RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO. Título do Projeto de Pesquisa: Caracterização Estrutural E Funcional Do MHC Do Peixe-Boi: Evolução E Conservação

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, INTERDISCIPLINAR, ACERVO, PIBIT, EBTT E FAPESPA Período : Agosto/2016 a Fevereiro/2017 (X) PARCIAL ( ) FINAL RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Caracterização Estrutural E Funcional Do MHC Do Peixe-Boi: Evolução E Conservação Nome do Orientador: Leonardo Dos Santos Sena Titulação do Orientador: Doutor Faculdade: Biomedicina/Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Genética Humana e Médica 3º. andar Título do Plano de Trabalho: Diversidade de MHC-DQB em Peixe-boi-da Amazônia (Trichechus inunguis) e Peixe-boi marinho (T. manatus) Nome do Bolsista: Raphaela Cristina Sanches Progênio Tipo de Bolsa: (X) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/CNPq AF ( ) PIBIC/CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA AF ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR RENOVAÇÃO ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ACERVO ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/VOLUNTÁRIO ( ) PIBIC/PIBIT 1

2 1 INTRODUÇÂO O Complexo Principal de Histocompatibilidade (denominado em inglês de Major Histocompatibility Complex MHC) é uma região do genoma de vertebrados que possui genes que codificam, dentre outras, proteínas capazes de identificar e distinguir moléculas invasoras das moléculas do próprio, podendo montar uma resposta imunológica contra diversos patógenos por meio da apresentação de antígenos (GOLDBERG & RIZZO, 2014). Nesta região é encontrada a sub-região de classe II (onde se encontra o gene DQB), que reúne genes que codificam proteínas apresentadoras de antígenos que irão se ligar a antígenos exógenos. O exón 2 dessas moléculas é importante na ligação de antígenos, pois possui as sequências codificadoras dos sítios de ligação e também por ser altamente polimórfico (KUBY, 1997; SENA, 2003; RADWAN et al., 2010). O elevado polimorfismo evidencia uma maior diversidade de proteínas, o que está relacionado a uma maior capacidade de reconhecer diferentes patógenos. Devido a essa diversidade que o exón 2 foi escolhido como objeto de estudo. Conhecimento sobre a diversidade genética de espécies ameaçadas em conjunto com a investigação do funcionamento e evolução dos genes importantes para o sistema imunológico dos vertebrados vem sendo de grande importância para a pesquisa. Neste contexto, um grupo de mamíferos conhecidos como sirênios pode permitir ampliação do entendimento de como as pressões ambientais interagiram com a genética na região do MHC, ao mesmo tempo em que pode servir de base para avaliar a diversidade genética das espécies para fins de conservação (LUNA, 2013). O peixe-boi (um dos representantes dos sirênios) é de grande importância para as pesquisas evolutivas, tendo destaque neste trabalho o peixe-boi-da-amazônia (Trichechus inunguis), endêmico da região amazônica, e o peixe boi marinho (Trichechus manatus), que ocorre desde a costa nordeste brasileira até a Flórida. Questionamos se pelo fato de os ancestrais dos sirênios terem sido um dos grupos de mamíferos originalmente terrestres que colonizaram o meio aquático isso ter trazido modificações em seu sistema imune, ainda pouco estudado. Assim, é importante entender a evolução do MHC e a sua função frente à nova biota de patógenos no ambiente aquático (VIANNA et al., 2006). A investigação desse sistema pode melhorar o entendimento da adaptação e sobrevivência de populações naturais, que sofreram grande ação antrópica e foram fortemente reduzidas no passado, e da conservação das populações em cativeiro, em sua maioria animais resgatados no ambiente original, dando uma perspectiva para o manejo e recuperação destas importantes espécies (UJVARI & BELOV, 2011; BEST, 1984; LUNA, 2013). Estudos que avaliaram a diversidade genética em populações de peixe-boi marinho e amazônico já existem, sendo que o mais amplo que se conhece foi realizado por Vianna et al. (2006), que utilizaram marcadores mitocondriais e amostras de três espécies de peixe-boi. Esses estudos puderam demonstrar a variação da diversidade genética em relação as localidades de cada população (CANTANHEDE et al., 2005; VIANNA et al., 2006; SATIZÀBAL et al., 2012). Assim, é necessária a utilização de outros marcadores genéticos além dos marcadores mitocondriais e de microssatélites, visto que só eles não são capazes de fornecer uma confirmação definitiva da situação da conservação para sirênios. A diversidade genética do 2

