O objetivo deste roteiro é apresentar os procedimentos básicos adotados para o uso dos

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1 Caro usuário, O objetivo deste roteiro é apresentar os procedimentos básicos adotados para o uso dos diferentes equipamentos disponibilizados no Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul para o desenvolvimento de atividades de pesquisa, ensino e extensão por pesquisadores da UFRGS e de outras Instituições. A utilização destes equipamentos poderá ser agendada mediante submissão e aprovação de projeto encaminhado através de formulário padrão para cme@ufrgs.br. Cada equipamento possui um pesquisador responsável que avaliará os respectivos projetos e emitirá parecer sobre a viabilidade técnica do uso do equipamento para o projeto específico. A tabela de custos pode ser solicitada através de cme@ufrgs.br. Maiores informações estão disponíveis em Desejamos sucesso a todos e colocamo-nos à disposição para maiores esclarecimentos através de cme@ufrgs.br. Cordialmente Naira Maria Balzaretti Diretora CME Fátima Therezinha C. Rodrigues Guma Vice-Diretora CME 1

2 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA (JSM 6060 E JSM5800) PROFESSOR RESPONSÁVEL: Luis Frederico Dick Ramal: 7537 lfdick@ufrgs.br TÉCNICOS RESPONSÁVEIS: Karina Marckmann e Leandro Menezes Baum Ramais: 7064 / 7066 karina.marckmann@gmail.com leandrombaum@pop.com.br CARACTERÍSTICAS DOS EQUIPAMENTOS: O MEV JSM 5800 é um MEV analítico e se destina ao estudo de amostras inorgânicas e orgânicas,/poliméricas com restrições. O microscópio opera numa tensão de 0,1 a 30 kv com resolução máxima de 3 nm, podendo ser utilizado em observações convencionais de imagem em elétrons secundários (SEI), imagens em elétrons retro-espalhados (BEI), microanálises de difração por elétrons retro espalhados (EBSD) e microanálise química elementar (EDS), com ou sem uso de padrões para análise e medida de corrente de feixe. 2

3 O MEV JSM 6060 também se destina ao estudo de amostras inorgânicas, com restrições para amostras orgânicas e poliméricas, e opera numa tensão de 0,1 a 30 kv, podendo ser utilizado em observações convencionais de imagem em elétrons secundários (SEI). PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS: A preparação das amostras deve ser previamente discutida e agendada diretamente com os técnicos responsáveis pelos equipamentos. Amostras orgânicas e poliméricas, ou outros materiais que degasam, tais como ossos, dentes, materiais orgânicos porosos, etc., necessitam de procedimentos de montagem e observação especiais, devendo ser previamente acordadas com o professor responsável pelo equipamento. Amostras de materiais pastosos ou oleosos, tais como asfalto, parafina, ceras, etc. não são permitidas. O usuário deve obedecer as determinações do roteiro de utilização e possuir seu próprio material de consumo, tais como porta-amostra (stubs), materiais de fixação, etc. Amostras que necessitam metalização devem ser entregues, devidamente preparadas, montadas em stub e acondicionadas, com 24 horas de antecedência. Caso esta regra não seja obedecida, eventuais horas marcadas serão cobradas. Qualquer dúvida contate os técnicos previamente. Não é de responsabilidade do técnico realizar preparação de amostra, conhecer o método de análise e nem interpretar os resultados. USUÁRIOS: A utilização do JSM 5800 e JSM 6060 será realizada apenas por usuários credenciados no CME, autorizados pelos professores responsáveis pelos equipamentos. Apenas pesquisadores, alunos de pós-graduação e professores da UFRGS poderão se credenciar como usuários qualificados. Alunos de iniciação científica deverão estar acompanhados por usuário credenciado durante toda a análise. Casos especiais deverão ser previamente discutidos. 3

