PERFIL CROMATOGRÁFICO DE EXTRATO DE CASCA DE CEBOLA ROXA (Allium cepa L.)

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1 PERFIL CROMATOGRÁFICO DE EXTRATO DE CASCA DE CEBOLA ROXA (Allium cepa L.) V.B. Viera 1,2, N. Piovesan 1, A. A. Boligon 4, M.de.A. Cavalcante 2, E.M de Oliveira 3, E.H. Kubota 1, 1-Departamento de Ciências e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos CEP: Santa Maria RS Brasil, Telefone: 55 (55) (vanessa.viera@ifap.edu.br; natipiovesan@yahoo.com.br; ernestokubota@smail.ufsm.br) 2-Instituto Federal do Amapá CEP: Macapá AP Brasil, Telefone: 55 (96) (marilia.cavalcante@ifap.edu.br) 3-Universidade do Estado do Amapá CEP: Macapá AP Brasil, Telefone: 55 (96) (elisaengal@hotmail.com) 4-Universidade Federal de Santa Maria CEP: Santa Maria RS Brasil, Telefone: 55 (55) (alineboligon@hotmail.com). RESUMO Este trabalho teve como objetivo avaliar a concentração de compostos bioativos de extratos de casca de cebola roxa. A análise cromatográfica foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Arranjos de Diodo (CLAE-DAD). O perfil cromatográfico revelou a presença de cianidina, ácido gálico, catequina, cianidina-3-o-glicosídeo, ácido elágico, ácido p- cumárico, rutina, quercitrina, quercitina, canferol e luteolina. Os compostos mais abundantes encontrados nos extratos foram quercitrina, cianidina 3-0-glucosídeo, canferol e cianidina, os quais não apresentaram diferença significativa entre si. ABSTRACT This study aimed to evaluate the Bioactive Compounds concentration of red onion peel extracts. Chromatographic analysis was performed by High Performance Liquid Chromatography with Diode Arrangements for detection (HPLC -DAD). The chromatographic profile revealed the presence of cyanidin, gallic acid, catechin, cyanidin -3 -o- glycoside, ellagic acid, p- coumaric acid, rutin, quercitrin, quercetin, luteolin and Kaempferol. Compound more abundant without extracts was a quercitrin, cyanidin glucosid, cyanidin and kaempferol, which did not show significant difference between them. PALAVRAS-CHAVE: cebola roxa, flavonóides, compostos bioativos. KEYWORDS: red onion; flavonoids; bioactive compounds. 1. INTRODUÇÃO O gênero Allium possui mais de 500 membros, com diferente aparência, cor e sabor, porém apresentam semelhança na bioquímica, fitoquímica e no conteúdo nutracêutico. Possuem atividade antibacteriana e antifúngica, contém enxofre e numeros compostos fenólicos que despertam grande interesse (Griffiths et al., 2002).

