REGENERAÇÃO IN VITRO DE Oncidium leucochilum BATEM. EX LINDL. (ORCHIDACEAE).

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1 REGENERAÇÃO IN VITRO DE Oncidium leucochilum BATEM. EX LINDL. (ORCHIDACEAE). ALESSANDRO IGLIKOSKI BERNARDI 1, RODRIGO CAETANO DA SILVA 1, ANDRÉ LUÍS LOPES DA SILVA 2, AUREA PORTES FERRIANI Acadêmico do curso superior de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Tuiuti do Paraná. 2- Biólogo, Professor Doutorando, Pontifícia Universidade Católica do Paraná. 3- Bióloga, Professora Doutora, Universidade Tuiuti do Paraná. Endereço eletrônico para correspondência: Aurea Portes Ferriani, Endereço: Rua Sydnei Antonio Rangel dos Santos, Santo Inácio Curitiba, PR. CEP: Telefone:

2 RESUMO Oncidium leucochilum apresenta características ornamentais muito desejadas para obtenção de híbridos com interesse comercial. Orquídeas ocupam posição de destaque no comércio global da floricultura. A produção por sementes apresenta desuniformidade fenotípica, o que não é desejável. Para superar esse problema, técnicas de cultivo in vitro são empregadas. Tal técnica baseia-se na teoria da totipotência onde células únicas são capazes de gerar um organismo inteiro. O objetivo deste trabalho foi avaliar a regeneração in vitro da Oncidium leucochilum em diferentes concentrações de BAP (6-Benzilaminopurina) em meio de cultura MS. As cápsulas foram desinfestadas e inoculadas no meio MS contendo 30 g.l -1 de sacarose, 7 g.l -1 de ágar e ph ajustado para 5,7. Para o experimento utilizou-se brotos de 1 cm de parte aérea como explantes. Adicionou-se no meio MS suplementação do regulador de crescimento BAP. Para o enraizamento utilizou-se o mesmo meio sem suplementação. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cinco repetições de cinco plântulas por unidade experimental. Os cultivos mantiveram-se em sala de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25 ± 2ºC e intensidade luminosa de 35 µm.m -2.s -1. Avaliou-se aos 60 dias de cultivo o número de brotos, folhas e raízes e para o enraizamento o número de raízes, folhas e brotações. Verificou-se que é possível multiplicar plantas de O. leucochilum com 1,15 mg.l -1 de BAP e enraizá-las completamente em meio MS sem suplementação de reguladores de crescimento. Palavras-chave: orquídeas; planta ornamental; cultura de tecidos; BAP. 2

3 ABSTRACT Oncidium leucochilum presents ornamental characteristics very wanted for obtaining of hybrids with commercial interest. Orchids possess high position in the global trade of flowers. The production for seeds presents very variability, what is not desirable. To overcome this problem, techniques of in vitro propagation are used. The aim of this research was to evaluate in vitro regeneration of O. leucochilum in different concentrations of BAP (6-Benzylaminopurine) on MS medium. Capsules were disinfected and cultivated on the MS medium with 30 g.l -1 sucrose, 7 g.l -1 agar and ph adjusted to 5.7. Shoots (ca. 1 cm aerial part) were used as explants and cultivated on MS medium supplemented with different BAP levels. For the rooting, the MS medium was used without growth regulators. The experimental design was completely randomized with five replicates of five plants for experimental unit. The cultivations were maintained at growth room under photoperiod of 16 hours, temperature at 25 ± 2ºC and luminous intensity of 35 µm.m -2.s -1. In the multiplication were evaluated the number of shoots, leaves and roots and for the rooting the number of roots; leaves and shoots, both evaluations were accomplished to the 60 days of in vitro culture. It was possible to multiply plants of O. leucochilum with 1.15 mg.l -1 BAP and to induce roots in a MS medium without growth regulators. Keywords: orchid; ornamental plant; tissue culture; BAP. 3