4 Usuários externos à UFRGS devem contatar a direção do CME. Todos os usuários deverão seguir e obedecer às determinações do roteiro de utilização do microscópio e seus equipamentos periféricos. Danos aos equipamentos por imperícia ou por não seguir estas instruções serão de responsabilidade dos usuários. SESSÕES DE USO: Cada sessão tem duração mínima de 1 hora, sendo freqüentemente monitorada por técnico responsável. Não serão marcadas horas fracionadas ou que iniciem e terminem no meio do turno, para haver melhor aproveitamento dos equipamentos Após a seção o usuário deve preencher o formulário padrão especificando as características físicas de cada amostra e assinar o livro de registro. A marcação de sessões deve ser feita através do sistema CPD (ver instruções específicas da Direção) ou por telefone com os técnicos responsáveis pelo equipamento ( ). Estão habilitados a solicitar sessões usuários autorizados em projeto cadastrado no CME. As instruções para cadastro podem ser solicitadas para a direção (cme@ufrgs.br). O agendamento de sessões será catalogado por usuário, por microscópio, marcando-se um horário por vez. O próximo horário somente poderá ser marcado após o uso do horário previamente agendado. Sessões onde é solicitada a operação do microscópio pelo técnico responsável devem ser previamente agendadas e necessariamente acompanhadas pelo usuário. Não é de responsabilidade do técnico realizar preparação de amostra, conhecer o método de análise e nem interpretar os resultados. SEGURANÇA E MANUTENÇÃO: O usuário deve sempre obedecer as regras do roteiro de utilização do microscópio, e solicitar a presença do técnico para qualquer procedimento não previsto nestas instruções. Apenas usuários autorizados poderão fazer inserção e retirada de amostras do MEV. O usuário deve solicitar a presença do técnico sempre que observar qualquer situação anormal de funcionamento dos equipamentos. 4

5 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO DE 120 kv (JEM 1200EXII) PROFESSORA RESPONSÁVEL: Maria Cristina F. Heuser Ramal: 3789 TÉCNICAS RESPONSÁVEIS: Christiane de Queiroz Lopes Moema Queiroz Vieira Ramais: 7065 / 7057 CARACTERÍSTICAS DO EQUIPAMENTO: O MET JEM1200 EXII se destina ao estudo de amostras orgânicas e inorgânicas. O microscópio opera numa tensão entre 80Kv e 100Kv, podendo ser utilizado em observações convencionais (resolução para imagem de ponto: 0,45nm, resolução de linha: 0,20nm, faixa de magnificação: 50x a x), Difração de elétrons, Porta Amostras duplo. O microscópio possui uma câmera CCD para aquisição de imagens e câmera para negativos. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS: 5

6 A preparação das amostras deve ser previamente discutida e agendada diretamente com o técnico responsável pelos equipamentos. O usuário deve ter treinamento para uso dos equipamentos, seguir as instruções de uso específico e possuir seu próprio material de consumo ou repor o material utilizado do CME. USUÁRIOS: A utilização do JEM 1200EXII será realizada apenas por usuários qualificados. Apenas pesquisadores, alunos de pós-graduação e professores da UFRGS poderão se credenciar como usuários qualificados. Usuários externos à UFRGS devem contatar a direção do CME. Todos os usuários deverão seguir as instruções de uso do microscópio e equipamentos periféricos. SESSÕES DE USO: Cada sessão tem duração de 3 horas, sendo monitorada por técnico responsável. A marcação de sessões deve ser feita através do sistema CPD (ver instruções específicas da Direção) ou por telefone com as técnicas responsáveis pelo equipamento. Estão habilitados a solicitar sessões, usuários participantes de projeto cadastrado. O agendamento de sessões será catalogado por projeto. A marcação de uma nova seção só poderá ser realizada após o término da mesma. Usuários qualificados participantes em mais de um projeto serão tratados como se fossem participantes de um único projeto, estando sujeitos às mesmas regras de marcação definidas acima. As sessões de uso por parte de usuários qualificados terão um custo conforme tabela definida pela Direção do CME. Não é de responsabilidade do técnico realizar preparação de amostra, conhecer o método de análise e nem interpretar os resultados. Os horários das sessões são: MANHÃ: 9 hs até 12 hs TARDE: 14 hs até 17 hs Segurança e manutenção: O usuário deve sempre seguir as instruções de uso do microscópio, e solicitar a presença do técnico para qualquer procedimento não previsto nestas instruções. O usuário deve solicitar a presença do técnico sempre que observar qualquer situação anormal de funcionamento dos equipamentos. 6

