HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 E 5 E MÉTODOS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 E 5 E MÉTODOS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS Greice Japolla Orientadora: Prof. Dr. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito GOIÂNIA 2012

2 ii GREICE JAPOLLA HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 E 5 E MÉTODOS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Nível: Mestrado. Área de Concentração: Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos (SANHTA) Linha de Pesquisa: Etiopatogenia, epidemiologia, diagnóstico e controle das doenças infecciosas dos animais Orientadora: Prof. Dr. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito IPTSP/UFG Comitê de Orientação: Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza - ICB/UFG Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus - ICB/UFG GOIÂNIA 2012

3 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Os herpesvírus A estrutura dos vírions Replicação viral Enfermidades causadas por BoHV- 1 e BoHV Epidemiologia Métodos diagnósticos Isolamento viral Testes sorológicos Imunofluorescência (IF) Imunoperoxidase (IPX) Soroneutralização Ensaio imunoenzimático Testes moleculares Reação em cadeia da polimerase (PCR) Análise de fragmento após restrição enzimática (REA) CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 24

4 iv LISTA DE FIGURAS FIGURA 1- Micrografia eletrônica de partícula de herpesvírus e desenho esquemático de um herpesvírus...4 FIGURA 2- Ciclo replicativo dos herpesvírus...7 FIGURA 3- Efeito citopático causado pelo BoHV FIGURA 4- Ilustração da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR)...19 FIGURA 5- Ilustração da análise de restrição do genoma do herpesvírus bovino...21

5 1 INTRODUÇÃO O Brasil é um grande produtor e exportador de carne bovina, sendo o centro-oeste brasileiro a principal região detentora de rebanho bovino, com 34,4% do efetivo nacional. O Estado de Goiás possui o quarto maior rebanho do País com uma população bovina de, aproximadamente, 21 milhões de animais, cerca de 10% do total do nacional (IBGE 2010). Estas posições são ameaçadas, pois o rebanho bovino está exposto a agentes causadores de enfermidades que afetam diretamente a sua produtividade, destacando-se desta forma a importância em relação à sanidade dos animais. Os principais microrganismos causadores de doenças nos bovinos são bactérias, protozoários e vírus. No grupo dos vírus são encontrados os herpesvírus causadores de diversas manifestações clínicas e consequentes prejuízos para pecuária mundial. Estima-se que as perdas geradas por enfermidades relacionadas aos herpesvírus alcancem um bilhão de dólares por ano em todo o mundo (DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2010). Os herpesvírus bovinos existentes são dos tipos: 1, 2, 4 e 5, sendo o primeiro e o último os mais conhecidos e disseminados. Ambos pertencem a mesma família (Herpesviridae), sub-família (Alphaherpesvirinae), gênero (Varicellovirus) e apresentam grande similaridade molecular e antigênica. Uma das características desta família referese à capacidade de estabelecer infecções latentes (THIRY et al., 2005), ou seja, o vírus persiste no organismo do animal de forma silenciosa, não detectável por procedimentos virológicos usuais podendo ser reativado e reexcretado possibilitando a multiplicação viral. Para um efetivo controle das enfermidades causadas por esses vírus é necessário um correto diagnóstico dos mesmos, a fim de saber quais são os animais e rebanhos positivos para se tomar as decisões adequadas de prevenção. E também identificar os reais índices de prevalência e incidência do rebanho, além de monitorar o status sanitário dos animais. Para isto, várias técnicas de diagnóstico vêm sendo utilizadas, incluindo entre outras, testes de isolamento viral, técnicas sorológicas como soroneutralização e ensaio imunoenzimático (ELISA), e técnicas moleculares como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e a análise de fragmento após restrição enzimática.

6 2 Diante da importância em se estabelecer um diagnóstico correto, esta revisão tem o objetivo de abordar os principais métodos diagnósticos laboratoriais disponíveis para os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), assim como ressaltar algumas características de estrutura, replicação, epidemiologia de ambos os vírus e as enfermidades por eles causadas.

7 3 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Os herpesvírus Os herpesvírus fazem parte da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, que se divide em três sub-famílias: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae, englobando vírus que ocorrem em diversas espécies animais, como moluscos, peixes, anfíbios, répteis, pássaros e mamíferos. Diferente das outras duas sub-famílias, os alfaherpesvírus apresentam um ciclo de replicação rápido e lítico tanto in vitro quanto in vivo, e possuem capacidade de infectar células epiteliais e nervosas, estabelecendo infecção latente em neurônios de gânglios do sistema nervoso (ROIZMAN et al., 1992). Os membros da sub-família Betaherpesvirinae replicam lentamente, também estabelecem latência e possuem poucos hospedeiros (ROIZMAN & KNIPE, 2001). Já os vírus da subfamília Gammaherpesvirinae infectam linfócitos de forma lítica ou latente e alguns deles possuem potencial oncogênico Quatro são os herpesvírus que infectam bovinos, o herpesvírus bovino (BoHV) tipo 1, BoHV-2, BoHV-4 e BoHV-5. Os tipos BoHV-1 e 5 pertencem ao gênero Varicellovirus da sub-família Alphaherpesvirinae, o BoHV-2 pertence ao gênero Simplexvirus, também um Alphaherpesvirus e é responsável pela mamilite herpética bovina, o BoHV-4 pertence a subfamília Gammaherpesvirina, ao qual ainda não foi atribuído ser causa de nenhuma patologia específica. Os dois tipos de impacto na bovinocultura são os BoHV-1 e 5. O primeiro subdivide-se em BoHV-1.1, BoHV-1.2a e BoHV-1.2b responsáveis pela rinotraqueíte infecciosa bovina, aborto, vulvovaginite pustular infecciosa e balanopostite infecciosa; e o segundo subdivide-se em BoHV-5a, BoHV-5b e BoHV-5na/nb e causam doenças neurológicas (D ARCE et al., 2002, OLIVEIRA, 2006). 2.2 A estrutura dos vírions Os vírions dos herpesvírus consistem em um núcleo (ou core) que contém o genoma viral contendo uma molécula de DNA de fita dupla linear; um capsídeo que exibe uma simetria icosaédrica, um tegumento que recobre o

