IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS COM «VACINA» VIVA AVIRULENTA DE TRYPANOSOMA CRUZI. I Ensaio da avaliação do menor inoculo eficiente.

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1 IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS COM «VACINA» VIVA AVIRULENTA DE TRYPANOSOMA CRUZI I Ensaio da avaliação do menor inoculo eficiente. H m nhfirw ) M e n e z n s * O Autor procura verificar qual o menor número ãe Trypanosom a cruzi, da cepa Y avirulenta, capaz ãe conferir a camundongos imunidade eficiente contra uma ulterior infecção com a cepa Y virulenta do mesmo parasita. Considerações gerais sôbre o possível mecanismo da imunização são esboçadas. Em trab alhos anteriores procuram os dem onstrar o efeito protetor de um a cepa avirulenta do Trypanosoma cruzi contra infecção experim ental com cepa alta m en te virulenta do mesmo flagelado (7, ) Naqueles trabalhos foi utilizado, deliberadam ente, um inóculo m uito grande, pois o objetivo era duplo: m ostrar o papel im u- nizan te d a vacina usada e ao mesmo te m po a sua avirulência. Visando um a possível aplicação prática posterior procuram os avaliar a quantidade m ínim a de tripanosom as avirulentos capaz de proteger eficientem ente cam undongos contra um a infecção v iru lenta. MATERIAL E MÉTODOS Utilizamos como vacina um a cultura de Trypanosoma cruzi, cepa Y, m antida em meio de cultura ds Packchanian( subinoculação n. 306 do D epartam ento de Parasitologia da F.M.R.P.), com 28 dias de idade. O líquido de condensação do meio foi centrifugado e o sedim ento suspenso em solução salina, centrifugado várias vêzes, à baixa rotação, até se obter um sobrenadante lím pido. O sedim ento foi m ais um a vez suspenso em solução salina, tendo sido feita imediatam ente um a avaliação do núm ero de form as vivas presentes, calculando-se estas em cêrca de 60% de todos os parasitas. Deixou-se secar um a gôta de vacina sôbre um a lâm ina e posteriorm ente procedeu-se a um a coloração pelo Giemsa. Com o auxílio de um a ocular integradora Zeiss e tendo como padrão um esfregaço de sangue cujo núm ero de hem ácias por m m > era conhecido, procedeu-se à estim a tiva do núm ero de p arasitas por ml. A m esm a lâm ina exam inada com im ersão perm itiu avaliar o percentual de form as m etacíclicas. Dêsse modo calculou-se que 1 ml da vacina possuia: 2,4x 10" parasitas dos quais 60% estavam vivos. As form as m etacíclicas correspondiam m ais ou menos a 10% dos tripanosom as presentes n a preparação. A vacina foi então dividida em quatro frações sendo não diluida a prim eira e as dem ais diluidas a 1/10, 1/100 e 1/1000, sucessivam ente. * U.S. P. Departamento de Patologia. Faculdade de Medicina de Ribeirão Prêto, São Paulo, Brasil.

2 298 Rev. Soc. Bras. Med. Trop. Vol. III N. 6 GRAFICO N 2 1 n n n VACINA NÃO DILUÍDA NUMERO DE PARASITOS (MEDIANA) EM 5 mm3 DE SANGUE 8 15 DIAS APOS INFECÇÃO 30

3 Vacina Número parasitas/5 m m 3 de sangue Dias após a Infecção Cam undongo N. "O a O ic M édia M ediana o H i i ft 0 Média M ediana O T-t i"h Média M ediana O o t-h M édia M ediana CO W i O tó H ? O O M édia M ediana

