Primer puesto: César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González

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1 4 Primer puesto: César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González Segundo puesto: Renata Helena Candido Pocente

2 Comité Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT Presidenta: María Eugenia González R. Móvil: (57) (3) premio.poct@alere.net.co

3 Presentación El Premio Alere, en reconocimiento al esfuerzo de los profesionales de la salud que están en constante actualización e innovación, galardona a quienes en su incansable búsqueda de nuevos horizontes logran resultados positivos en beneficio de la humanidad. El Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014 pretende incentivar la investigación, la capacitación y la actualización enfocadas a mejorar la calidad de vida de los pacientes. Con la participación obtenida se superaron las expectativas. Nos sentimos orgullosos de haber contado con la producción intelectual de tantos profesionales latinoamericanos que pusieron a consideración del comité del Premio sus trabajos de investigación. El rigor de la evaluación rindió sus frutos, se encontraron trabajos de mucha importancia, relevancia y trascendencia para el área de la salud. Todos somos ganadores en el Premio Alere. El interés mostrado y la persistente labor por un mejor futuro hacen descollar a estos investigadores hasta el nivel de la excelencia. El jurado, por su parte, estuvo a la altura del Premio. Profesionales de talla mayor como Gustavo Méndez (México), María Belén Bouzas (Argentina) y Luisane Marie Falci Vieira (Brasil), tuvieron la ardua tarea de evaluar los proyectos y tomar la decisión de elegir al número uno. A los participantes, gracias por dar lo mejor de ustedes. Al jurado, gracias por la entrega y por la responsabilidad que le imprimieron a su meritoria misión. En 2015, el Premio Alere continuará incentivando la labor investigativa en POCT, y espera contar con una amplia y representativa participación de profesionales de los países de América. Presidenta Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT Presentación 3

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5 Segundo puesto Imunoensaio cromatográfico rápido no diagnóstico diferencial de tuberculose e micobacteriose não tuberculosa em um serviço de referência terciária Renata Helena Candido Pocente*, Margarida Maria Passeri do Nascimento, Sandra Mara Nunes Moroti, Livia Maria Pala Anselmo, Cinara Feliciano, Roberto Martinez, Rodrigo C. Santana, Valdes Roberto Bollela. *Autor principal: Renata Helena Candido Pocente. Endereço: Laboratório de Micobactérias do Hospital sas Clínicas da Faculdade se Medicina se Ribeirão Preto. Campus Universitário S/N Ribeirão Preto-São Paulo. Tel: (16)

6 Sumário executivo Introdução O Brasil está entre os 22 países que concentram aproximadamente 80% do total de casos de tuberculose (TB), ocupando a 16ª posição em número absoluto de casos. À semelhança de outros países, o Brasil tem conseguido avançar no controle da doença nas últimas duas últimas décadas. Entretanto as elevadas taxas de co-infecção entre o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o bacilo da tuberculose (TB) e a emergência de bacilos resistentes tem sido um limitante para o o controle de ambas as doenças 1. Os pilares para o controle da TB incluem o diagnóstico precoce e o tratamento efetivo. O aumento da prevalência global do HIV tem promovido dificuldades adicionais no diagnóstico e, consequentemente, no controle da TB, especialmente no paciente com imunodeficiência em fase avançada. Nestes casos observa-se um aumento na ocorrência de micobactérias não tuberculosas (MNT), cujo diagnóstico inicial pode ser facilmente confundido com o da TB. Este fato se torna ainda mais desafiador se considerarmos que existem MNTs colonizando a árvore respiratória, a região gênitourinária, trato gastrintestinal e região perineal de pessoas saudáveis. Assim, a presença de baciloscopia e até a cultura positiva para micobactérias em alguns espécimes clínicos não é suficiente para garantir o diagnóstico de tuberculose. Além do cultivo é preciso identificar com acurácia a espécie de micobactéria para que o tratamento apropriado seja instituído. O Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCRP) é um hospital terciário com cerca de 700 leitos, referência para uma macrorregião com cerca de 4 milhões de habitantes. Nele estão localizados os serviços de referência para TB resistente, co-infecçãotb/ aids e para pacientes com micobacteriose não-tuberculosa do Nordeste do estado de São Paulo. Pelo porte, o hospital também é o centro onde se faz a maioria dos transplantes desta região do estado, o que provoca um elevada concentração de pacientes imunocomprometidos. Neste contexto, é fundamental diferenciar as espécies de micobactérias isoladas em cultivo. Segundo puesto 21

7 Até 2013 a rotina do laboratório para isolamento e identificação de micobactérias incluia o exame direto (Ziehl-Neelsen) e incubação no sistema automatizado MGIT 960 TM para qualquer amostra, exceto sangue e medula óssea. Estes dois espécimes são cultivados no sistema BD Bactec 9120 TM. Após sinalizar o crescimento no sistema automatizado, uma alíquota do meio de cultivo era separada para extração de DNA e amplificação por meio de técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) in house que amplifica um fragmento de 123 pares de bases da região IS6110 do Mycobacterium tuberculosis 2. Na presença da amplificação confirmava-se M. tuberculosis, e na sua ausência concluia-se pela presença de MNT. O tempo de execução da identificação das micobactérias pela PCR (extração do DNA, amplificação, revelação no gel de agarose e fotografia do gel) variava entre 8 e 10 horas para 6 a 8 isolados/semana, ou um dia de trabalho da biologista responsável pelo laboratório. Objetivo deste trabalho O objetivo deste estudo é avaliar a implantação de um imunoensaio cromatográfico rápido (IECR), na rotina de identificação de micobactérias do laboratório de um hospital de referência no Estado de São Paulo. Materiais e métodos Desenho do estudo: Estudo transversal, que avaliou os resultados da incorporação de teste TBAgMPT64 TM (Standard Diagnostic Inc- Republic of Korea; distribuido pela Alere S/A no Brasil) na rotina de identificação das micobactérias isoladas em cultura no hospital. Obtenção de amostras: as amostras coletadas por ocasião da investigação diagnóstica rotineira de TB e MNT em pacientes internados no HCRP. 22 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