8 4 capsídeo e é composto por proteínas organizadas em quantidades variáveis e um envelope lipoprotéico contendo espículas de glicoproteínas na sua superfície (Figura 1). O diâmetro dos vírions varia entre 120 e 300 nm (ICTVDB MANAGEMENT, 2006). FIGURA 1: A- Micrografia eletrônica de partícula de herpesvírus. C) capsídeo; T) tegumento; E) envelope; G) glicoproteínas. B- Desenho esquemático de um herpesvírus. Fonte: Adaptado de ESTEVES, (2007); FRANCO & ROEHE, (2007). O envelope viral é uma camada lipídica composto por glicoproteínas, conhecidas como gb, gc, gd, ge, gi, gh, gl, gg, gk e gm, na qual apresentam diferentes funções na replicação e na interação vírus-célula (SCHWYZER; ACKERMANN, 1996). A gb e a gc são as principais glicoproteínas envolvidas no processo de adsorção dos vírions à superfície das células hospedeiras. A gd é uma glicoproteína essencial para a replicação viral e sugere-se que também esteja envolvida na adsorção, penetração e fusão celular. A gc vem sendo estudada para o desenvolvimento de testes diagnósticos, como a PCR e suas variações (nested PCR e multiplex PCR) para a detecção de BoHV-1 ou diferenciação deste do tipo 5. (ESTEVES et al., 2003; CLAUS et al., 2005; CLAUS et al., 2007; ESTEVES, 2007; SILVA, 2009). Há também estudos que utilizam a gc como antígenos, produzindo anticorpos monoclonais diferenciais entre BoHV-1.1 e BoHV-1.2, bem como provas tipo ELISA diferenciais entre BoHV-1.1 e 1.2 e BoHV-1 e BoHV-5 (RIJSEWIJK et al., 1999; SPILKI et al., 2005).

9 5 A ge desempenha um papel importante na neuroinvasividade e neurovirulência no BoHV-5, ela tem sido alvo de deleção para a produção de vacinas diferenciais tanto para o BoHV-1 quanto para o BoHV-5 (HÜBNER et al., 2005). Através da clonagem e expressão de um fragmento da glicoproteína E do BoHV-1 é possível a realização de testes com intuito de diferenciação sorológica entre animais vacinados e animais infectados com o vírus de campo (OLIVEIRA, 2012). Os capsídeos são formados por várias subunidades, chamadas de capsômeros (FRANCO & ROEHE, 2007). O capsídeo é composto por apenas cinco proteínas altamente conservadas (pul19, pul18, pul38, pul35 e pul6) (METTENLEITER et al., 2006). O tegumento está localizado entre o envelope e o capsídeo é uma substância amorfa, composto de proteínas em quantidade variáveis (ROIZMAN & PELLET, 2001). Estas proteínas possuem funções importantes na replicação viral, como a ativação da transcrição dos genes alvos (proteína VP16 ou αtif) e na supressão da síntese protéica celular (VHS) (METTENLEITER et al., 2006). O núcleo (ou core) de um vírion maduro contém o genoma viral conjugado com algumas proteínas codificadas pelo vírus (FRANCO & ROEHE, 2007). O BoHV-5 possui pb e é maior que o genoma do BoHV-1, apresentando uma composição G+C (guanina e citosina) de 75%. Já o BoHV-1 apresenta a composição de G+C de 72% e pb. O genoma de ambos os vírus é constituído por uma molécula de DNA linear de dupla fita viral, pode ser dividido em uma região longa (UL) e uma região curta (US) cercada por duas regiões repetidas e invertidas, sendo uma interna (IR) e outra terminal (TR) (DELHON et al., 2003). O genoma codifica em torno de 70 proteínas, entre elas as glicoproteínas inseridas no envelope viral que foram citadas. 2.3 Replicação viral A penetração do vírus na célula hospedeira e consequente multiplicação viral se iniciam com o encontro de receptores apropriados na superfície das células com glicoproteínas do envelope viral (ROIZMAN & MANDEL, 2005). A maioria dos herpesvírus, provavelmente, reconhece múltiplos

10 6 receptores celulares, qualquer um dos quais pode ser suficiente para a entrada na célula (SPEAR & LONGNECKER, 2003). A partir de então, ocorrem as seguintes fases: 1) adsorção; 2) penetração; 3) transporte do nucleocapsídeo e proteínas virais contidas no tegumento ao núcleo das células infectadas; 4) transcrição, replicação e síntese do DNA e proteínas virais; 5) montagem e preenchimento dos capsídeos e 6) liberação da progênie infecciosa. Presume-se que ocorra de forma semelhante para o BoHV-1 e 5 (ROIZMAN & KNIPE, 2001). A adsorção ocorre quando há a interação do vírus com receptores da membrana das células-alvo permitindo que ocorra uma fusão entre o envelope e a membrana plasmática da célula, consequentemente ocorre uma invaginação e perfuração da membrana, que é a penetração. A adsorção ativa um processo mediado por glicoproteínas virais, onde pelo menos cinco glicoproteínas (gb, gd, gh, gl e gk) estão envolvidas no processo de fusão e penetração do vírus. Após a entrada dos virions no citoplasma das células, o envelope viral desliga-se rapidamente da membrana plasmática e ocorre o transporte dos vírus envelopados para os poros nucleares (WILD et al., 1998). A transcrição do genoma viral se inicia logo após a sua penetração no núcleo. O DNA viral é transcrito pela RNA polimerase II celular com o auxílio de fatores celulares e virais. A síntese de proteínas virais é regulada de forma precisa, pois a expressão de genes virais ocorre de forma coordenada. Os genes virais são divididos em três grupos principais: genes alfa (immediate early ou de transcrição imediata), beta (early ou iniciais) e gama (late ou tardios) (FRANCO & ROEHE, 2007). Para o inicio da expressão desses genes, é necessário que o fator iniciador de transcrição dos gene α (α-tif), uma proteína do tegumento, se conjugue com fatores celulares para estimular a transcrição, cuja função principal é ativar a transcrição dos genes β (TIKOO et. al., 1995). As proteínas beta estão envolvidas na síntese de nucleotídeos trifosfato e na replicação do genoma. Os genes gama somente são transcritos após a replicação do DNA e codificam principalmente proteínas estruturais. Parte dessas proteínas penetra no núcleo e forma pré-capsídeos, nos quais o genoma é introduzido. Os nucleocapsídeos adquirem o envelope por brotamento através da membrana nuclear interna. Podem perder o envelope ao atravessar a membrana nuclear externa e serem reenvelopados no aparelho de Golgi, ou são enviados em vesículas até o Golgi.