3 MHC nessas espécies é essencial por se tratar de genes com função de defesa e não marcadores neutros. Por isso, a utilização dos genes altamente polimórficos de MHC pode ser uma alternativa para a elucidação da diversidade genética nestes organismos e enriquecer informações acerca da sua estrutura populacional. 2 JUSTIFICATIVA A compreensão da evolução dos genes do MHC e função da apresentação de antígenos depende em grande medida do estudo de sua diversidade e estrutura em diversos grupos de animais. Além disso, devido às pressões seletivas nestes genes atuarem para a manutenção de grande diversidade alélica e estrutural, espécies vulneráveis podem se beneficiar do estudo dos seus genes do MHC de modo a fornecer informações acerca da estrutura populacional e estado de conservação. Portanto, o estudo do MHC de peixe-boi pode fornecer importantes pistas acerca i) da evolução do MHC em modelo de mamífero aquático e ii) da diversidade genética e estrutura populacional neste grupo vulnerável, podendo embasar estratégias de manejo. 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL O objetivo geral deste estudo é caracterizar a estrutura e diversidade do gene DQB do MHC de duas espécies de sirênios. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Como objetivos específicos, temos: - Descrever o polimorfismo do éxon 2 para o gene DQB nas duas espécies de peixe-boi que ocorrem no Brasil (T. manatus e T. inunguis); - Comparar a diversidade genética de DQB com a de marcadores mitocondriais em ambas as espécies de peixe-boi; 4 MATERIAIS E MÉTODOS: 4.1 COLETA DE AMOSTRAS Amostras de sangue peixe-boi amazônico e marinho serão coletadas por técnicos capacitados dos centros onde estes animais estão mantidos em cativeiro, a saber 15 peixes-boi marinhos (Centro Nacional de Conservação e Pesquisa de Mamíferos Aquáticos - CMA, em Itamaracá, PE) e 15 peixes-boi amazônicos (Parque Zoológico das Faculdades Integradas do Tapajós ZOOFIT, em Santarém, PA). Estes animais são em sua maioria resgatados da natureza, incluindo alguns nascidos em cativeiro. 4.2 EXTRAÇÃO DO DNA E RNA 3

4 O sangue foi coletado a partir de punção venosa na nadadeira anterior, sendo reservado em tubo contendo EDTA (cerca de 5 ml de sangue) e mantido a -20 ºC até a extração de DNA. O DNA foi extraído utilizando o DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), seguindo as informações do fabricante. 4.3 PCR E SEQUENCIAMENTO DE GENES DO MHC Para amplificação dos genes de MHC, primers serão construídos para amplificar o exon 2 do gene DQB e primers para a região controle serão utilizados para analisar o haplótipo de DNA mitocondrial. Os produtos de PCR serão confirmados em gel de agarose a 1% corados com brometo de etídio, para confirmação do tamanho do amplificado e ausência de amplificação inespecífica. Produtos de PCR então serão purificados utilizando Illustra ExoProStar 1-Step (GE Healthcare LifeSciences), de acordo com as informações do fabricante, e submetidos a reação de sequenciamento nas duas direções no 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies) com o kit de deoxinucleotídeos BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Para os indivíduos heterozigotos para o gene MHC-DQB, produtos de PCR purificados serão clonados em pgem-t Easy vector (Promega) e pelo menos 5 clones por alelo de cada reação de PCR serão extraídos e sequenciados conforme descrito anteriormente, de forma a definir os alelos em estado heterozigoto de cada animal. 4.4 ANÁLISE DE RESULTADOS A partir dos dados das sequências do éxon 2 do gene MHC-DQB, parâmetros de diversidade genética e diversidade molecular serão calculadas no software ARLEQUIN 3.5 (EXCOFFIER & LISCHER, 2010). A razão entre as substituições não-sinônimas e sinônimas (dn/ds) será calculado para códons da região apresentadora de antígenos dos genes de MHC. 4