4 Nov.-Dez., 1969 Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 301 Q uarenta cam undongos albinos, m achos, com 10 g de pêso foram divididos em g ru pos de 10 e a cada grupo se injetou, por via subcutânea, 0,2 ml de um a das fr a ções da vacina. Dez anim ais da m esm a procedência, pêso e sexo, m antidos nas m esm as condições, foram tom ados como controles. Pela técnica da gôta espêssa fizemos um a pesquisa de tripanosom as no sangue periférico de todos os anim ais vacinados, 8 e 15 dias após a V acinação. Q uatro sem anas após a im unização to dos os anim ais, inclusive os controles, foram infectados, por via peritoneal, com trip an o so m as/g de pêso. Os flagelados in fectantes provinham de sangue heparinizado de cam undongos no 8. dia da infecção com a cepa virulenta Y do Trypanosoma cruzi. A parasitem ia de todos os anim ais foi feita no 8., 15. e 30. dias após a infecção, usando-se a técnica da contagem p re conizada por Pizzi e m odificada por Bren er (1). O percentual de sobrevida dos anim ais foi tom ado tam b ém em relação com aquelas d atas. RESULTADOS Os resultados obtidos se acham resum i dos n a Tabela 1 e nos Gráficos I e n. Por êles se verifica que tôdas as frações da v acina protegeram os anim ais, contudo as que conferiram m elhor proteção foram as possuidoras de m aior núm ero de parasitas. Os anim ais im unizados com vacina não diluida e diluida a 1/10 não chegaram sequer a apresentar, n a sua m aioria, parasitem ia após a infecção. Um dos anim ais protegidos com a v a cina a 1/10 m orreu no 17. dia pós in fecção e em bora não tenham os feito estu do histopatológico, dado o estado de p u trefação em que foi encontrado, é quase certo não te r m orrido da parasitem ia, pois tivera duas parasitem ias negativas nos dias 8 e 15 após a infecção. Os anim ais protegidos com a vacina" a 1/1000 que teoricam ente receberam 288 tripanosom as vivos, sendo 29 form as m e- tacíclicas, tiveram um a parasitem ia discreta (exceção de dois anim ais) no 8. e 15. dia e n eg ativ a no 30.. A única m orte dêsse grupo se deveu, de fato, à infecção tripanosom ótica e ocorreu no 16. dia pós infecção. Q uanto aos controles com portaram -se como todos os outros das dem ais experiências nossas em que utilizam os a mesma cepa e a m esm a dose in fectante (6, 7, 11, 13); i.é., apresentaram um a alta parasitem ia no 8. dia que foi declinando até se to rn a r negativa no 30. dia. A m ortalidade se iniciou no 15. dia pós infecção e se tornou m áxim a no 21. dia, conservando o mesmo percentual até o 30. dia quando a experiência foi considerada encerrada. As pesquisas parasitárias pós vacinação e pré-infecção foram tôdas negativas. COMENTÁRIOS E CONCLUSÕES Em bora seja possível que venham os a te r dentro em breve vacinas m ortas eficientes co n tra a tripanosom ose su l-am ericana (2, 4 e 14), os m elhores resultados verificados até agora têm sido com as v a cinas vivas. Ainda se encontra arraigado no espírito da m aioria dos parasitologistas que se dedicam ao estudo da im unidade dessa parasitose, o princípio elaborado em 1931 por Collier (3) de que a im unidade dos a n i m ais de laboratório, infectados, está n a dependência da presença p erm an ente do p a ra sita no tecido som ático. A prem unição que é o têrm o dado a êsse tipo de im unidade é, n a opinião de Lum sden (5) um têrm o m eram ente descritivo, n a d a significando quanto ao m e canismo im unitário. Êste, segundo o mesmo Autor, deve ser sem elhante tan to n as infecções p arasitárias como n a s viróticas e b acterianas. No nosso caso estam os convictos de que os p arasitas vivos avirulentos usados para im unizar os anim ais, produzem um a infecção tran sitó ria nos mesmos, m as não um a in f ecção-doença. Em nen h u m a oportunidade conseguimos evidenciar, pelas técnicas usuais de parasitologia e de histologia, p arasita s nos a n i mais, quatro sem anas após a vacinação (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13), em bora os m esmos estivessem capacitados a resistir a um a infecção com cepa virulenta. Tudo nos leva a crer que a estru tu ra antigênica do T. cruzi é extrem am ente lábil e que