11 7 Os vírions envelopados são transportados em vesículas do trans-golgi até a superfície celular, onde são liberados por exocitose (Figura 2) (FRANCO & ROEHE, 2007). FIGURA 2: Ciclo replicativo dos herpesvírus. Fonte: Adaptado de FRANCO & ROEHE, Enfermidades causadas por BoHV- 1 e BoHV-5. O BoHV-1 é um vírus que está associado a uma variedade de afecções clínicas, incluindo rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) (GAY & BARNOUIN, 2009), vulvovaginite pustular infecciosa (IPV), balanopostite infecciosa dos bovinos (IPB), conjuntivite e abortos, interferindo na reprodução do rebanho. Também pode estar associado a desordens neurológicas (ENGELS &

12 8 ACKERMANN, 1996; ROIZMAN & PELLETT, 2001; HENZEL et al., 2008), relatos recentes atribuem a ocorrência de encefalites à infecção por BoHV-1 e BoHV- 1.2b, sendo este último o menos patogênico (BATISTA et al., 2010), porém a maioria das informações sobre enfermidade neurológica, são associadas apenas com o tipo 5. Amostras de BoHV-5 eram consideradas variantes encefalitogênicas de BoHV-1, baseado nas amplas reações cruzadas entre estes dois vírus encontradas em testes sorológicos, mas desde a década de 90 o BoHV-5 é reconhecido como um agente distinto do BoHV-1 (ROIZAMANN et. al., 1992), que possui tropismo por células do sistema nervoso central (SNC), causando doença neurológica aguda (SANCHES et al. 2000), e também o causador da meningoencefalite e sinais neurológicos caracterizados por depressão profunda, incoordenação, anorexia, ptialismo, tremores musculares, bruxismo, salivação, opistótono, cegueira, e convulsões (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006). 2.5 Epidemiologia Embora existam diferenças na prevalência e incidência da infecção pelo BoHV-1, este encontra-se presente em todos os continentes. Em relação ao BoHV-5, infecções por este agente parece ser causa de morbidade e mortalidade importante somente em países do hemisfério Sul, embora tenha sido descrita no hemisfério Norte há muito tempo (D ARCE et al., 2002; GUARINO et al., 2007; FRANCO & ROEHE, 2007). No Brasil o BoHV-1 foi isolado pela primeira vez a partir de um caso de vulvovaginite no ano de 1978, no estado da Bahia. O BoHV-5 foi relatado primeiramente em 1989 a partir da ocorrência de surtos de meningoencefalite no Rio Grande do Sul, ambos os vírus vem sendo diagnosticados até nos dias de hoje. Estudos vêm revelando uma elevada frequência de BoHV-5 no Rio Grande do Sul (CAMPOS et al., 2009; HOLZ et al., 2009), embora ainda se desconheça a sua real prevalência no Brasil, principalmente devido à reatividade sorológica cruzada com BoHV-1. No estado de Goiás, a primeira detecção de anticorpos para esses vírus foi na década de 80 (ANUNCIAÇÃO et al., 1989). Posteriormente estudos

13 9 foram realizados, apontando a presença de anticorpos para o BoHV-1 em soros de animais de propriedades com problemas reprodutivos, incluindo rebanhos de leite, corte e misto, e também animais antes do abate (VIERIA, 2003; AFFONSO, 2010). Em 2009, foi realizado o primeiro isolamento do BoHV-5 no estado (SILVA et al., 2009). O primeiro estudo com amostras de Goiás a comprovar a presença de ambos os vírus (BoHV-1 e BoHV-5), ocorreu em 2011, no qual a identificação foi confirmada através da técnica de multiplex-pcr, em cérebros de bovinos jovens que vieram a óbito com sinais neurológicos (SILVA, 2011). Os bovinos são os hospedeiros naturais do BoHV-1 e 5, entretanto anticorpos já foram encontrados em ovinos, caprinos e bubalinos de animais infectados experimentalmente (DIEL et al., 2007). Uma característica fundamental para a epidemiologia dos herpesvírus é o estabelecimento da infecção latente. Bovinos com infecção latente são reservatórios naturais de ambos os vírus e após a reativação viral, se tornam um risco potencial de contaminação para os animais susceptíveis (SILVA, 2011). As causas dos episódios de reativação permanecem parcialmente desconhecidas. No entanto, alguns fatores desencadeantes são notórios, como o estresse (p. ex.: induzido por transporte, desmame, descorne, parto, carências nutricionais graves ou excesso de trabalho) e aplicação de drogas imunossupressoras (FRANCO & ROEHE, 2007). As infecções pelo BoHV-1 podem ser transmitidas pelo contato direto e indireto entre animais, pois o vírus é disseminado através de secreções respiratórias, oculares e genitais, sendo excretado em grandes quantidades por animais durante a infecção aguda. Quando presente no sêmen de touros infectados, pode ser disseminado tanto por monta natural como por inseminação artificial (FRANCO & ROEHE, 2007). OLIVEIRA et al., (2011) encontraram positividade em quase 50% de amostras de sêmen colhidas nos estados do Rio Grande do Sul e de Goiás. O vírus também já foi encontrado em leite de vacas, sendo esta mais uma possível fonte de infecção para bezerros (CAMPOS, 2009). A transmissão do BoHV-5 provavelmente ocorra de modo semelhante à do BoHV-1, ou seja, por contato direto ou indireto entre animais (RISSI, et al., 2006).

14 Métodos diagnósticos A diversidade dos sinais clínicos, bem como a semelhança destes sinais com outras doenças infecciosas e parasitárias, não permite a elaboração de um diagnóstico clínico conclusivo da infecção ocasionada pelo BoHV-1 ou BoHV-5. Mesmo nos casos de vulvovaginite, onde as lesões são características, o diagnóstico baseado no exame clínico é apenas presuntivo (TAKIUCHI et. al., 2001). Assim sendo, o auxilio das técnicas laboratoriais são necessárias para estabelecer um diagnóstico preciso. Nesta revisão os métodos diagnósticos abordados serão divididos em isolamento viral, testes sorológicos e testes moleculares Isolamento viral O isolamento viral em cultivo celular é considerado o método de diagnóstico etiológico padrão ouro. Para tanto, são utilizadas células de rim, pulmão ou testículo bovino, células de pulmão fetal bovino, traquéia ou células de linhagens estabelecidas, como a Madin-Darby Bovine kidney (MDBK) que são células permissíveis ao vírus (TAKIUCHI et. al., 2001; OLIVEIRA, 2006). Os vírus podem ser isolados de várias fontes: suabe de secreção conjuntival, vaginal, nasal, lavado prepucial, e macerado de alguns órgãos de feto abortado (fígado, baço, rim, pulmão, linfonodo, mucosa do trato respiratório e tonsilas) (HOMAN & EASTERDAY, 1980), áreas com lesões evidentes; tecidos (traquéia, pulmões), soro, sêmen e cérebro, dependendo dos sinais clínicos e do vírus pesquisado. Entre as vantagens destaca-se a universalidade (aplicável a quase todos os vírus) e a obtenção do vírus viável para manutenção e posteriores estudos. Porém o método possui desvantagens, é uma técnica laboriosa, com alto custo e que necessita de correto acondicionamento das amostras por depender de partículas virais viáveis. Além disto, o tempo necessário para obtenção dos resultados pode levar alguns dias e os tecidos podem conter enzimas que são tóxicas para o cultivo de células (FLORES, 1999; TAKIUCHI et. al., 2001).

