PREPARAÇÃO DE MATERIAL EM TRICOLOGIA. Anne-Sophie Bertrand, MSc

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1 PREPARAÇÃO DE MATERIAL EM TRICOLOGIA Anne-Sophie Bertrand, MSc

2 INTRODUÇÃO Numerosos são os trabalhos conservacionistas relacionados aos carnívoros que contam de análises tricológicas. A tricologia é a ciência que consiste em analisar o conteúdo de fezes para determinar os itens que compoem a dieta de um carnívoro. Com base na análise de estrutúra microscópica de pêlos contidos na amostra, hoje é possível identificar os gêneros, e as vezes, as espécies correspondentes às lâminas. A tricologia apresentase como uma disciplina razoavelmente fácil de entender e aplicar. Além disto, por ser uma técnica requerendo pouco equipamento, então apropriada para projetos de pesquisa com pequenos recursos. Desde do início de 2007, o Laboratório de Ecologia e Conservação de Mamíferos Silvestres no LIMA (Laboratório Integrados do Meio-Ambiente) da Faculdade Anglo-Americano de Foz do Iguaçu, PR, vem desenvolvendo trabalhos de tricologia de carnívoros da nossa região. Para quem quiser estudar a dieta de carnívoros, este manual represente uma ajuda simples e concreta para realizar todo o procedimento, à partir do momento que encontrou-se fezes de carnívoro no campo até a identificação das espécies que foram predadas pelo carnívoro autor. 1

3 NO CAMPO 1- Localização das amostras: Percorrer bordas de áreas florestadas e trilhas em áreas florestas na busca de amostras fecais. No verão, é facilitada pelo agrupamento de borboletas e outros dípteras. Algumas espécies têm preferências para lugares altos, expostos (e.g. áreas cascalhadas usadas como latrinas ) e beiras de rio. 2

4 1- Pesquisadores coletando amostra de fezes de onça pintada (Panthera onca). 2- Identificação do autor da amostra: Procurar nas proximidades rastros eventuais do autor (i.e. pegadas, arranhões nos troncos, raspados no solo, animais predados, serrapilheira amontoada). A utilização de manuais de campo para a identificação de rastros é recomendada. Observar a morfologia geral. Fotografar (sempre com escala) e tomar nota de tamanho, comprimento e espessura da amostra Fezes de puma (Puma concolor) Raspado de puma Arranhão de puma. 3

5 3- Aferição da amostra: Devem ser coletadas antes da coleta medidas precisas de comprimento geral, espessura (na porção mais espessa), e contagem dos pelits. Utilizar um paquímetro ou trena Fezes de felino pequeno e paquímetro Fezes de felino grande (i.e. onça pintada) e trena. 4

6 4- Coleta de porção para análise de DNA: Antes do armazenamento da amostra, deve ser coletada uma porção externa (1/5) bem humedecida (i.e. presença de muco intestinal). Depositar em um tubo estéril de plástico ou de vidro sobre uma camada de cristais de sílica, coberta por um pedaço de papelão. Guardar Inserção da porção no tubo T ubo identificado com sílica. 5

7 5- Armazenamento e etiquetagem da amostra: Após das etapas acima, identificar o recipiente (preferencialmente um saco plástico ou de papel) com data, hora, local, localização geográfica (GPS), nome do coletor e possível espécie-autora. Em virtude do hábito comportamental territorialista de algumas espécies, é necessário deixar uma porção da amostra no local para diminuir a interferência Coleta de uma amostra de gato pequeno em uma latrina Labelização da amostra. 6

8 NO LABORATÓRIO 6- Registro de entrada: No laboratório, as amostras deverão receber um número de identificação obtido no banco de dados onde deverão ser anotadas as informações coletadas a campo ( 5). Esse número permitirá um monitoramento seguro e confiável dos dados durante todo o processo. O número de registro deve ser adicionado na embalagem da amostra. 6- Entrada da amostra referênciada no banco de dado. 7

9 7- Congelamento da amostra: Após o registro, a amostra deve ser congelada na embalagem de origem, em temperatura baixa (- 18 ºC), no mínimo 24 horas. Isto irá auxiliar na redução de possíveis agentes contaminantes Após identifcação, congelamento da amostra Cada amostra é claramente identificada. 8

10 8- Lavagem: As amostras devem ser depositadas em recipientes com água e sabão líquido e agitadas (ou centrifugadas) até dissolução de matéria orgânica decomposta (i.e. cimento) Método de dissolução do cimento Com o calor e o movimento, o material orgânico está se dissolvendo Máquina aquecedora e imã criando movimento na água. 9

11 9- Filtragem: Após a dissolução do cimento, o suco deve ser filtrado com uma peneira de malha fina (peneira de tinta). Da filtragem serão obtidos materiais orgânicos não decompostos, e.g. ossos, penas, unhas, pêlos, dentes, exoesqueletos Material não dissolvido na peneira Verificação da dissolução. 10

12 10- Secagem: Retirar da peneira os elementos sólidos e deposita-los sobre papel descartável ou um recipiente devidamente identificado. Secar em temperatura de 60 ºC, preferencialmente em estufa seca, até secagem completa. As amostras devem ser armazenadas em recipientes limpos devidamente identificados. 10- Secagem em estufa seca. 11