7 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO DE 200 kv (JEM 2010) PROFESSOR RESPONSÁVEL: Paulo F. P. Fichtner Ramal: 6558 TÉCNICA RESPONSÁVEL: Aline Tais da Rosa Ramais: 7331 / 7055 / 7326 alinetais@gmail.com CARACTERÍSTICAS DO EQUIPAMENTO: O MET JEM2010 se destina ao estudo de amostras inorgânicas. O microscópio opera numa tensão de 200 kv, podendo ser utilizado em observações convencionais, alta resolução (resolução de ponto: 0,25 nm, resolução linha: 0,14 nm), difração com feixe convergente, difração em modo nano-feixe e análise por EDS. O microscópio possui uma câmera CCD para aquisição de imagens, e câmera de negativos para registro de padrões de difração. 7

8 As amostras devem ter 3 mm de diâmetro, altura máxima da borda de 130 µm e espessura compatível com a transparência ao feixe de elétrons na região de interesse (tipicamente entre 20 a 300 nm dependendo do material e técnica de observação). Amostras magnéticas ou isolantes necessitam de procedimentos de montagem e observação especiais, devendo ser previamente acordadas com o professor responsável pelo equipamento. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS: A preparação das amostras deve ser previamente discutida e agendada diretamente com o técnico responsável pelos equipamentos. O usuário deve ter treinamento para uso dos equipamentos, seguir as instruções de uso específico e possuir seu próprio material de consumo ou repor o material utilizado do CME. USUÁRIOS: A utilização do JEM 2010 será realizada apenas por usuários qualificados, credenciados mediante treinamento (com custo) oferecido pelo CME. Apenas pesquisadores, alunos de pós-graduação e professores da UFRGS poderão se credenciar como usuários qualificados. Usuários externos à UFRGS devem contatar a direção do CME. Todos os usuários deverão seguir as instruções de uso do microscópio e equipamentos periféricos. SESSÕES DE USO: Cada sessão tem duração de 3 horas, sendo freqüentemente monitorada por técnico responsável. A amostra (já preparada) deve ser entregue no mínimo duas horas antes da sessão. Antes do início da seção o usuário deve preencher o formulário padrão especificando as características físicas de cada amostra (ver anexo 1) e assinar no livro de registro. A marcação de sessões deve ser feita através do sistema CPD (ver instruções específicas da Direção) ou por telefone com a técnica responsável pelo equipamento. Estão habilitados a solicitar sessões usuários participantes de projeto cadastrado. O agendamento de sessões será catalogado por projeto, considerando dois casos: i. projetos com menos de 3 usuários qualificados a operar o microscópio poderão agendar apenas uma sessão de uso antecipadamente. ii. projetos com 3 ou mais usuários qualificados a operar o microscópio podem ter duas sessões previamente agendadas. A marcação de uma nova seção só poderá ser realizada após o término de uma das sessões previamente agendadas. 8

9 Usuários qualificados participantes em mais de um projeto serão tratados como se fossem participantes de um único projeto, estando sujeitos às mesmas regras de marcação definidas acima. As sessões de uso por parte de usuários qualificados terão um custo conforme tabela definida pela Direção do CME. Sessões onde é solicitada a operação do microscópio pelo técnico responsável devem ser previamente agendadas e necessariamente acompanhadas pelo usuário. Não é de responsabilidade do técnico realizar preparação de amostra, conhecer o método de análise e nem interpretar os resultados. Os horários das sessões são: Segurança e manutenção: MANHÃ: 8 h 30 min até 11 h 30 min TARDE: 13 h até 16 h O usuário deve sempre seguir as instruções de uso do microscópio, e solicitar a presença do técnico para qualquer procedimento não previsto nestas instruções. O usuário deve solicitar a presença do técnico sempre que observar qualquer situação anormal de funcionamento dos equipamentos. 9