5 302 Rev. Soc. Bras. Med. Trop. Vol. III N. 6 GRAFICO N I 1 VACINA NA0 DILUÍDA Ei 0 VACINA l/l 0 VACINA 1/100 Ld Q et O VACINA 1/1000 CONTROLES cr o DIAS 1 5 AP0S NFECÇA0 qualquer tratam ento seja por processos químicos ou físicos induz alterações com perda ou dim inuição acentuada do seu pocíer imcrnagênicra. Com os tripanosom as vivos da cepa aviru len ta os antígenos seriam levados, in a l terados, ao interio r das células, sem contudo se m ultiplicarem nas m esm as. Dêsse modo se desenvolveriam os fenômenos im unitários sem que houvesse doença. Segundo esta lin h a de pensam ento, a d m itim os que seja possível, com técnicas r e finadas, a obtenção de antígenos com um m ínimo de alterações estruturais, capazes de induzir eficiente resposta im unológica. Até que tal objetivo seja atingido de m o do prático, a existência de um a cepa avirulenta, com elevada capacidade im unizante, se nos afigura como a m an eira m ais segura de se obter um a adequada p ro te ção dos m am íferos contra infecção pelo Trypanosoma cruzi. Tôdas as provas laboratoriais realizadas agora (9 e 10) m ostram que a cepa Y cultivada perdeu realm ente a capacidade de in fectar anim ais de laboratório, seja qual for a dose e a via em pregada. Como conclusão do presente trabalho verificou-se que aparentem ente o grau de proteção (medido sobretudo pelo grau de parasitem ia) parece relacionado com um m aior núm ero de p arasitas vivos inoculados. Essa relação não teria um caráter exponencial pois pequenas quantidades de tripanosom as são capazes de conferir bom estado de proteção (especialm ente se se tom a como padrão o percentual de sobrev id a ), m uito próximo daquele conseguido com altíssim as doses de p a ra sitas.

6 Nov.-Dez., 1969 Kev. Scc. Bras. Med. Trop. 303 S U M M A R Y After having dem onstrateã th a t the cultivated Y strain of Trypanosom a cruzi became avirulent to laboratory animais w ithout losing its protective activity against a further virulent infection, the Author concludes th at a very small dose of live trypanosomes (about 3 metaciclic forms per gram of body weight) is able to afford good im m unity to m ice. General considerations about th e probable mechanism of th e im m unity are m ade. BIBLIOGRAFIA 1. BRENER, Z. C ontribuição ao estudo da terapêutica experim ental da Doença de C hagas. Tese. F ac. F arm. O dont. U niv. M inas G erais, Belo Horizonte, CAPPA, S.M.G.; SCHMUNIS, G.A.; TRAVERSA, O. C.; YAVANOVSKY, J.F. & PARODI, A.S. Com plem ent fixation tests skin test an d experim ental im m unization w ith antigens of T. cruzi prepared under pressure. Am. J. Trop. Med. & Hyg. 17: , COLLIER, W. über Im m unitat bei du Chagas K rankheit du Weissen m ans. Z. Hyg. In fektio n sk r. 112: , GOBLE, F.C. Experim ental im - munology 8.th In t. Cong. T rop. M ed. & M alaria. T eheran A bstracts & Reviews. P ág LUMSDEN, W.H.R. Trends in R esearch on the Im m unology of Trypanosom ias. Buli. W ld. H lth. Org. 37: , MENEZES, H. The effect of phenolated vaccines ag ain st experim ental infection in m ice. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 2: MENEZES, H. Protective effect of on avirulent (O ultivated) stra in of Trypanosoma cruzi ag ain st experim ental infection in mice. Rev. Inst. Med. T rop. São Paulo, 10: 1-4, MENEZES, H. Lesões histológicas em cam undongos vacinados com um a cepa avirulenta do Trypanosoma cruzi, Rev. B rasil. Med. 25: , MENEZES, H. I The avirulence of th e cultivated Y stra in of Trypanosoma cruzi. Rev. In t. Med. trop. São Paulo. No prelo. 10. MENEZES, H. II The avirulence of th e cultivated Y stra in of Trypanosoma cruzi. Em preparo. 11. MENEZES, H. Active im m unization of mice w ith th e avirulent Y stra in of Trypanosoma cruzi against heterologous virulent strains of the sam e parasite. Rev. In st. Med. trop. São P au lo. No prelo. 12. MENEZES, H. Lesões histológicas do coração em cães vacinados com um a cepa aviru len ta do Trypanosom a cruzi. Rev. B ras. Med. No prelo. 13. MENEZES, H. Active im m unization of dogs w ith a non virulent strain of Trypanosoma cruzi. Rev. In st. Med. tro p. São Paulo. No prelo. 14. SENECA, H. C urrent statu s of im m unization of laboratory anim ais w ith T. cruzi lipopolysacharide. 8.th In t. Cong. Trop. Med. & M alaria. T eheran A bstracts & Reviews. P ag. 367.