13 11- Triagem: Para a triagem, devem ser utilizados pinças de ponta fina de metal, bandejas plásticas brancas, e luminária. É recomendado usar os equipamentos de segurança pessoal (i.e. luvas, máscara, jaleco). O conteúdo deverá ser dividido por item, e.g. ossos, unhas, pêlos, etc. Durante a divisão dos itens, as diferenças morfológicas (i. e. cor, tamanho, tipo de pêlo) devem ser utilizadas para realizar a separação por semelhança. Cada tipo de item deve ser armazenado em recipiente individual devidamente identificado (e.g. frascos de filme), e registrado em um livro de amostras triadas. O uso de um plano escuro de fundo pode facilitar a visualização dos itens. 11- Identificação e separação dos itens encontrados. 12

14 12- Preparo de pêlos: Dos pêlos armazenados, devem ser selecionados alguns inteiros (i.e. com bulbo, haste, escudo e ponta). Devem ser limpos em álcool e secos em papel descartável. Em alguns casos será necessária a remoção manual de cimento nos pêlos, que deverá ser feita na direção do bulbo para a ponta, preservando assim a estrutúra cuticular do pêlo Pêlos a ser preparados Imerção no álcool em um pote identificado Secagem em papel absorvente. 13

15 13- Preparo de Lâminas de Cutícula [LC]: Para cada tipo de item identificado, identificar e preparar um mínimo de três lâminas. Esmalte de unha incolor deverá ser aplicado de maneira uniforme em toda a superfície de lâminas de microscopia previamente limpas com álcool. Após secagem de 30 minutos, os pêlos deverão ser depositados (horizontalmente na lâmina) sobre o esmalte, e prensados com o auxílio de uma morsa. Retirar a lâmina prensada e atritar delicadamente a superfície do esmalte com o polegar limpo para retirar o pêlo, pelo escudo de preferência Identificação das lâminas Aplicação do esmalte Tempo de secagem. 14

16 14- Revisão das LC: As LC devem ser observadas no microscópio para averiguar se a impressão cuticular é válida (i.e. visualização de um padrão cuticular entre as duas bordas da região da haste e porção inicial do escudo do pêlo). Caso contrário, reiniciar o processo ( 13) Preparação da lâmina de revisão Aplicação da lamínula Lâmina de revisão pronta. 15

17 15- Preparo dos pêlos para análise medular: Esta etapa consiste na remoção do pigmento de cor (i.e. melanina) das camadas cuticulares e do córtex, utilizando água oxigenada de uso comercial (30 VOL.). O pêlo deve ser depositado na superfície de água oxigenada em recipiente branco que deve ser exposto a luz e calor. Os tempos de imersão variam de acordo com a espessura e o tamanho do pêlo. Após esse período, os pêlos devem ser limpos na água e secados com papel descartável Pêlos descolorindo Ativação do processo pela luz Efeito da despigmentação. 16

18 16- Revisão do processo de despigmentação: Antes de proceder ao preparo das LM, é necessário verificar se o processo de despigmentação foi eficiente, observando a lámina com o pêlo tratado em meio de glicerina. A glicerina tem o mesmo índice de refração que a resina usada na lâmina medular definitiva. Devem ser observados os padrões medulares. Caso o pêlo ainda possui uma pigmentação uniforme (i.e. sem a visualização do córtex incolor), deve passar novamente pelo processo ( 15) Aplicação de uma gota de glicerina Deposição do pêlo descolorido Lâmina identificada pronta. 17

19 16.4- Verificação microscópica do tratamento de despigmentação Successo do tratamento: médula visível através da cutícula descolorida. 18

20 17- Preparo de Lâminas de Medula [LM]: O pêlo descolorido deve ser retirado da glicerina e limpo com álcool. Após a secagem em papel descartável, depositar o pêlo sobre uma lâmina microscópica com resina Entellan (Merck KGaA, Darnmstadt, Alemanha), previamente identificada. Cobrir com lamínula. Deixar secar horizontalmente no mínimo uma hora Limpeza no álcool Aplicação da resina fixante Aplicação da lamínula por cima. 19

21 18- Identificação: começar o trabalho de identificação com a LC identificando o padrão estrutural (Quadros, 2002). O mesmo deve depois ser feito com a LM para identificar o padrão medular. Com base nesses dois padrões, percorrer a chave dicotômica de identificação específica (Quadros, 2002) Padrão medular de Muridae 20

22 Agradecimentos Agradecemos o professor MS. Joaquim Buchaim, Coordenador do Curso de Gestão Ambiental, a possibilidade de realização destes trabalhos e o acesso às infraestruturas e equipamentos do LIMA, Laboratórios Integrados do Meio-Ambiente, a profa. MS. Patrícia Garcia da Silva Carvalho Mena Gomes, Coordenadora de Ciências Biológicas, pelo apoio da edição deste manual, e Alcides Ricieri Rinaldi, biólogo, para a sua ajuda na elaboração deste material educativo. Referência citada Quadros J Identificação microscópica de pêlos de mamíferos Brasileiros e sua aplicação no estudo da dieta de carnívoros. Tese de Mestrado. Universidade Federal do Paraná, Brasil. 130 pp. Fotografias Anne-Sophie Bertrand, Owen McPeake e Matthew Hayes. Gato-maracajá na capa: Med. Vet. Daniel Siqueira