2 A cebola é particularmente rica em dois grupos de compostos com comprovado beneficio à saúde humana: flavonoides e sulfóxidos de cisteína (compostos organosulfurados). Dois sub-grupos de compostos do tipo flavonoides predominam nas cebolas: as antocianinas (conferem a coloração avermelhada ou roxa aos bulbos) e as quercetinas e seus derivados (conferem coloração amarelada). As antocianinas, quercetinas e seus derivados são de grande interesse pelas suas propriedades anticarcinogênicas (Souza, 2008). Apesar do grande interesse que as cebolas têm despertado na área de antioxidantes, poucos estudos têm abordado a capacidade antioxidante das espécies de cebola. Cebolas vermelhas, brancas e amarelas, são de fato, conhecidas por conter uma grande quantidade de flavonóides, sendo a maioria derivados glicosilados de quercitina e campferol (Lee e Mitchell, 2011; Shim et al., 2011). As cascas contêm significativamente maiores teores de flavonoides do que o parte comestível, em cerca de 2-10 g/kg Contêm derivados de quercetina que representam mais de 80% do teor total de flavonoides nas cebolas (Galdon; Rodri'guez; Romero, 2008). Contudo, as cascas da cebola são descartadas durante o processamento dos vegetais e tampouco utilizadas na indústria de alimentos. Diante do exposto, este estudo tem como objetivo caracterizar o perfil cromatográfico das substâncias bioativas presentes na casca de cebola roxa visando o aproveitamento tecnológico dos resíduos das indústrias de alimentos. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Matéria-prima Cebolas roxas foram adquiridas em estabelecimento comercial, localizado na cidade de Santa Maria, Rio Grande do Sul. Foram selecionadas quanto a ausência de defeitos, pragas e doenças, tiveram suas superfícies lavadas com detergente neutro para remover a sujeira e sanitizadas com 200 mg.l -1 de hipoclorito de sódio durante 20 min sendo, em seguida, descascadas manualmente com facas de aço inoxidável. As cascas foram colocadas em bandejas e levadas para estufa de circulação de ar (Marconi, MA-035/100, Piracicaba, Brasil) forçada à 50 C por 24 horas. Após foram trituradas em moinho analítico refrigerado à 4 C (Quimis, modelo Q298A21, Brasil) com o auxílio de um banho de ultra-termostatizado (Solab, modelo SL-152/10) e armazenadas em frasco âmbar á temperatura de - 18ºC, até a obtenção do extrato. 2.2 Obtenção do extrato extração convencional por agitação Os extratos foram obtidos a partir da amostra moída, pesada e transferida para um béquer envolto de papel alumínio com capacidade de 100 ml. A amostra foi adicionada de solvente álcool de cereais na proporção 1:20 (m/v) e levada ao banho ultratermostatizado (Solab, modelo SL-152/10). Foi inserido agitador (Marconi MA-039), iniciando a agitação constante. A extração foi realizada na temperatura de C sob com concentração de solvente 60 v/v e tempo de 20 minutos. Após os extratos foram filtrados em papel filtro qualitativo e centrifugados a 3000 rpm por 15 minutos. Os sobrenadantes acondicionados em frascos âmbar e armazenados em freezer (-18 C) até o momento das análises. 2.3 Quantificação dos compostos por CLAE-DAD Para as analises por CLAE foram injetados 40µL de cada extrato de cebolas roxa (Allium cepa L.) em uma concentração de 10mg/mL em coluna Phenomenex C 18 (4,6 mm x 250 mm), carregada com partículas de diâmetro 5 m. A fase móvel utilizada consistiu de solvente A (etanol: água, 9:1,

3 v/v) ajustado para ph 2,0 com ácido fosfórico e o solvente B (acetonitrilo: água: metanol; 60:20:20, v/v/v). O fluxo utilizado foi de 0,6 ml/min, usado o seguinte gradiente linear: 0 min 100 % de A; 10 min 30 % de A; 20 min, 40 % de A; 50 min, 0 % de A; mantida a 0 % de A durante 15 min. Cinco minutos de equilíbrio a 100 % de A foi permitido antes e depois de cada injecção (Boligon et al., 2015a). As amostras e a fase móvel foram filtradas através de filtro de membrana de 0,45 um (Millipore) e em seguida desgaseificada por banho de ultrassom antes da utilização. As soluções de referência foram preparadas na fase móvel para HPLC nas concentrações de 0, mg/ml. Quantificações foram realizadas por integração dos picos utilizando o método do padrão externo, a 254 nm para o ácido gálico e ácido elágico; 280 nm para catequina; 327 nm para o ácido p-cumárico; 366 nm para a quercetina, quercitrina, rutina, canferol e luteolina; e 520 nm para cianidina e cianidina 3-0-glicosídeo. Os picos cromatográficos foram confirmados por comparação do seu tempo de retenção com os de padrões de referência e por espectros de DAD (200 a 500 nm). Todas as operações de cromatografia foram realizadas a temperatura ambiente e em triplicata. 2.4 Limite de detecção e limite de quantificação Foram calculados com base no desvio padrão das respostas e a inclinação por meio de três curvas de análise independentes, tal como definido por Boligon et al. (2015b). Limite de detecção e de quantificação foi calculado como 3,3 e 10 σ /S, respectivamente, onde σ é o desvio padrão da resposta e S é o declive da curva de calibração. 2.5 Análise Estatística Diferenças entre grupos de HPLC foram avaliadas por uma análise de modelo de variância e teste de Tukey. O nível de significância para as análises foi definida como p < 0,05. Estas análises foram realizadas utilizando o software livre R versão (R Core Team, 2014). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 HPLC análises O cromatograma do extrato de cebola roxa (Allium cepa L.) revelou a presença de cianidina (t R = 7.95 min; pico 1), ácido gálico (t R = min; pico 2), catequina (t R = min; pico 3), cianidina-3-o-glicosídeo (t R = 18,23 min; pico 4), ácido elágico (t R = min; pico 5), ácido p- cumárico (t R = min; pico 6), rutina (t R = min; pico 7), quercitrina (t R = min; pico 8), quercitina (t R = min; pico 9), canferol (t R = min; pico 10) e luteolina (t R = min; pico 11) (Figura 1 e Tabela 1). Figura 1 Perfil cromatográfico representativo de extratos de casca de cebola roxa, 327nm.