5 5 RESULTADOS PARCIAIS 5.1 DESENHO DE PRIMERS E AMPLIFICAÇÃO DO DQB Utilizando a ferramenta BLAST/NCBI, foi possível localizar o gene de DQB homólogo ao DQB humano (HLA-DQB, NCBI Gene ID: 3119). O par de primers foram projetados utilizando o NCBI/Primer-Blast, sendo selecionado o terceiro par de primers, que amplifica o éxon 2 em sua totalidade, incluindo parte do íntron 2 (Figura 1). Os dados do par de primer estão resumidos na Tabela 1. A reação de PCR resultou em um produto do tamanho esperado, sendo possível amplificar com o mesmo par de primers produtos para ambas as espécies. O produto de PCR foi sequenciado, resultando em um produto de 344 pb e homólogo ao DQB de peixe-boi. Figura 1. Par de primers projetados pelo NCBI/Primer-Blast. Tabela 1 Dados do par de primers selecionados que amplificam o éxon 2 do gene DQB de peixe-boi. Sequência (5'->3') Tamanho Início Stop Tm GC% Primer F TCACCGCAGAGGATTTCGTG Primer R CGACTCCTGGAGACTCAACC Tamanho do Produto 344 5

6 5.2 POLIMORFISMO DO DQB E GENOTIPAGEM DAS AMOSTRAS Após a confirmação da amplificação do gene, foi feita PCR e sequenciamento de todos os indivíduos de ambas as espécies. Todos os peixes-boi amazônico testados foram heterozigotos para o gene (17/17), enquanto que cerca de 29,4% dos peixes-boi marinho foram homozigotos (5/17). As amostras heterozigotas foram submetidas a clonagem, onde após a remoção da sequência de primers e do íntron 2, foram descritos 11 alelos de DQB em peixe-boi amazônico e 5 alelos de peixe-boi marinho. Apesar disso, ainda não foi possível fechar o genótipo de todas as amostras, sendo necessário concluir o sequenciamento de clones de sete amostras de T. inunguis e seis amostras de T. manatus (Quadro 1). 5.3 ANÁLISE FILOGENÉTICA Todos os alelos obtidos foram concatenados em um único alinhamento e utilizados para compor uma árvore filogenética. Após testar o modelo evolutivo, foi obtido o modelo GTR+G+I como o que melhor explica os dados obtidos, sendo este modelo utilizado para construí uma árvore por método de máxima verossimilhança (Figura 3). Figura 2. Árvore filogenética dos alelos obtidos. 6

7 Quadro 1. Genotipagem das amostras de peixe-boi para o gene DQB. Peixe-boi Amazônico (Trichechus inunguis) Trin- Trin- Trin- Trin- Trin- Trin- Trin- Trin- Trin- Trin- Trin- Amostra Zigose DQB*01 DQB*02 DQB*03 DQB*04 DQB*05 DQB*06 DQB*07 DQB*08 DQB*09 DQB*10 DQB*11 Tin01 Hetero X X Tin02 Hetero X Provável Tin03 Hetero X X Tin04 Hetero X Provável Tin05 Hetero X Provável Tin06 Hetero Provável Provável Tin07 Hetero X Provável Tin08 Hetero X X Tin09 Hetero X X Tin10 Hetero X X Tin11 Hetero X X Tin12 Hetero X X Tin13 Hetero X X Tin14 Hetero X Provável Tin15 Hetero X X Tin16.1 Hetero X X Tin17.1 Hetero X Provável Tin18.1 Hetero Tin22.1 Homo X Amostra Zigose Trma- Trma- Trma- DQB*01 DQB*02 DQB*03 Tma01 Homo X Tma02 Hetero X Provável Tma03 Hetero X X Tma04 Hetero X Provável Peixe-boi Marinho (Trichechus manatus) Trma- DQB*04 Trma- DQB*05 Tma05 Hetero X Tma07 Homo X Tma08 Hetero X Provável Tma09 Homo X Tma10 Hetero X X Tma11 Homo X X Tma12 Hetero X Provável Tma13.1 Hetero X X Tma14.1 Hetero X Provável Tma15.1 Hetero X Provável Tma16.1 Hetero X X Tma17.1 Hetero X X Tma18.1 Homo X ¹ Provável indica que este alelo foi estimado a partir da comparação de alelos sequenciados na clonagem com a fase do heterozigoto. 7

