laser DUO ) que, por ser portátil e possuir bateria, apresenta uma maior versatilidade de manuseio sem dependência de fonte de energia, podendo ser aplicado a pacientes em ambientes doméstico, ambulatorial, unidades de saúde da família ou em unidades de terapia intensiva. Os três componentes principais da PDT são a luz visível, o FS e oxigênio (DAI et al., 2012). Em função do fato de absorverem luz com elevada eficiência, em alguma região do espectro visível, alguns dos FSs são capazes de induzir ou participar de reações fotoquímicas (MACHADO, 2000) e produzir moléculas reativas de oxigênio (CALZAVARA-PINTON; VENTURINI; SALA, 2005; KONOPKA; GOSLINSKI, 2007; CARVALHO; FELIPE; COSTA, 2009; (PEREIRA GONZALES; MAISCH, 2012; SILVA MARTINS et al., 2011; HUANG et al., 2012). O azul de metileno foi o fotossensibilizador utilizado neste estudo porque é um corante de baixa toxicidade com forte absorção da luz visível em comprimentos de onda maiores do que 620 nm (TEICHERT et al., 2002). É utilizado com diferentes finalidades na microbiologia e farmacologia há bastante tempo e, ultimamente, tem sido aplicado na PDT como droga fotossensibilizante em associação com uma fonte de luz contínua (TARDIVO at al., 2005). Para que o fotossensibilizador possa ser fotoativado pelo laser é necessário que a luz aplicada apresente um comprimento de onda específico (TEICHERT et al., 2002; LYON et al., 2011). Utilizou-se neste estudo a luz vermelha com comprimento de onda de 660 nm que foi ajustada no aparelho antes da iluminação. Este comprimento de onda corresponde ao espectro de absorção do azul de metileno.

89 88 Os estudos de Teichert at al. (2002); Souza et al. (2006); Munin et al. (2007); Peloi et al. (2008); Giroldo et al. (2009); Souza et al. (2010); Martins et al. (2011); Pupo et al. (2011); Queiroga et al. (2011); Silva Martins (2011), Dai et al., (2011); Pereira et al.(2011); Khan et al. (2012) e Kato et al., (2013) estudaram os efeitos da terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de Candida albicans utilizando o azul de metileno, como fotossensibilizador. Os resultados destes estudos comprovaram o efeito antifúngico desta modalidade de tratamento. No entanto, alguns aspectos ainda precisavam ser mais bem esclarecidos, antes de recomendá-la para terapia clínica. Há necessidade de determinar protocolos com parâmetros bem definidos, como a dosimetria adequada do FS e da luz e o tempo em que o corante deve permanecer em contato com o microrganismo (KHARKWAL et al., 2011). Com o objetivo de potencializar o efeito da PDT em um menor tempo de trabalho sem prejuízo na qualidade do tratamento, testaram-se diferentes tempos de incubação e concentrações de azul de metileno. A hipótese era descobrir qual o melhor custo-benefício para PDT em relação à concentração do azul de metileno e o tempo em que esta sustância necessitaria ficar em contato com as células de Candida albicans para produzir um efeito antimicrobiano satisfatório. Como o estudo apresentava muitas vaiáveis (quatro concentrações de AM e quatro tempos de incubação), optou-se por realizar um estudo in vitro. O modelo experimental escolhido foi placas de microtitulação com 96 poços de fundo em U. Esta metodologia tem sido bastante utilizada nas pesquisas que avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT sobre microrganismo na forma planctônica a partir de uma suspenção celular (MUNIN et al., 2007; GIROLDO et al., 2009; SOUZA et al., 2010; PUPO et al., 2011; QUEIROGA et al., 2011). O efeito fotodinâmico depende da concentração do FS empregado, combinado com os parâmetros de irradiação que ativam o corante (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010; KATO et al., 2013). Os estudos que avaliaram o efeito da PDT sobre Candida albicans, utilizaram diferentes concentrações de azul de metileno, desde 10 µg/ml (GIROLDO et al., 2009) a 500 µg/ml (TEICHERT at al., 2002) e o tempo de incubação mais utilizado foi 5 mim (SOUZA et al., 2006; QUEIROGA et al., 2011; PEREIRA et al., 2011). Assim, para responder a hipótese de que o aumento da concentração e do tempo de incubação potencializaria o efeito

