IV Seminário de Iniciação Científica

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1 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE CATTLEYA WALKERIANA E SHOMBURGKIA CRISPA Gislene Côrrea Sousa 1,4, Maria Rita de Cássia Campos 2,4, Pollyanna Lourenço Clemente 3,4 1. Bolsista PBIC/UEG 2. Pesquisadora Orientadora 3. Voluntário Iniciação Científica PVIC/UEG 4. Curso de Ciências Biológicas, Unidade Universitária de Morrinhos, UEG RESUMO Este trabalho teve como objetivo adequar um protocolo para germinação in vitro das espécies de Cattleya walkeriana e Shomburgkia crispa. Foram coletadas cápsulas de onde se retiraram as sementes, estas passaram por um processo de desinfestação em álcool 70% e hipoclorito 30% após, foram enxaguadas sucessivas vezes em água destilada autoclavada. Em seguida, as sementes foram inoculadas em meio de cultura para semeadura e mantidas por sete dias no escuro. Aos 15 dias de cultivo foram observadas estruturas globulares verdes em ambas espécies. No entanto, as espécies apresentaram respostas distintas quanto ao número de protocormos e plântulas. Foi obtida uma média de 7,6 e 1,8 plântulas por unidade experimental para C. walkeriana e S. crispa, respectivamente. O protocolo utilizado para propagação in vitro apresentou-se eficiente para C. walkeriana havendo necessidade de otimização para S. crispa na conversão do estádio de protocormos em plântulas. Palavras-chave: Semeadura in vitro, orquídeas, protocormos Introdução A família Orchidaceae está entre uma das maiores representantes das famílias floríferas, englobando quase um sétimo das existentes no planeta (Suttleworth et.al., 1997). Esta família é composta por aproximadamente 725 gêneros, aproximadamente espécies e vários híbridos distribuídos em diversos hábitats (Cronquist, 1981, Dressler, 1993, Braga, 1977; Ribeiro et al., 1999). De acordo com Raven (2001) a maioria das espécies ocorrem em ambientes tropicais sendo que 140 espécies são nativas do Canadá e EUA. O Brasil dispõe de grande biodiversidade dessa espécie, principalmente das epífitas. No entanto, muitas espécies estão correndo o risco de extinção, devido a destruição de seu habitat e às coletas predatórias. Com a destruição do habitat, uso de produtos tóxicos e a exploração desordenada têm ocorrido o desaparecimento dos agentes polinizadores e as orquídeas remanescentes em matas 343

2 preservadas, não mais se reproduzem, pois não ocorre a polinização e a formação das cápsulas de sementes. Nas orquídeas as sementes estão protegidas dentro de uma cápsula, que no caso seria o fruto, esta quando se encontra em estado de maturação se rompe expondo as sementes aos diversos tipos de polinizadores, principalmente o vento. Em apenas um fruto de orquídea é possível encontrar mais de sementes (Pierik, 1997; Bach e Castro, 2004). Na natureza as orquídeas germinam e desenvolvem-se através da relação com fungos micorrízicos, os quais fornecem nutrientes necessários às orquídeas (Ramunssen, 2002, Pereira et al., 2003). As orquídeas também se propagam vegetativamente. No entanto, métodos convencionais de propagação de orquídeas são lentos e laboriosos elevando desta forma, o preço de orquídeas no mercado. A descoberta da cultura assimbiótica contribuiu para minimizar o tempo e a porcentagem de germinação. O cultivo in vitro de matrizes selecionadas de orquídeas é utilizado freqüentemente pois permite a compatibilização de demandas específicas do mercado com atributos importantes como, época de floração, coloração, tamanho, forma das flores, tamanho e vigor das plantas (Kerbauy, 1997). A propagação in vitro além de acelerar a taxa de germinação, permite a obtenção de uma maior quantidade de mudas com maior aproveitamento de sementes, pois, evita o desperdício que ocorre no ambiente quando as mesmas não conseguem germinar, ou devido ao seu desenvolvimento ser lento muitas não atingem seu estado de maturação (Martini et al, 2001). Além disso, a propagação in vitro tem sido utilizada no Brasil para aumentar a produção de mudas de alta qualidade genética e conseqüentemente reduzir seu custo. Contribuindo assim, para salvar muitas espécies que se encontram ameaçadas (Stancato et. al., 2001). As plantas cultivadas in vitro geralmente apresentam características morfológicas diferentes quando comparadas àquelas que cresceram diretamente no campo ou em casa de vegetação, fator responsável pela sua baixa taxa de sobrevivência ex vitro (Kerbauy, 1997). Possuem alto vigor fisiológico, devido a sua nutrição balanceada nas fases iniciais de desenvolvimento, e isto traduz em rápido crescimento e maior tolerância a condições adversas de meio ambiente, bem como ao ataque de doenças e pragas. Considerando que, por meio de experimentos realizados ao longo dos anos, dentro da família Orchidaceae, as condições de cultivo são específicas para os gêneros e algumas vezes para espécies pertencentes ao mesmo gênero (Arditti & Ernest, 1993), tornando necessário adequar protocolos para a propagação in vitro. As sementes de orquídeas são pequenas e, com grande variação de tamanho entre espécies, o que pode ser observado, por exemplo, entre a 344