15 11 Para realização da técnica o material a ser examinado (suspensão de tecidos ou secreções) é inoculado em cultivos celulares apropriados, acompanhase por três a cinco dias para observação do efeito citopático (ECP) (Figura 3) característico para confirmação do diagnóstico (SILVA, 2011). Em geral este ECP é caracterizado por uma macrocitose e perda da morfologia celular, ficando as células bastante arredondadas além de levar à destruição de outras em algumas áreas (OLIVEIRA, 2006). Em cultivos celulares não existem diferenças morfológicas entre os isolados de BoHV-1 e BoHV-5, ou seja, não é possível determinar qual dos dois tipos de vírus esta presente na amostra. Da mesma forma à diferenciação de amostra vacinal e amostra selvagem não é possível determinar (ROEHE et al., 1997b). Fragmentos do sistema nervoso central de bovinos com doença neurológica em rebanhos brasileiros foram submetidos ao isolamento viral em cultivo celular para detecção do BoHV-5, tendo resultados positivos em 39% confirmado por técnicas moleculares, mostrando a distribuição deste vírus nos estados do Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul (CLAUS et al., 2007). No Rio Grande do Sul, BATISTA e colaboradores (2010), identificaram através do isolamento viral, a presença do BoHV-1 em encéfalos de bovinos submetidos ao diagnóstico de raiva. KUNERT FILHO, 2011 realizou a técnica de isolamento viral em encéfalos bovinos também submetidos ao diagnóstico de raiva, na busca do BoHV-1 e 5 e todas as amostras foram negativas, porém as mesmas amostras quando submetidas à amplificação por nested PCR tiveram positividade, portanto estes resultados devem ser analisados com cautela, pois mesmo com presença do genoma dos vírus não é possível afirmar que ambos os vírus são causadores de encefalites devido a impossibilidade de isolar o vírus em forma infecciosa. Após a realização do isolamento, a identificação do agente viral pode ser efetuada com o emprego de outras técnicas, como imunofluorescência (IF), imunoperoxidase (IPX) e técnicas moleculares que quando utilizadas levam a um resultado mais rápido (ROEHE et al., 1997b). Estas técnicas serão abordadas posteriormente.

16 12 Figura 3: Efeito citopático causado pelo BoHV-1. Fonte: Arquivo Pessoal, Testes sorológicos Os testes sorológicos podem ser usados na pesquisa de antígenos virais ou de anticorpos. Várias técnicas têm sido aplicadas para o diagnóstico do herpesvírus bovino. Para detecção de antígenos podem ser usados anticorpos monoclonais ou policlonais. Anticorpos monoclonais (AcM) são anticorpos de especificidade única, derivados de um único clone de células B e que respondem a um único epítopo. Já os anticorpos policlonais detectam uma multiplicidade de epítopos, reconhecendo antígenos diferentes (BECK, 2005). O uso de anticorpos policlonais em testes diagnósticos efetua-se quando se pretende detectar mais do que uma estirpe de um patógeno (RODRIGUES, 1998). A utilização de ambos anticorpos tem sido uma alternativa empregada em várias áreas da saúde, sendo sua aplicação cada vez mais comum e essencial em técnicas de diagnósticos e na pesquisa.

17 Imunofluorescência (IF) O diagnóstico rápido buscando a identificação de células contendo antígenos virais em secreções ou tecidos pode ser obtido através das provas de imunofluorescência. Estes testes dependem essencialmente do tipo de anticorpos empregados para a detecção do antígeno. Se realizados com anticorpos policlonais, provavelmente serão incapazes de diferenciar entre amostras de BoHV-1 e BoHV-5. Contudo, se realizados com anticorpos monoclonais tipoespecíficos, poderão ser capazes de diferenciar entre estes vírus (ROEHE et al., 1997a). A imunofluorescência (IF) permite a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares utilizando substâncias fluorescentes. A técnica consiste em usar anticorpos (policlonal ou monoclonal) produzidos especialmente contra o vírus desejado, conjugado a uma substância fluorescente. Esse anticorpo conjugado (ou marcado), quando incubado com o antígeno, ligase especificamente. Ao ser exposto à luz ultravioleta, a substância fluorescente emite luz (amarelo-esverdeada) que pode ser observada ao microscópio. Portanto, quando há a presença de proteínas virais no material a ser examinado, há a emissão de fluorescência (FLORES, 1999). ALKAN e colaboradores (2000) apontaram a técnica de imunofluorescência como importante ferramenta para detectar o antígeno do BoHV-1 em suabes. KUNRATH et al., 2004 detectaram antígenos virais do BoHV- 1 e BoHV-5 em secreções nasais de bezerros por imunofluorescência em células descamativas e compararam o resultado com a técnica de isolamento viral, 89,6% apresentaram resultados concordantes nos dois testes. Comparando-se com o isolamento, a IF apresentou sensibilidade de 96,6%, especificidade de 70,9%, e precisão de 89,6%. Esses resultados indicam que a detecção de antígenos em células descamativas presentes em secreções nasais coletadas com swabs representa uma alternativa para o diagnóstico de infecções agudas pelo BoHV-1 e BoHV-5. Além da especificidade, outra vantagem da técnica de IF é a rapidez de obtenção dos resultados. Considerando-se a preparação das lâminas, fixação e execução da técnica, o procedimento pode ser concluído em menos de duas horas. Em situações de surto, em que um diagnóstico etiológico ágil é necessário