8 Amostras estudadas: Foram analisadas amostras de 237 isolados de micobactérias em cultura, entre os meses de outubro de 2013 e julho de A confirmação de M. tuberculosis foi feita através de dois métodos moleculares: PCR in house e resultado do teste molecular rápido Genotype MTBDRplus (Hain Lifescience, GmbH, Germany), o qual é feito de rotina no laboratório e que, além de detectar mutações de resistência do bacilo, também identifica a espécie. As amostras caracterizadas como MNT pela PCR foram encaminhadas ao Laboratório de referência do Estado de São Paulo para identificação da espécie (Instituto Adolfo Lutz-IAL). Aspectos éticos: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do HCRP, com número 9586/2011. Resultados e discussões Das 237 cepas isoladas em cultura nos 10 meses deste estudo, 143 tiveram resultados positivos no imunoensaio cromatrográfico, identificando M. tuberculosis, e em 94 isolados o resultado indicou a presença de MNT. Foram isoladas micobactérias de diferentes sítios, conforme demonstrado na tabela 1: Tabela 1. Sítio da infecção da micobactéria isolada nos 237 pacientes estudados Espécime clínica M. tuberculosis MNT Escarro Líquido cefalorraquidiano 8 0 Lavado gástrico 6 2 Sangue 6 1 Aspirado traqueal/lav. broncoalveolar 5 3 Biópsia (pulmão e linfonodo) 4 0 Abscesso 3 1 Líquido pleural 2 0 Fezes 1 1 Osso 1 0 Total Segundo puesto 23

9 A seguir apresentamos em uma tabela 2x2 os resultados do IECR quando comparado com os resultados obtidos com a PCR in house e o Genotype MTBDRplus para identificar o complexo M. tuberculosis e os resultados do laboratório de referência do estado, para as cepas identificadas como MNT. Definição da espécie: PCR in house; Genotype MTBDRplus e resultados do laboratório de referência Imunocromatográfico POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO A sensibilidade e especificidade do IECR foi de 99,3% e 100%, respectivamente. O valor preditivo positivo foi de 100% e o negativo de 98,9%.O coeficiente kappa entre o IECR e os testes de referência utilizados foi de 0,99. O tempo necessário para realizar 10 testes de identificação com o IECR foi de 20 minutos, cerca de 30 vezes menor do que o tempo gasto para o teste utilizando o PCR in house. Se considerarmos o tempo de trabalho do biologista mais os insumos utilizados na PCR, o custo/teste do IECR também foi menor. 24 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

10 Conclusões e recomendações O IECR mostrou elevadas sensibilidade e especificidade quando realizado no meio líquido do MGIT. Também demonstrou elevada correlação com os testes de referência (kappa=0,99). Em apenas um, dos 144 isolados de M. tuberculosis, o IECR não detectou a infecção, o que só foi possível após resultado do laboratório de referência. Quando utilizamos a PCR diretamente no líquido de cultura, existe maior risco de contaminação da reação, consequentemente resultados falsos positivos, além do risco de contaminação da reação feitas para espécimes clínicos processados no nosso laboratório, como líquor, líquido pleural ou ascítico. Tal risco não existe com o uso do IECR. Recentemente, a partir dos trabalhos de SUTANTANGJAI et al. 3, temos considerado utilizar o IECR diretamente em amostras de escarro com baciloscopia positiva, previamente tratadas com mucolítico/solvente. Isto poderia encurtar o tempo de detecção e identificação da espécie presente na amostra clínica. Desde outubro de 2013, o IECR foi incorporado à rotina de identificação de micobactérias que creceram no sistema automatizado de cultivo, e esta prática tem significado maior rapidez e maior confiabilidade, que certamente impactam na tomada de decisão clínica. É importante destacar que, para hospitais de referência, continua sendo muito importante contar com a retaguarda do laboratório de referência, considerando a complexidade dos casos atendidos neste serviço. Agradecemos à equipe do laboratório de Micobactérias do Instituto Adolfo Lutz, parceiros e referência para identificação das MNT e teste de sensibilidade de M. tuberculosis isolados no Hospital das Clínicas da de Ribeirão Preto. Segundo puesto 25

11 Bibliografia 1 World Health Organization (WHO). Global tuberculosis report Geneva: World Health Organization, Bollela VR, Sato DN, Fonseca BAL. McFarland nephelometer as simple method to estimate the sensitivity of polymerase chain reaction using Mycobacterium tuberculosis as a research tool. Braz. J. Med. Biol. Res (9), Sutantangjai M, Fasksri K, Chaicumpar K, et al. Evaluation of an immunochromatographic test kit for detecting Mycobacterium tuberculosis complex in sputum samples and on solid and in liquid cultures. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2014, 45(2):

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