4 1.INTRODUÇÃO A família Orchidaceae corresponde ao maior grupo das angiospermas, estima-se um número superior de espécies nativas, dentre as quais 910 são do gênero Oncidium, com centenas de espécies e milhares de híbridos produzidos, apresenta distribuição cosmopolita, entretanto é nas regiões tropicais onde é encontrada a maior diversidade (Scheidt, 2008). Por sua diversidade de flores, cores, formas e tamanhos, e sua capacidade de suportar ser transportada por longas distâncias, tornou-se uma das 10 principais flores de corte no mercado internacional. Orquídeas ocupam 8% do comércio global da floricultura, o equivalente a mais do que U$ 40 bilhões (Martin & Madassery, 2006). No Brasil, já foram identificadas mais de espécies de orquídeas, mas muitas estão correndo o risco de extinção, devido à destruição de seu habitat e às coletas predatórias (Colombo et al., 2004). Oncidium leuchochilum Batem. Ex. Lindl. ocorre no México, Guatemala e Honduras. Esta espécie apresenta características ornamentais muito desejadas para a obtenção de híbridos com interesse comercial (Hágsater et al.,2005). A produção por sementes apresenta variabilidade genética nas plantas, o que resulta numa desuniformidade em seus fenótipos, o que não é desejado para propagação de determinadas espécies. Para superar esse problema, a clonagem in vitro é o método apropriado. A cultura de meristema de orquídeas teve início em 1960, quando Morel adaptou a técnica de micropropagação para Cymbidium, visando salvar uma planta atacada por virose. Através da cultura de gemas meristemáticas, Morel conseguiu obter várias plantas geneticamente idênticas a matriz e livres de viroses (Pierik, 1997). Após o trabalho de Morel, muitas outras técnicas de cultura de meristemas de orquídeas foram criadas para Cymbidium e também para uma série de outros gêneros e espécies. Atualmente é possível multiplicar diversas espécies de orquídeas através da micropropagação de meristemas ou outros explantes. Esta técnica é ainda mais importante para a perpetuação de formas híbridas únicas, que jamais chegariam ao conhecimento do público em geral de outra forma, devido à morosidade da multiplicação vegetativa (Arditti & Ernst, 1993). A cultura de tecidos é uma excelente ferramenta para clonar plantas em escala comercial, além de colaborar na realização de estudos de transformação 4

5 genética e conservação de espécies vegetais. Permite ainda aperfeiçoar a interação entre fatores abióticos (nutricionais, luminosos, temperatura etc) e bióticos (hormonais e genéticos), resultando em plantas sadias, vigorosas e geneticamente superiores, que podem ser multiplicadas massivamente. A cultura se baseia na teoria da totipotência onde os seres vivos têm a capacidade de regenerar organismos inteiros, idênticos à matriz doadora, a partir de células únicas (Alves et al.,2008). Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro. As mesmas vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas são conservadas nas células cultivadas, embora alguns processos, como fotossíntese, possam ser inativados pelas condições de cultivo e pelo estado de diferenciação das células. Por isso os meios nutritivos se baseiam nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender às necessidades específicas in vitro. Complementando as substâncias biossintetizadas pelas células, vários compostos orgânicos são adicionados ao meio para suprirem as necessidades metabólicas, energéticas e estruturais da célula (Caldas et al., 1998). Os hormônios (reguladores de crescimento), representam a alma mater da cultura de tecido, porque são eles que direcionam o processo morfogenético. Agrupam-se tradicionalmente em 5 grupos: auxinas, citocininas, giberelinas, etileno e ac. absísico, sendo, os três primeiros os mais usados na micropropagação (Barrueto, 2001). Auxina e citocinina mostram uma ação sinergística no crescimento e divisão celular. A diferenciação de parte aérea, raiz ou ambos em calo de fumo é regulada pelo balanço auxina/citocinina. Concentrações relativamente elevadas de auxina favorecem a formação de raízes, enquanto que a relação inversa induz a regeneração de parte aérea (Miller et al.,1955; Skoog & Miller, 1957 apud Torres et al.,1998). Ressalta-se que alguns tecidos vegetais são autônomos na síntese de hormônios, enquanto outros dependem da aplicação de reguladores junto ao meio nutritivo. A interação e o balanço entre os reguladores adicionados no meio e os hormônios produzidos de forma endógena nas células, regulam o crescimento e a morfogênese de células e tecidos in vitro; desta forma e de acordo com a parte da 5