10 ANEXO 1 CME Centro de Microscopia Eletrônica UFRGS USO DO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO 200 Kv Usuário: Orientador: Unidade: DADOS DA AMOSTRA 1. Especificar composição química provável: 2. Contém elementos radioativos? ( ) Não ( ) Sim. Especificar: 3. Contém compostos voláteis? ( ) Não ( ) Sim. Especificar: 4. Contém elementos tóxicos (e.g. As, Hg, etc)? ( ) Não ( ) Sim. Especificar: 5. Especificar quais são as prováveis fases existentes: 6. É material isolante elétrico? ( ) Não ( ) Sim. Especificar: 7. É material magnético? ( ) Não ( ) Sim. Especificar: 8. Especificar forma inicial do material (pó, filme/substrato, líquido, pedaços sólidos macroscópicos, etc): 9. O material é estável termicamente? ( ) Não ( ) Sim. Especificar: 10. O material é estável frente à irradiação de elétrons? ( ) Não ( ) Sim DA UTILIZAÇÃO DO MICROSCÓPIO DATA: / / TURNO: ( ) Manhã ( ) Tarde ( ) Noite USO: ( ) EDS ( ) CCD ( ) C8D ( ) Outros: N NEGATIVOS: OBSERVAÇÕES: ASSINATURA DO USUÁRIO: ASSINATURA DO TÉCNICO: 10

11 MICROSCÓPIO CONFOCAL ESPECTRAL FV1000 PROFESSOR RESPONSÁVEL: Fátima Guma Ramal: 5546 APOIO CIENTÍFICO: Letícia Pettenuzzo Ramal: 5547 TÉCNICO RESPONSÁVEL: Henrique Biehl Ramais: 7064 / 7066 hbbiehl@gmail.com CARACTERÍSTICAS DO EQUIPAMENTO: O Microscópio Confocal FV1000 se destina, principalmente, ao estudo de amostras biológicas (in vivo e fixadas) fluorescentes (autofluorescentes ou marcadas). O microscópio também tem capacidade para fazer análises topográficas simples, por reflexão, em amostras sólidas, com pequeno aumento (10X). 11

12 Em breve, será instalado o sistema para trabalho com células e fatias de tecidos in vivo. As características deste sistema serão informadas posteriormente. O microscópio está equipado com 4 lasers de fase sólida: Lasers Excitação 405nm 473nm 559nm 635nm PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS: A preparação das amostras deve ser feita pelo usuário, em seu laboratório, uma vez que o CME não dispõe de laboratório para preparação deste tipo de amostras. Recomendações gerais: 1) A amostra deve ser coberta por uma lamínula (coverslip)(no caso de cultura, preparada sobre a lamínula) de 0,17 mm. Esta lamínula deve ser fixada à lâmina (pode ser utilizado esmalte para isso). As lâminas e lamínulas devem estar limpas e sem restos de esmalte ou meio de montagem. 2) Verificar a presença de autofluorescência na amostra, e garantir que o sinal procurado seja superior a essa autofluorescência. 3) Preparar sempre uma lâmina somente com o anticorpo secundário (controle negativo), usando meio de montagem sem DAPI. Isso será especialmente importante em estudos de colocalização. 4) Escolha do Fluorocromo: Ao escolher os marcadores fluorescentes levar em consideração as linhas dos lasers e espelhos dicróicos disponíveis no equipamento. a) Para marcações duplas ou triplas, os fluoróforos devem ser excitados com linhas de lasers diferentes e os espectros de emissão devem ser bem separados e com o mínimo de sobreposição. 12

13 b) Além disso, levar em consideração a estabilidade do fluorocromo utilizado, tendo o cuidado de evitar os que sofrem photobleach rapidamente, principalmente se for necessário utilizar o eixo Z. c) Temos boa experiência com os fluoróforos Alexa Flúor 488, 555 e 568. O Alexa Flúor 405 é um bom fluorocromo, mas apresenta um photobleach rápido. Para o núcleo, temos experiência com os corantes Hoechst e DAPI, que são estáveis, mas podem interferir com o Alexa 488 e o FitC, portanto utilize-os quando realmente quiser visualizar núcleos. Também temos experiência com Oil Red, TritC, FitC e Fluorojade, sendo que os últimos são pouco estáveis à luz (photobleach rápido). USUÁRIOS: A utilização do microscópio confocal será realizada apenas por usuários credenciados no CME, autorizados pelos professores responsáveis pelos projetos cadastrados. Apenas pesquisadores, alunos de pós-graduação e professores da UFRGS poderão se credenciar como usuários qualificados. Alunos de Iniciação Científica deverão estar acompanhados por usuário credenciado ou deverão ter prévia autorização do professor responsável pelo equipamento. Usuários externos à UFRGS devem contatar a direção do CME. SESSÕES DE USO: Cada sessão tem duração mínima de 3 horas, sendo o microscópio operado pelo técnico responsável. São marcados turnos, correspondentes à manhã (9-12h) ou tarde (14-17h). Após a seção o usuário deverá assinar o livro de registro. A marcação de sessões deve ser feita através do sistema CPD (ver instruções específicas da Direção) ou por telefone com o técnico responsável pelo equipamento. O agendamento de sessões será catalogado por usuário, por microscópio, marcando-se um horário por vez. O próximo horário somente poderá ser marcado após o uso. As sessões de uso por parte de usuários terão um custo conforme tabela definida pela Direção do CME. Sessões devem ser necessariamente acompanhadas pelo usuário. Não é de responsabilidade do técnico conhecer a amostra e nem interpretar os resultados. 13