18 14 para direcionar as medidas a serem adotadas, esse método pode representar uma alternativa rápida e segura de diagnóstico. No entanto o sucesso da técnica depende da correta coleta e estocagem do material, apesar de não exigirem a infecciosidade da partícula viral, é fundamental a integridade estrutural da partícula e das proteínas virais. (TAKIUCHI et al., 2001; KUNRATH et al., 2004) Imunoperoxidase (IPX) É uma técnica de detecção de antígenos, que utiliza anticorpos específicos conjugados com uma enzima. A presença do antígeno no material suspeito é indicada pela mudança de coloração do substrato enzimático que é adicionado no final da reação. A IPX pode ser adaptada para detecção de antígenos em vários materiais, incluindo células de cultivo, células sanguíneas, tecidos congelados e cortes histológicos parafinizados (FLORES, 1999). Assim como na IF, a técnica de IPX, apesar de não exigir a infecciosidade do vírus, podem ser seriamente comprometidas caso a integridade estrutural da partícula não seja mantida, por falhas de transporte e estocagem (TAKIUCHI et al., 2001). A IPX é uma técnica bastante específica na detecção de antígenos virais, principalmente quando se usa anticorpos monoclonais, permitindo a caracterização do BoHV-1 e BoHV-5 (ROEHE et al., 1997a; D ARCE et al., 2002; SOUZA et al., 2002). Pesquisas utilizando esta técnica são pouco realizadas Soroneutralização Uma forma para identificação da infecção é feita pela detecção de anticorpos neutralizantes através da reação de soroneutralização (SN). O teste é utilizado para detectar anticorpos que possuem a capacidade de neutralizar a infectividade do vírus (anticorpos neutralizantes). Inicialmente, incuba-se o soroteste com o vírus (BoHV-1 ou BoHV-5). A mistura é adicionada a cultivos celulares susceptíveis a replicação viral. O cultivo é então monitorado por três a cinco dias. Se o soro possuir anticorpos, o vírus será neutralizado e não produzirá efeito citopático nas células. Se o soro não possuir anticorpos, o vírus

19 15 permanecerá viável e causará citopatologia nas células de cultivo (FINO et al., 2012). A detecção de anticorpos no soro em um teste isolado indica somente que o animal teve contato prévio com o agente, seja por infecção natural ou por vacinação, possuindo significado limitado quando o objetivo é diagnosticar um evento de doença clínica, sendo necessário, portanto duas coletas de soro: a primeira durante a fase aguda e a segunda três a quatro semanas após. Um aumento de quatro vezes no título de anticorpos entre as duas coletas é indicativo da infecção e pode confirmar o diagnóstico (FRANCO & ROEHE, 2007). Apesar de ser considerada uma técnica sorológica padrão, possui algumas desvantagens por ser um teste laborioso, por não permitir distinção entre o BoHV-1 e BoHV-5 em decorrência das reações cruzadas e por não permitir um diagnóstico rápido (MÉDICI et al., 2000, CAMPOS et al., 2009). Alguns autores pesquisaram métodos para a realização do teste de soroneutralização utilizando anticorpos monoclonais no intuito de uma técnica mais rápida e obtiveram sucesso nos resultados (KUNRATH et. al, 2004). Outro aspecto a ser levado em consideração é o fato de existir vários subtipos de vírus, tornando difícil a escolha de qual subtipo utilizar para realização do teste. Com relação a este fato, estudos recentes comprovaram que existe variação na detecção de soros positivos dependente da amostra viral utilizada, podendo alterar a sensibilidade da técnica. Para a otimização da técnica HOLZ, 2008 realizou uma investigação constatando que a utilização de apenas um subtipo viral nos testes pode prejudicar a detecção de animais soropositivos, comprometendo programas de controle. Ao utilizar apenas um cepa viral a sensibilidade mostrou-se reduzida. Porém, quando o teste foi realizado com seis cepas virais (entre tipos e subtipos), a sensibilidade apresentou-se bastante elevada e viável para utilização em estudos soroepidemiológicos. Geralmente é utilizado somente uma amostra viral para realização da SN, sendo que o uso de várias amostras demonstrou melhorar a sensibilidade do teste. (HOLZ et al., 2009, VARELA et al., 2010; HOLZ et al., 2010). Para minimizar o risco da introdução de animais infectados em rebanhos, os testes sorológicos devem ser sensíveis o suficiente para evitar resultados falso-negativos.

20 Ensaio imunoenzimático Outra técnica sorológica bastante utilizada é o ensaio imunoenzimático (EIE) ou enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA), que é sensível e específico. Existem testes comerciais ou os conhecidos como ELISA in house, por ser feito com reagentes preparados no laboratório, ambas as maneiras possuem uma variedade nos testes, podendo ser classificados como indireto, direto ou competitivo/bloqueio. São encontrados para ambos os vírus, porém para o BoHV-5 testes específicos são mais raros (NANDI et al., 2007). Os testes de ELISA podem ser utilizados para detectar antígenos ou anticorpos, com base em interações anticorpo-antígeno, sendo que um desses dois é fixado em um poço de placa de microtitulação. A seguir a amostra é aplicada, se houver anticorpos/antígenos na amostra em teste ocorrerá a ligação antígeno-anticorpo, que é determinada pela ação de um conjugado que contém enzima, ao adicionar um substrato para este enzima os orifícios onde ocorreram a reação antígeno-anticorpo apresentam uma coloração. No método de ELISA competitivo ou de bloqueio, o soro teste é incubado com o antígeno antes de ser inoculado na placa com anticorpos, ocorrendo a reação antígeno- anticorpo, o antígeno na se ligara na placa, é adicionado um segundo anticorpo conjugado com enzima e um substrato, em um teste positivo, não haverá mudança de cor, devido a inicial incubação do antígeno com o anticorpo (FLORES, 1999). A técnica apresenta vantagens em comparação a SN, permitindo o processamento de um grande número de amostras, é também de relativa facilidade e de rápida execução. Uma das principais desvantagens dessa técnica é que o uso destes testes é dificultado pelo custo de aquisição de kit para realização do ELISA, em virtude disto alguns laboratórios produzem e padronizam seu próprio material (TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005; ESTEVES, 2007). Na tentativa de desenvolver e padronizar um teste de ELISA, com base em anticorpos monoclonais (AcMs), para a detecção de anticorpos contra BoHV-1 e/ou BoHV-5, BAUERMANN et al., (2010) obtiveram resultados positivos no sentido de constituir uma alternativa para o teste de SN e para os kits de ELISA importados, entretanto, como nos outros estudos não há possibilidade de diferenciação entre os dois agentes, ou seja, reações cruzadas foram detectadas.