3 semente de C. walkeriana que é menor que a de S. crispa. Esta diferença em tamanho pode influenciar no resultado in vitro. Considerando a importância da conservação de espécies de orquídeas e a possibilidade de um aumento da germinação este trabalho propõe desenvolver um protocolo de propagação in vitro para as espécies C. walkeriana Gardner e S. crispa Lindl. Material e métodos Cápsulas maduras de C. walkeriana e S. crispa foram abertas para a retirada de sementes. As sementes passaram por um processo de desinfestação em álcool 70% e hipoclorito 30% após, foram lavadas sucessivas vezes em água destilada autoclavada. A seguir, as sementes foram inoculadas em tubos de ensaio 15 X 180mm, estes contendo meio para germinação Knudson C. (1922) modificado com acréscimo de 20% de sacarose (g/l) e 1g/L de carvão ativado. As sementes foram inoculadas em 64 tubos, sendo 32 para cada espécie. Após, os tubos foram vedados com papel alumínio e papel filme e mantido em condições ambientais do laboratório de Biologia da UEG/Morrinhos, no escuro por sete dias. Com o surgimento dos protocormos os mesmos foram transferidos para frascos de 200 ml contendo meio Knudson C. modificado por Morel (1960), acrescidos de 20% de sacarose (g/l), 1,0% de carvão ativado (g/l) e 1000µL de BAP. Cada tubo foi considerado uma unidade experimental. Foi considerada para análise a porcentagem de germinação e posterior conversão em protocormos e plântulas. Resultados e discussão As respostas morfogênicas encontradas diferiram entre as espécies. Um protocolo geral otimizado para propagação in vitro de ambas espécies pode ser verificado na Figura 1. Foi observado que em torno de quatro dias após a transferência do ambiente escuro para ambiente de luz, ou 15 dias da inoculação, as sementes germinaram e produziram estruturas globulares e verdes. No entanto, estas estruturas globulares ou protocormos se tornaram visíveis em torno de 20 dias (Figura 1B). Estes resultados estão de acordo com Miyoshi & Mii (1998) que verificaram a formação de protocormos aos 20 dias. Além disso, pôde-se observar que o estádio de protocormos aumentava em média um terço a cada 15 dias. Notouse que os protocormos apresentavam estádios de desenvolvimento variado. Alguns, pouco diferenciados, necrosaram. Outros apresentavam rizóides. Nas unidades experimentais os estádios variavam entre sementes iniciando o processo de germinação, formação de protocormos e de plântulas. Os primeiros primórdios foliares 345

4 foram observados aos 30 dias em protocormos ainda cultivados em meio sem adição de BAP, os quais foram transferidos para meio de alongamento (Figura 1 C). Em meio com adição de 1mg/L de BAP os protocormos converteram em plântulas após 60 dias do cultivo (Figura 1 D). Vários trabalhos foram desenvolvidos numa tentativa de otimizar a semeadura in vitro de orquídeas e a adição de BAP é discutida entre autores. Efeitos positivos, como redução no tempo de germinação, foram observados por PauW et al. (1995) em Cypripedium candidum. Verificou-se que na espécie C. walkeriana a resposta morfogênica foi melhor uma vez que esta apresentou uma quantidade maior de protocormos e plântulas durante o processo de germinação (Tabela 1). No entanto, visualmente, a espécie S. crispa apresentou uma germinação mais rápida e, seus protocormos apresentaram uma cor verde mais intensa além de suas plântulas mostrarem-se maiores havendo assim necessidade de otimização do protocolo para esta espécie. Figura 1. Protocolo de propagação in vitro para C. walkeriana e S. crispa. A) Sementes (aumento 40X), B) Protocormos aos 20 dias em meio sem adição de BAP, C) Primórdios foliares aos 30 dias de cultivo em meio com adição de BAP e D) Plântula aos 60 dias. 346

5 Tabela 1. Dados da propagação in vitro de S. crispa e C. walkeriana Espécie N o de protocormos N o de plântulas Média de plântulas por unidade experimental Cattleya ,6 walkeriana Shomburgkia crispa ,8 Conclusões Os resultados deste trabalho indicam que, a propagação in vitro pode ser utilizada para propagação em grande escala de C. walkeriana uma vez que, há redução no tempo de germinação além de não haver necessidade do uso de fungos micorrízicos. No entanto, o protocolo deve ser otimizado para S. crispa quando da conversão de protocormos em plântulas. A estratégia de semeadura in vitro oferece uma oportunidade de uso em escala comercial bem como para conservação destas espécies. Referências bibliográficas ARDITHI, J.; Ernest, R. Micropropagation of orchids. New York: J. Wiley, p. BACH, E. E., CASTRO, O. L. Germinação de sementes de Cattleya sp (Orchidaceae) em cultura de tecido visando produção de mudas. Arq. Inst. Biol. São Paulo, v. 71 (supl.), p , BHADRA, S. H.; HOSSAIN, M. M. In vitro germination and micropropagation of Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr., an endangered orchid species. Plant Tissue Cult., v. 13, n. 2, p , BRAGA, P. I. Aspectos biológicos das Orquidaceae de uma campina da Amazônia Central. Acta Amazônica, v.7, n.2, 89p suplemento. CAMPOS, D. M. Orquídeas: micropropagação e quimioterapia de meristemas. 1 a ed. Rio de Janeiro: Editora Expressão e Cultura, CRONQUIST, A. An integrated system of classification of flowring plants. New York, Columbia University Press, p. DRESSLER, R. L. Phylogeny and classification of the orchid family. Cambridge University Press. Cambridge KERBAUY, G. B.. Clonagem de plantas in vitro. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v. 1, n. 1, p ,

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