14 CONSIDERAÇÕES FINAIS: Cada usuário deverá portar consigo uma imagem (artigo ou arquivo) do que deseja visualizar. O usuário deverá visualizar sua amostra previamente em um microscópio de fluorescência convencional para avaliar a qualidade de sua preparação. Amostras com muito background ou com marcação muito fraca não ficarão muito melhores no confocal. Limite o número de imagens ao mínimo necessário. Os arquivos gerados serão de responsabilidade do usuário: cada usuário terá um diretório no HD para arquivamento temporário, e deverá providenciar o backup dos arquivos para CD ou DVD. O prazo para backup é de 30 dias. Após este período os arquivos serão apagados sem aviso prévio. Lembre-se: o microscópio não está conectado à Internet e está proibida a utilização de pen drive, portanto leve seu(s) CD/ DVD (para imagens com eixo Z podem ser gerados arquivos muito grandes e pode ser necessário o uso de mais de um CD ou de um DVD). 14

15 DIFRATÔMETRO DE RAIOS X PROFESSOR RESPONSÁVEL: Sergio Ribeiro Teixeira Ramal: 6498 durao@if.ufrgs.br Difratômetro projetado para análise de materiais em geral Óptica apropriada para analise de materiais com alta resolução Apropriado para estudos em epitaxia, stress, difratometria assimétrica e textura, entre outros. 15

16 LABORATÓRIO DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS Corte de materiais Serra de diamante Cortador ultrasônico Puncher Ultramicrotomia com navalha de vidro Ultramicrotomia com navalha de diamante Cortes com espessura de 10 a 1000 nm Crioultramicrotomia Cortes com espessura de 10 a 1000 nm Temperatura até -196 C Polimento mecânico Politriz de alta velocidade Politriz de baixa velocidade Tripod Dimpler Disc grinder Materais: lixas, lixas especiais, panos de polimento, pastas de diamante, sílica coloidal Polimento eletrolítico e eletroquímico equipado com banho térmico Polimento iônico Metalizações Sputtering Alvos disponíveis: ouro, platina Evaporação Materiais para evaporação: fio de carbono, bastão de carbono, alumínio, ouro, platina Etching físico Porta-amostra plano e planetário Preparação de réplicas Dessecação Ponto crítico Freeze-drying 16

17 Preparação de colas Prato quente Forno Outros equipamentos disponíveis: Knifemaker Responsáveis: Prof. Dr. Paulo Fernando Papaleo e Prof. Dr. Rinaldo Pires dos Santos Apoio técnico: Christiane de Queiroz Lopes, Moema Queiroz, Aline Tais da Rosa e Leandro Menezes Baum LABORATÓRIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS MacIntosh com Zip Drive, gravador/leitor de DVD e monitor 19" 1 PC com CD ROM e monitor 15" Scanner próprio para negativos Programas disponíveis: Adobe Photoshop 5.5 Responsável: Direção CME Apoio técnico: Moema Queiroz Vieira LABORATÓRIO DE PROCESSAMENTO FOTOGRÁFICO 2 salas de revelação 1 sala de ampliação Revelação de negativos e ampliação Reprovit (reproduz de foto para negativo) Duas ampliadoras Negatoscópio (auxilia na visão do negativo com lupa manual) Responsável: Direção CME Apoio técnico: Christiane de Queiroz Lopes e Moema Queiroz 17