21 17 Uma grande dificuldade no diagnóstico do BoHV-1 e 5 é a incapacidade de diferenciação sorológica entre os animais vacinados e os naturalmente infectados. Assim, vacinas diferenciais com deleção da glicoproteína E (ge) têm sido desenvolvidas com essa finalidade. A ge tem sido alvo de deleção para a produção de vacinas diferenciais tanto para o BoHV-1 quanto para o BoHV-5. Como na vacina o gene está deletado, apenas animais naturalmente infectados irão apresentar o antígeno da ge (BRUM et al., 2010; OLIVEIRA, 2012). A utilização de testes diagnósticos capazes de diferenciar a produção de anticorpos vacinais dos induzidos pelo vírus de campo são necessários quando utilizadas estas vacinais. Esta diferenciação pode se realizada por um teste de ELISA que detecta anticorpos contra a proteína ausente no vírus vacinal (ge), mas presente no vírus de campo (OLIVEIRA, 2012). Na Europa, há algum tempo já utiliza-se testes de ELISA para detecção da ge, devido ao uso de vacinas com vírus com deleção da ge (MUYLKENS et al., 2007), no Brasil, OLIVEIRA 2012, desenvolveu um teste diferencial de ELISA com esta finalidade que foi capaz de diferenciar sorologicamente animais vacinados com a cepa ge deletada do BoHV-5 dos animais experimentalmente infectados com BoHV-1 ou BoHV-5. Apesar da padronização da técnica por alguns autores do Brasil, o teste não é comercializado, provavelmente devido à metodologia empregada, dificultando a produção em larga escala, ou até por falta de interesse pelas indústrias produtoras deste teste. Além disto, nenhum dos testes avaliaram a eficiência na detecção de anticorpos contra BoHV-5 (TEIXEIRA et al., 2001, FERRERA et. al., 2005) Testes moleculares Técnicas de biologia molecular, para a detecção do genoma viral, como a PCR e a análise de fragmento após restrição enzimática podem ser empregadas com sucesso para o diagnóstico dos herpesvírus. Além da identificação de ácidos nucleicos virais, estes testes são importantes na identificação de animais positivos durante a forma latente da infecção (CAMPOS, 2009).

22 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Técnicas baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido os métodos de diagnósticos mais explorados nos últimos anos, apresentado elevados índices de sensibilidade e especificidade, além da rapidez de execução (ESTEVES, 2007). A PCR tem como objetivo a amplificação de uma região alvo no DNA viral, consistindo na síntese in vitro de uma grande quantidade de cópias de um segmento de DNA existente na amostra. O processo ocorre em três etapas: desnaturação, anelamento ou hibridização e polimerização. A região-alvo a ser amplificada é delimitada por primers, que são oligonucleotídeos sintéticos de aproximadamente 20 nucleotídeos. A PCR envolve a realização de vários ciclos, na desnaturação (95 C) a temperatura alta causa separação das moléculas de cadeia dupla do DNA, após ocorre o anelamento dos primes (50-60 ), esses primers hibridizam com suas regiões complementares, que se localizam nas cadeias opostas do DNA, nas regiões flanqueadoras da sequência alvo, e em seguida ocorre a polimerização (72 C) da cadeia de DNA a partir dos primers, pela enzima DNA polimerase, esta enzima atua adicionando as bases, uma a uma, a partir da extremidade dos primers, copiando a molécula molde ( Figura 4). A cada ciclo o número de moléculas correspondentes à sequência-alvo duplica e, no final da reação, acumulam-se milhões de cópias idênticas correspondentes à sequência-alvo inicial. Essas moléculas, denominadas genericamente de produtos de PCR ou amplicons, podem, então, ser detectadas visualmente após corrida eletroforética em géis de agarose, corados com brometo de etídio ou outros corantes sob luz UV (BRUM & WEIBLEN, 2007). Algumas variantes da PCR foram desenvolvidas para os diagnósticos do BoHV-1 e BoHV-5 como a nested PCR, multiplex PCR, e PCR em tempo real. Esta última recentemente está se tornando uma ferramenta muito útil no diagnóstico de viroses, tanto na medicina humana como veterinária. É uma técnica qualitativa e quantitativa e possibilita a obtenção de um resultado preciso e rápido, não necessitando de análise em gel de agarose (CORBELLINI, 2011). Embora seja possível caracterização e consequente diferenciação entre o BoHV-1 e BoHV-5, por meio desta técnica, poucos são os estudos realizados no intuito de diferenciá-los.

23 19 FIGURA 4: Ilustração da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Fonte: Adaptado de BRUM & WEIBLEN, (2007). A nested-pcr é uma segunda amplificação em um produto já amplificado, utilizando-se este produto da primeira reação como molde e um outro conjunto de primers complementares a sequências localizadas internamente no produto da primeira reação. Com isso, esta sequência interna do primeiro produto é reamplificada. Em relação à PCR tradicional, a nested-pcr possui as vantagens de maior sensibilidade (duas etapas de amplificação) e especificidade (BRUM & WEIBLEN, 2007). No caso dos herpesvírus uma reação de PCR é

24 20 realizada para identificar a presença do vírus, sem entretanto diferenciar entre o BoHV-1 e 5 (ESTEVES, 2007). A nested-pcr é então aplicada no intuito de caracterização do BoHV como tipo 1 ou 5. O método da multiplex-pcr baseia-se na utilização de dois ou mais pares de primers na mesma reação. Devido a sua versatilidade, essa técnica é utilizada para a identificação de diferentes agentes ou variantes do mesmo agente em uma única reação. A realização de uma única reação diminui a possibilidade de contaminação das amostras (BRUM & WEIBLEN, 2007). Este método também pode ser realizada no intuito de diagnóstico diferencial de encefalites bovinas provocadas por BoHV-1 e BoHV-5 (FONSECA Jr. et al., 2011). Outra vantagem destas técnicas moleculares é que uma ampla variedade de amostras biológicas pode ser utilizada no diagnóstico, tais como: fragmentos de tecidos de feto abortado, sistema nervoso central, secreções, sêmen e cultura de tecidos, contendo partículas virais viáveis e não viáveis, sendo que a técnica possibilita a detecção de partículas virais latentes, pois a análise é feita por meio da identificação do genoma viral, o que confere a técnica com de extrema importância nos casos de latência. Também pode ser realizada em tecidos parafinizados, permitindo estudos retrospectivos (TAKIUCHI et al., 2001, ARRUDA et al., 2010; FINO et al., 2012). Amplificações de regiões conservadas dos genes que codificam glicoproteínas gb, gc, ge e a timidina quinase vem sendo estudadas (CLAUS et al., 2005; AOKI, 2006; SILVA, 2009). Vários protocolos de PCR (ESTEVES, 2007; FIGUEIREDO, 2009), nested PCR (CAMPOS, et al., 2009) e multiplex-pcr(claus et al., 2005; ARRUDA et al., 2010; FONSECA Jr. et al., 2011) vêm sendo desenvolvidos e padronizados para identificação do BoHV-1 e BoHV-5, no caso do multiplex-pcr, com intuito de cada vez mais se ter um teste específico, rápido, conclusivo e que permita a detecção e a identificação simultânea de ambos os vírus.

25 Análise de fragmento após restrição enzimática (REA) A identificação viral e a determinação de subtipos virais podem ocorrer pela análise de restrição por enzimas (endonucleases) que clivam o DNA em sítios específicos. Assim o genoma de um determinado vírus DNA é clivado por uma ou mais endonucleases produzindo um determinado perfil de bandas após corrida eletroforética (Figura 5). Diferentes isolados do vírus, irão gerar padrões de clivagem distintos, podendo-se, assim, fazer a diferenciação entre isolados (BRUM & WEIBLEN, 2007). FIGURA 5: Ilustração da análise de restrição do genoma do herpesvírus bovino.fonte: Adaptado de BRUM & WEIBLEN, (2007).