8 PUBLICAÇÕES: Indicar as publicações originadas do projeto, acrescentando cópias das mesmas, considerando os trabalhos publicados e/ou aceitos para publicação, livros, capítulos de livros, artigos em periódicos nacionais e internacionais, resumos em congressos, seminário de iniciação científica etc. Indicar claramente entre os autores dos trabalhos, quando for o caso, os bolsistas formais de IC. Não houve publicação ainda. ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES Nos próximos meses serão feitas análises mais detalhadas das sequências e se tentará definir os alelos de vários animais. CONCLUSÃO: Os dados permitem concluir que haverá alelos semelhantes entre as duas espécies. Por enquanto, o peixe-boi-da-amazônia parece possuir maior diversidade que o marinho, mas esses dados precisam ser analisados com maior rigor. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BEST, R.C. The aquatic mammals and reptiles of the Amazon. In: SIOLI, H. The Amazon. Limnology and landscape ecology of a mighty tropical river and its basin. Dr. W. Junk Publishers, Boston, CANTANHEDE, A.M.; SILVA, V.M.F.; FARIAS, I.P.; HRBEK, T.; LAZZARINI, S.M.; ALVES-GOMES, J. Phylogeography and population genetics of the endangered Amazonian manatee, Trichechus inunguis Natterer, 1883 (Mammalia, Sirenia). Molecular Ecology, v14, p , FOOTE, A.D.; LIU, Y.; THOMAS, G.W.C.; VINAR, T.; ALFOLDI, J.; DENG, J.; DUGAN, S.; VAN ELK, C.E.; HUNTER, M.E.; JOSHI, V.; KHAN, Z.; KOVAR, C.; LEE, S.L.; LINDBLAD-TOH, K.; MANCIA, A.; NIELSEN, R.; QIN, X.; QU, J.; RANEY, B.J.; VIJAY, N.; WOLF, J.B.W.; HAHN, M.W.; MUZNY, D.M.; WORLEY, K.C.; GILBERT, M.T.P.; GIBBS, R.A. Convergent evolution of the genomes of marine mammals. Nature Genetics, v47, p , KUBY, J. Immunology 3. ed. New York: W. H. Freeman and Company, p. LUNA, F.O. Population genetics and conservation strategies for the West Indian manatee (Trichechus manatus Linnaeus, 1758) in Brazil. 237f. Tese (Doutorado em Oceanografia) Universidade Federal de Pernambuco, RADWAN, J.; BIEDRZYCKA, A.; BABIK, W. Does reduced MHC diversity decrease viability of vertebrate populations? Biological Conservation, v143, p , RECTOR, A.; BOSSART, G.D.; GHIM, S-J.; SUNDBERG, J.P.; JENSON, A.B.; VAN RANST, M. Characterization of a novel closeto-root papillomavirus from a Florida manatee by using multiply primed rolling-circle amplification: Trichechus manatus latirostris papillomavirus type 1. Journal of Virology, v78, p , SATIZÁBAL, P.; MIGNUCCI-GIANNONI, A.A.; DUCHÊNE, S.; CAICEDO-HERRERA, D.; PEREA-SICCHAR, C.M.; GARCÍA- DAVÍLLA, C.R.; TRUJILLO, F.; CABALLERO, S.J. Phylogeography and sex-biased dispersal across riverine manatee populations (Trichechus inunguis and Trichechus manatus) in South America. PLoS ONE, v7, e52468, SENA, L.S. Polimorfismo dos genes DRA, DRB, DQA e DQB Complexo principal de histocompatibilidade de Classe II em búfalo d água (Bubalus bubalis) f. Tese (Doutorado Ciências Biológicas com ênfase em Genética e Biologia Molecular) Universidade Federal do Pará,

9 UJVARI, B. & BELOV, K. Major Histocompatibility Complex (MHC) markers in conservation biology. International Journal of Molecular Sciences, v12, p , VIANNA, J.A.; BONDE, R.K.; CABALLERO, S.; GIRALDO, J.P.; LIMAS, R.P.; CLARK, A.; MARMONTEL, M.; MORALES-VELA, B.; SOUZA, M.J.; PARR, L.; RODRÍGUEZ-LOPES, A.; MIGNUCCI-GIANNONI, A.A.; POWELL, J.A.; SANTOS, F.R. Phylogeography, phylogeny and hybridization in trichechid sirenians: implications for manatee conservation. Molecular Ecology, v14, p , DIFICULDADES - Relacionar os principais fatores negativos que interferiram na execução do projeto. Há dificuldades técnicas na clonagem e no seqüenciamento de alguns indivíduos. PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso. Raphaela Progênio é uma ótima aluna. Possui independência e demonstra entusiasmo com o trabalho. Considero seu desempenho excelente. DATA: 24/fevreiro/2017 ASSINATURA DO ORIENTADOR ASSINATURA DO ALUNO INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição. 9