90 89 da PDT, utilizaram-se neste estudo as concentrações de 37,5, 75, 150 e 300 µg/ml e os tempos de incubação de 1, 5, 10 e 20 min. O fato de a maioria dos FSs serem tanto fluorescente, quanto fotoquimicamente ativo, permite que várias estratégias e protocolos possam ser combinados na terapia fotodinâmica. O fator mais importante que regula os resultados da PDT é forma como o FS interage com as células no tecido ou lesão alvo, e o aspecto chave desta interação está relacionado à localização intracelular do FS (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004). O tempo de incubação é necessário para permitir que a droga possa ser absorvida pelo microrganismo e acumular-se nas estruturas celulares (LYON et al., 2011), como mitocôndrias, lisossomos, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e membrana plasmática (CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; LAM, M et al., 2011). Durante a irradiação é necessário que o FS já esteja localizado no interior da célula, pois o oxigénio singleto, formado após a aplicação da luz, apresenta difusão mínima (100nm) e efeito citotóxico apenas no local onde é produzido (RYSKOVA; BUCHTA; SLEZAK, 2010). Assim como foi observado nos estudos de Wilson; Mia (1993); Souza et al. (2006); Souza et al. (2010); Queiroga et al. (2011), a irradiação com luz laser de Candida albicans, na ausência de AM, não apresentou influência sobre a viabilidade dos microrganismos. Já na ausência de luz, o azul de metileno não apresentou, em nenhuma das concentrações testadas, efeito citotóxico sobre as células de Candida albicans, corroborando com os estudos citados acima. Tanto o fotossensibilizador, quanto a luz, são relativamente inofensivos por si só, mas quando combinados, na presença de oxigênio, causam destruição seletiva na área afetada (MACHADO, 2000; GIROLDO et al., 2009; DAI et al., 2012). Segundo Bliss et al. (2004); Ryskova; Buchta; Slezak, (2010); Pereira Gonzales; Maisch, (2012), os agentes fotossensibilizadores exibem nenhuma ou mínima toxicidade inerente e o efeito citotóxico somente ocorre após a sua iluminação com luz de comprimento de onda específico. A fotoativação do AM, na concentração 37,5 µg/ml, apenas reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) quando foi incubado por um período de 10 (p= 0,007) e 20 min (p= 0,03), mas não houve

91 90 diferença de um tempo para outro (p = 0,286). Nas concentrações de 75, 150 e 300 µg/ml, a redução das UFC/mL foi significativa a partir de 5 min de incubação e também não houve diferença entre os tempos. Com estes resultados, pode-se observar que o aumento da concentração de 37,5 para 75 µg/ml resultou em um maior efeito da terapia fotodinâmica no tempo de incubação de 5 min, corroborando com as pesquisas de Munin et al. (2007); Giroldo et al. (2009). No entanto, este resultado não foi observado nos tempos de incubação de 10 e 20 min, em que o aumento da concentração não resultou em efeito antimicrobiano adicional a PDT, o que pode está relacionado as baixas concentrações de AM testadas. No estudo de Teichert at al. (2002), a irradiação com laser de diodo (275 J/cm 2 ) de azul de metileno nas concentrações de 250, 275, 300, 350 e 400 µg/ml, após 10 min de incubação, reduziu o crescimento Candida albicans, mas também não houve diferença entre elas. Já nas concentrações de 450 e 500 µg/ml de AM, a Candida Candida albicans foi totalmente eliminada. No tempo de incubação de 1 min, não foi observado redução significativa no número de UFC/ml para nenhuma das concentrações testadas. Os piores resultados encontrados nos tempos de incubação menores que 5 min podem está relacionados a pouca absorção do fotossensibilizador, produzindo reduções de UFC/mL modestas, mesmo em altas concentrações do fotossensibilizador (BLISS et al., 2004). Assim, de acordo com os parâmetros deste estudo e com a relação do custobenefício em relação à concentração da droga e o tempo clínico do procedimento, os protocolos de PDT mais eficazes foram os que utilizaram o tempo de incubação de 5 min e as concentrações de azul de metileno de 75µg/ml e 150 µg/ml. Utilizando um tempo de incubação de 5 min e concentrações de azul de metileno de 50µg/ml, 100µg/ml e 150 µg/ml, Giroldo et al. (2009); Pereira et al. (2011) e Queiroga et al. (2011) respectivamente observaram redução significativa na viabilidade celular de espécies de Candida albicans. Ao avaliar os estudos que aplicaram o azul de metileno como fotossensibilizador, observou-se uma grande carência de estudos clínicos controlados e randomizados, utilizando o tratamento antifúngico contra Candida albicans por meio da terapia fotodinâmica o que, apesar dos estudos em animais e in vitro serem muito promissores, impossibilita a indicação clínica desta terapia com base na Odontologia baseada em evidência científica. Assim, a terapia fotodinâmica

92 91 carece que estudos clínicos sejam desenvolvidos para dar-lhe uma sustentação e aplicabilidade terapêutica. A limitação deste estudo foi o fato de utilizarmos apenas uma única espécie de Candida. No entanto, como esta pesquisa apresentava muitas variáveis e vários protocolos foram testados, está metodologia atendeu aos objetivos iniciais para o experimento. Outros trabalhos poderão ser desenvolvidos utilizando este método para avaliar o efeito da PDT contra todas as espécies de Candida ou em estudo clínico.

93 92 7 CONCLUSÕES A terapia fotodinâmica reduziu o número de UFC/ml Candida albicans, apresentando efeito antifúngico contra este microrganismo. O fotossensibilizador azul de metileno não apresentou citotoxicidade no escuro sobre Candida albicans em nenhuma das concentrações ou tempos de incubação testados; A luz laser não alterou a viabilidade celular de Candida albicans na ausência do fotossensibilizador; Os tempos de incubação de 5, 10 e 20 min apresentaram melhores resultados na redução no número de log 10 UFC/ml, porém este resultado está diretamente relacionado com a concentração de azul de metileno aplicada.

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100 ANEXO A Certificado da cultura utilizada no estudo 99