26 22 Por meio dessa técnica, isolados respiratórios de herpesvírus foram classificados como BoHV-1.1 e isolados de doença genital como BoHV-1.2. Em relação aos subtipos do BoHV-5, estes são classificados também com a restrição enzimática em BoHV-5a, BoHV-5b e BoHV5na/nb (não a e não b) (D ARCE et al., 2002). BATISTA et al., (2010) através da REA determinaram os subtipos BoHV-1.1 e BoHV-1.2b a partir de encéfalos de bovinos submetidos ao diagnóstico de raiva no estado do Rio Grande do Sul. A opção de diferenciar BoHV-1 de BoHV-5 por restrição enzimática deve-se ao fato de o BoHV-1 também causar danos neurológicos (RISSI et al., 2008). SILVA et al., (2007), encontraram genoma de BoHV-1 em 19,3% (5 em 26 casos) dos encéfalos de bovinos com doenças neurológicas, contradizendo autores que afirmam que o BoHV-1 é raramente associado a encefalite.

27 23 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS Os BoHV tipos 1 e 5 são importantes patógenos de bovinos causadores de enfermidades e estão associados a perdas econômicas relevantes na bovinocultura do Brasil e em vários outros países, sendo de grande importância o conhecimento da epidemiologia de ambos os vírus e consequente diagnóstico. Com a realização de um correto diagnóstico é possível determinar a distribuição das doenças nos vários grupos etários, os índices de prevalência e/ ou incidência, monitorar o status sanitário dos animais e avaliar o progresso ou sucesso de programas de controle ou erradicação. Portanto para todos estes feitos, é necessário avaliação de alguns fatores para escolha de quais técnicas serão utilizadas, como: disponibilidade do teste, custo, rapidez, facilidade de execução, sensibilidade e especificidade. Várias são os métodos de diagnósticos realizados, alguns deles utilizados somente para pesquisa e outros na rotina de laboratórios. O isolamento viral é considerado padrão-ouro, mas é uma técnica laboriosa, com alto custo e que necessita de correto acondicionamento das amostras. Com relação aos testes sorológicos, é necessário o desenvolvimento de técnicas mais rápidas para a SN. O teste de ELISA tem ótima sensibilidade e especificidade, porém no Brasil o uso é dificultado pelo custo de aquisição dos mesmos, sendo necessárias mais pesquisas brasileiras para efetiva padronização dos kits e disponibilização para venda e que possam competir com os kits disponíveis no mercado. Já as técnicas moleculares permitem a identificação e diferenciação dos vírus, são versáteis e muito utilizadas. Com os avanços da biologia molecular, as perspectivas futuras são a seleção e caracterização de anticorpos e peptídeos recombinantes na utilização dos testes diagnósticos, como por exemplo, o desenvolvimento de um teste de ELISA com uso de peptídeos sintéticos. A diversidade dos testes de diagnóstico permite o uso de combinações das técnicas, possibilitando maior clareza e precisão dos resultados.

28 24 REFERÊNCIAS 1. AFFONSO, I. B.; AMORIL, J. G.; ALEXANDRINO, B.; BUZINARO, M. G.; MEDEIROS, A. S. R.; SAMARA, S. I. Anticorpos contra o herpesvírus bovino tipo 1 (bohv-1) nas dez regiões de planejamento do estado de goiás, Brasil. Ciência Animal Brasileira, Goiânia, v. 11, n. 4, p , ALKAN, F.; OZKUL, A.; BILGE-DAGALP, S.; YESILBAG, K.; OGUZOGLU, T. C.; AKÇA, Y.; BURGU I. Virological and serological studies on the role of PI-3 virus, BRSV, BVDV, and BHV-1 on respiratory infections of cattle. I. The detection of etiological agents by direct immunofluorescence technique. Dtsch Tierarztl Wochenschr, Ankara, v. 107, n. 5, p , ANUNCIAÇÃO, A. V. M.; LEITE, R. C.; MOREIRA, E. C. Presença de anticorpos para o herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) em bovinos nos Estados de Minas Gerais, Goiás e Rio de Janeiro, através da prova de hemaglutinação passiva. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.41, n.5, p , AOKI, S. M. Desenvolvimento de novas metodologias para a identificação e caracterização genética de herpesvírus bovino tipo 1 (bhv-1) f. Tese ( Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Botucatu. 5. ARRUDA, L. P.; NAKAZATO, L.; DUTRA, V.; LEMOS, R. A. A.;, NOGUEIRA, A. P. A.; CRUZ, R. A. S.; PESCADOR, C. A.; COLODEL, E. M. Detecção molecular de herpesvírus bovino 1 e 5 em amostras de encéfalo conservadas em formol e emblocadas em parafina provenientes de bovinos com doença neurológica. Pesquisa Veterinária Brasileira, Cuiabá, v. 30, n. 8, p , BATISTA, H. B. C. R.; SCHMIDT, E.; SPILKI, F. R.; FRANCO, A. C.; ROEHE, P. M. Herpesvírus bovinos (BoHV-1.1 e BoHV-1.2b) em forma infecciosa em encéfalos de bovinos submetidos ao diagnóstico de raiva no estado do Rio

29 25 Grande do Sul. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 62, n. 5, p , BAUERMANN, F. V.;BRUM, M. C. S.; WEIBLEN, R.;FLORES E, F. Teste imunoenzimático com base em anticorpo monoclonal para a detecção de anticorpos contra os herpesvírus bovino tipos 1 e 5. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 30 n. 5 p , BECK, P. A. Caracterização de anticorpos monoclonais contra rotavírus bovino e suas aplicações como ferramenta de diagnóstico f. Dissertação (Mestrado em Imunologia) Universidade Federal da Bahia, Salvador. 9. BRUM, M. C. S.; CARON, L.; CHOWDHURY, S. I.; WEIBLEN, R.; FLORES, E. F. Immunogenicity of an inactivated bovine herpesvirus type 5 strain defective in the glycoprotein E. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 30, p , BRUM, M. C. S.; WEIBLEN, R. Detecção, identificação e quantificação de virus In: FLORES, E.F. Virologia Veterinária, Ed. UFSM, cap.3, p CAMPOS, F.S. Detecção de infecções latentes por herpesvirus bovino 1 e 5 em gânglios trigêmeos de bovinos através da técnica de reação em cadeia da polimerase f. Dissertacao (Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 12. CAMPOS, F.S.; FRANCO, A. C.; HÜBNER, S.O.; OLIVEIRA, M. T.; SILVA, A. D.; ESTEVES, P. A.; ROEHE, P. M.; RIJSEWIJK, F. A. High prevalence of coinfections with bovine herpesvirus 1 and 5 found in cattle in southern Brazil. Veterinary Microbiology, v. 139, p CLAUS, M. P.; ALFIERI, A. F.; FOLGUERAS-FLATSCHART, A. V.; WOSIACKI, S. R.; MEDICI, K. C.; ALFIERI, A. A. Rapid detection and differentiation of bovine herpesvirus 1 and 5 glycoprotein C gene in clinical