6 planta da qual foi retirado o explante, mesmo sendo da mesma planta ou de uma espécie para outra, as concentrações de reguladores a serem utilizados devem variar, em função das diferenças endógenas naturais nos níveis dessas substâncias (Aires et al., 2008). O trabalho teve como objetivo promover a regeneração in vitro da espécie Oncidium leucochilum, utilizando brotações como explante. Especificamente, testar diferentes níveis de BAP (6-Benzilaminopurina) visando otimizar as taxas de multiplicação. 2.MATERIAL E MÉTODO 2.1 DESINFESTAÇÃO Realizou-se a desinfestação das cápsulas fechadas de Oncidium leuchochilum Batem. Ex Lindl. com imersão em álcool 70% por 1 minuto, seguida da imersão em NaOCl (2,5%) por 20 minutos, e após foram lavadas três vezes em água destilada e autoclavada (Scheidt et al., 2009). 2.2 CULTIVO Abriu-se as cápsulas e as sementes foram inoculadas em meio MS (Murashige e Skoog, 1962), contendo 30 g.l -1 de sacarose e solidificado com 7 g.l -1 de ágar (ph ajustado para 5,7). Aos 30 dias da inoculação das sementes, as plântulas originadas da germinação in vitro foram subcultivadas para o mesmo meio até obter-se o número suficiente de plantas para a instalação do experimento. 2.3 EXPERIMENTO Utilizou-se brotos de 1 cm de parte aérea como explante. Testou-se uma citocinina, BAP (6-Benzilaminopurina) nas concentrações de 0,15; 0,30; 0,60; 1,15 mg.l -1. Utilizou-se como controle, unidades experimentais com ausência de regulador. Avaliou-se aos 60 dias de cultivo o número de brotos, folhas e raízes. Para o enraizamento in vitro utilizou-se o meio MS sem suplementação de reguladores de crescimento e avaliou-se a porcentagem de enraizamento. 6

7 2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA E CONDIÇÕES DE CULTIVO O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cinco repetições de cinco plântulas por unidade experimental. Os dados oriundos de contagens foram transformados para x + 0,5. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e regressão, ambas ao nível de 5% de probabilidade de erro. Todos os cultivos foram mantidos em sala de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25 ± 2ºC e intensidade luminosa de 35 µm.m -2.s -1 (controlada durante o experimento) fornecida por lâmpadas fluorescentes do tipo branca-fria. 3.RESULTADOS E DISCUSSÃO O BAP promoveu o efeito linear positivo com relação ao número de brotos obtidos, sugerindo que concentrações superiores possam aumentar as brotações ( figura 1 ). 3 número de brotos por explante y = 0,0636x + 2,0515 R 2 = 0,72 0 0,00 0,15 0,30 0,45 0,60 0,75 1,00 1,15 BAP (mg.l -1 ) Figura 1. Número de brotos de Oncidium leucochilum cultivado em diferentes níveis de 6- benzilaminopurina (BAP) aos 60 dias de cultivo in vitro. Em relação ao número de folhas, observou-se que o BAP também causou efeito linear positivo e sugere-se que maiores concentrações possam aumentar a quantidade de folhas ( figura 2 ). 7

8 12 número de folhas por explante y = 0,5058x + 5,4745 R 2 = 0,60 0 0,00 0,15 0,30 0,45 0,60 0,75 1,00 1,15 BAP (mg.l -1 ) Figura 2. Número de folhas por explantes de Oncidium leucochilum cultivado em diferentes níveis de 6-benzilaminopurina (BAP) aos 60 dias de cultivo in vitro. Quanto ao número de raízes observa-se que o BAP promoveu um efeito linear negativo, demonstrando que essa citocinina afeta a formação de raízes ( figura 3 ). 0.8 número de raízes por broto y = -0,0888x + 0,7833 R 2 = 0,89 0 0,00 0,15 0,30 0,45 0,60 0,75 1,00 1,15 BAP (mg.l -1 ) Figura 3. Número de raízes de Oncidium leucochilum cultivado em diferentes níveis de 6- benzilaminopurina (BAP) aos 60 dias de cultivo in vitro. Quanto ao experimento de enraizamento verificou-se que em 100 % das unidades experimentais as plântulas enraizaram. 8