30 26 specimens by multiplex-pcr. Journal of Virological Methods, Londres, v. 128, n. 1-2, p , CLAUS, M. P.; ALFIERI A. A.; MÉDICI K. C.; LUNARDI, M.; ALFIERI A. A. Bovine herpesvirus 5 detection by virus isolation in cell culture and multiplex-pcr in central nervous system from cattle with neurological disease in brazilian herds. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 38, p , CORBELLINI, A. O. Estabelecimento de uma reação em cadeia dea polimerase em tempo real para detecção de animais persistentemente infectados plo vírus da diarreia viral bovina f. Dissertacao (Mestrado em Ciência Veterinária) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 16. D ARCE, R. C. F.; ALMEIDA, R. S.; SILVA, T. C.; FRANCO, A. C.; SPILKI, F.; ROEHE, P. M.; ARNS, C. W. Restriction endonuclease and monoclonal antibody analysis of Brazilian isolates of bovine herpesvirus type 1 and 5. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.88, p , DEL MÉDICO ZAJAC, M. P.; LADELFA, M. F.; KOTSIAS, F.; MUYLKENS, B.; THIRY, J.; ROMERA, S. A. Biology of bovine herpesvirus 5. The Veterinary Journal, Geneva, v. 184, p , DELHON, G.; MORAES, M. P.; LU, Z.; AFONSO, C. L.; FLORES, E. F.; WEIBLEN, R.; KUTISH, G. F.; ROCK, D. L. Genome of bovine herpesvírus 5. Journal of Virology, Washington, v.77, n.19, p , DIEL, D. G.; ALMEIDA, S. R.; BRUM, M. C.; DEZENGRINI, R.; WEIBLEN, R.; FLORES, E. F. Acute and latent infection by bovine herpesvirus type 5 in experimentally infected goats. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.121, p , ENGELS, M.; ACKERMANN, M. Pathogenesis of ruminant herpesvirus infections. Veterinary Microbiology, Zürich, v. 53, n. 1-2, p.3-15, 1996.

31 ESTEVES, P. A. Análise da região carboxi-terminal da Glicoproteína C (gc) e sua utilização na diferenciação entre herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) f. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 22. ESTEVES, P. A.; SPILKI, F. R.; FRANCO, A. C.; SILVA, T. C. OLIVEIRA, E. A.; MOOJEN, V.; ESMERALDINO, A. M.; ROEHE, P. M. Bovine herpesvirus type 5 in the semen of a Bull not exhibiting clinical signs. Veterinary Records, Londres, v. 152, n. 21, p , FERRERA, C.; MÉDICI, K. C.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F.. Desenvolvimento e avaliação de um ensaio imunoenzimático para o diagnóstico sorológico da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 1. Semina, Londrina, v. 26, n. 3, p , FIGUEIREDO, L. A. Presença do genoma de herpesvirus bovino 5 e do herpesvírus bovino 1 no snc de bovinos sadios, portadores de meningoencefalite herpética e outras encefalopatias f. Dissertação (Mestrado em Saúde Animal) Universidade de Brasília, Brasília. 25. FINO, T. C. M.; MELO, C.B.; RAMOS, A.F.; LEITE, R. C. Infecções por herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e suas implicações na reprodução bovina Revisão de Literatura. Revista Brasileira Reprodução Animal, Belo Horizonte, v.36, n.2, FLORES, E. Diagnóstico Virológico. Apostila. Universidade Federal de Santa Maria, FRANCO, A.C.; ROEHE, P.M. Herpesviridae, In: Flores, E. F., Virologia Veterinária. ed ufsm, cap. 17, p , FONSECA JR, A. A.; COSTA, E. A.; OLIVEIRA, T. S.; SALES, E. B.; SALES, M. L.; LEITE, R. C.; Heneimann, M. B.; REIS, J.K. PCR Multiplex para detecção

32 28 dos principais herpesvírus neurológicos de ruminantes. Arquivo Brasileiro Medicina Veterinária e Zootecinia, Belo Horizonte, v. 63, n. 6, p , GAY, E.; BARNOUIN, J. A nation-wide epidemiological study of acute bovine respiratory disease in France. Preventive Veterinary Medicine, v.89, p , GUARINO, H; NÚÑEZ, A.; REPISO, M. V; GIL, A.; DARGATZ, D. A. Prevalence of serum antibodies to bovine herpesvirus-1 and bovine viral diarrhea virus in beef cattle in Uruguay. Preventive Veterinary Medicine, v. 85, p , HENZEL, A.; DIEL, D. G.; ARENHART, S.; VOGEL, F. S. F.; WEIBELN, R.; FLORES, E. F. Aspectos virológicos e clínico-patológicos da infecção genital aguda e latente pelo herpesvírus bovino tipo 1.2 em bezerras experimentalmente infectadas. Pesquisa Veterinária Brasleira, Rio de Janeiro, v. 28, p , HOLZ, C.L.; CIBULSKI, S.P.; TEIXEIRA, T.F.; CAIXETA, S.P.M.B.; BATISTA, H.B.C.R.; CAMPOS, F.S.; ROEHE, L.R.; OLIVEIRA, M.T.; SILVA, J.R.1; DEZEN, D.; VARELA, A.P.M.; FRANCO, A.C.; ROEHE, P.M. Soroprevalência de herpesvírus bovinos tipos 1 e/ou 5 no Estado do Rio Grande do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 29, p , HOLZ, C. L. Otimização da soroneutralização com diferentes tipos e subtipos de herpesvírus bovino e sua aplicação a epidemiologia f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 34. HOLZ, C. L.; CIBULSKI, S. P.; TEIXEIRA, T. F.; BATISTA, H. B. C. R.; DEZEN, D.; CAMPOS, F. S.; VARELA, A. P. M.; ROEHE, P. M. Serum neutralization with different types and subtypes of bovine herpesvirus 1 and 5. Pesquisa Veterinária Animal, Rio de Janeiro, v. 30, n. 7, 2010.