9 Em Villa, et al. (2010), observou-se que em cultivo in vitro de amoreira-preta (Rubus sp.) o número de folhas foi estimulado pelo tipo de meio de cultura e pelas concentrações de BAP, observando a interação entre esses dois fatores. Observouse também, que com o incremento nas concentrações de BAP ocorre um aumento de forma quadrática no número de brotos de amoreira-preta. Segundo Ferriani (2008) altas concentrações de citocinina geralmente inibem ou atrasam a formação de raízes. Por esta razão, as citocininas são geralmente omitidas do meio de cultura no estágio de enraizamento das brotações. Isso justifica o resultado linear negativo relacionado ao número de raízes do meio suplementado com BAP. As auxinas são fitorreguladores com maior efetividade na promoção de enraizamento, podendo ser utilizada isoladamente ou combinadas no processo de indução de raízes, em concentrações variadas conforme a espécie (Alvarenga & Carvalho, 1983 apud Sorace et al., 2007). O uso de citocinina estimula maior produção de partes aéreas, mas o seu excesso é tóxico e causa sérios problemas na fase de enraizamento (Lane, 1979; Leshem et al., 1998 apud Torres et al., 1998). 4.CONCLUSÃO Plantas de Oncidium leucochilum podem ser multiplicadas com 1,15 mg.l -1 de BAP e enraizadas completamente em meio MS sem suplementação de reguladores de crescimento. Sugere-se para estudos futuros experimentos com diferentes níveis de BAP e associação com auxinas, com objetivo de obter a melhor taxa de multiplicação e enraizamento. 5.REFERÊNCIAS ALVARENGA, L. R.; CARVALHO, V. D. Uso de substâncias promotoras de enraizamento de estacas frutíferas. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.9, n.101, p.47-55, In: SORACE, M.; FARIA, R. T.; YAMAMOTO, L. Y.; SCHNITZER, J. A.; TAKAHASHI, L. S. A. Influência de auxina na aclimatização de 9

10 Oncidium baueri (Orchidaceae). Ciências Agrárias. Londrina, v.28, n.2, p , ALVES, C.; OLIVEIRA, J. R.; REIS, E. S.; CORRÊA, R. M.; SOUZA, J.; SILVA, J. C. O.; DE PAULA, J. C. R.; RODRIGUES, L. H. F.; DE SOUZA, M. A.; MENDONÇA, M. R. A cultura de tecidos na agricultura. I Jornada Cientifica e VI FIPA do CEFET Bambuí. p. 1, AIRES, P. S. R.; CARVALHO, J. M. C.; PIMENTEL, N. W.; SILVA, H. Efeito da citocinina 6-bencilaminopurina na micropropagação in vitro da mamona utilizando o genótipo BRS nordestina. Revista de biologia e ciências da terra. v. 8, n.2, ARDITTI, J.; ERNST, R. Micropropagation of orchids. New York: John Wiley and sons Inc., 1993, 64p. BARRUETO CID, L.P. Cultura de tecidos vegetais uma ferramenta fundamental no estudo da biologia moderna de plantas. Biotecnologia. Ano III, n.19. p , CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E.. Meios nutritivos. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, v.1, 864 p COLOMBO L. A.; FARIA, R. T.; CARVALHO, J. F. R. P.; ASSIS, A. M.. FONSECA, I.C.B. Influencia do fungicida clorotalonil no desenvolvimento vegetativo e no enraizamento in vitro de duas espécies de orquídeas brasileiras. Acta Scientiarum, Maringá, v.6, n.2, p , FERRIANI, A. P. Reguladores vegetais e biotecnologia. Apostila de Biotecnologia Vegetal. Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, v.1, 864 p

11 HÁGSATER, E.; SOTO ARENAS, M. Á.; SALAZAR CHÁVEZ, G. A.; JIMENEZ MACHORRO, R.; LÓPEZ ROSAS, M. A.; DRESSLER, R. L. Las orquídeas de México. Instituto Chinoín, México, D. F. p MARTIN, K.P; MADASSERY, J. Rapid in vitro propagation of Dendrobium hybrids through direct shoot formation from foliar explants, and protocorm-like bodies. Scientia Horticulturae. V.108, p , MURASHIGUE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v.15, p , PIERIK, R. L. M. In vitro culture of higher plants. The Nertherlands: Kluwer Academic Publishers. p SCHEIDT, N. G. Desenvolvimento e validação de um biorreator do tipo imersão por bolhas para micropropagação de plantas. (Doutorado em Processos Biotecnológicos) - Universidade Federal do Paraná. p. 30, SCHEIDT, N.G; SILVA, A. L. L; DRONK, A. G; BIASI, L. A; ARAKAKI, A. H; SOCCOL, C.R. Multiplicação in vitro de Oncidium leucochilum (Orchidaceae) em diferentes sistemas de cultivo. Biociências. Porto Alegre. V.17, n TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária,v.1, 864 p, VILLA, F.; PASQUAL, M.; SOUZA, A. G. ; VILELA, X. M. S. Meios de cultura e reguladores de crescimento na multiplicação in vitro de amoreira-preta. Scientia Agrária. Curitiba. V.11, n

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