4 O conteúdo de fenólicos, flavonoides e antocianinas podem ser visualizados na Tabela 1. O composto em maior quantidade nos extratos de casca de cebola roxa foi a quercitrina, cianidina 3-0- glucosídeo, canferol e cianidina não diferindo (P>0.05) entre si. No entanto, os compostos catequina e luteolina foram os encontrados em menor quantidade na casca de cebola roxa (Tabela 1). Albishi et al. (2013) ao determinar os compostos fenólicos de diferentes variedades de casca de cebola, encontraram resultado semelhante para quercitina (2.99 mg/g de casca) e inferior para canferol (1.15 mg/g) quando comparados com os deste estudo. Tabela 1 Compostos fenólicos, flavonoides e antocianinas presentes no extrato de cebola roxa. Compostos LD LQ mg/g mg/ml mg/ml Cianidina 3.41 ± 0.02 a Àcido gálico 2.74 ± 0.01 b Catequina 0.63 ± 0.01 d Cianidina 3-0-glicosídeo 4.35 ± 0.01 a Ácido elágico 2.81 ± 0.02 b Ácido p-cumárico 1.56 ± 0.01 c Rutina 0.19 ± 0.03 e Quercitrina 4.37 ± 0.02 a Quercitina 2.82 ± 0.01 b Canferol 3.45 ± 0.01 a Luteolina 0.69 ± 0.02 d Resultados são expressos em média ± desvio padrão (DP) de três determinações. Colunas seguidas por diferentes letras diferem pelo teste Tukey p < LD: limite de detecção e LQ: limite de quantificação. Estudos realizados sobre o gênero Allium revelaram a ocorrência de mais de 60 flavonóides em cebola, consistindo em aglicona e derivados glicosilados de quercetina e kaempferol (Griffiths et al., 2002). Bonaccorsi et al. (2008) relataram quercetina,3,4-0-diglicosídeo, quercetina-40-glicosídeo, quercetina-3-glicosídeo como os principais flavonóides em Allium cepa e Allium oscalonicum. Prakash et al. (2007) encontraram ácido gálico, ferúlico, ácido protocatecóico, quercetina e canferol em diferentes variedades de Allium cepa oriundos da Índia. Entre os componentes identificados, canferol e seus conjugados luteolina e apigenina foram reconhecidos como compostos com atividades biológicas, principalmente, antioxidante, antibacteriana, anti-inflamatória e citotóxica. 4. CONCLUSÃO

5 Pode-se concluir que os extratos de casca de cebola roxa contêm cianidina, ácido gálico, catequina, cianidina-3-o-glicosídeo, ácido elágico, ácido p-cumárico, rutina, quercitrina, quercitina, canferol e luteolina, sendo os mais abundantes a quercitrina, cianidina 3-0-glucosídeo, canferol e cianidina, os quais não apresentaram diferença significativa entre si. Além disso, uma vez que a atividade antioxidante da casca de cebola roxa tem sido correlacionada com a presença de flavonóides, sugere-se assim, que a casca possua boa capacidade antioxidante (dados não mostrados). 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Albishi, T., Jonh, J. A., Al-Khalifa, A. S., & Shahidi. F. (2013). Antioxidative phenolic constituents of skins of onion varieties and their activities. Journal of Functional Foods, 5(1), Boligon, A. A., Pimentel, V. C., Bagatini, M. D., & Athayde, M. L. (2015 a). Effect of Scutia buxifolia Reissek in nucleotidase activities and inhibition of platelet aggregation. Journal of Natural Medicine, 69, Boligon A. A., Piana, M., Kubiça, T. F., Mario, D. N., Dalmolin, T. V., Bonez, P. C., Weiblen, R., Lovato, L., Alves, S. H., Campos, M. M. A., & Athayde, M. L. (2015b). HPLC analysis and antimicrobial, antimycobacterial and antiviral activities of Tabernaemontana catharinensis A. DC. Journal of Applied Biomedicine, 13, Bonaccorsi, P., Caristi, C., Gargiulli, C., & Leuzzi, U. (2008). Flavonol glucosides in Allium species: A comparative study by means of HPLC-DAD-ESI-MS MS. Food Chemistry, 107, Galdo n, R. B., Rodri guez, R. E. M., & Romero, D. C. (2008). Flavonoids in onion cultivars (Allium cepa L.). Journal of Food Science, 73(8), Griffiths, G., Trueman, L., Crowthwe, T., Thomas, B., & Smith, B. (2002). Onions: a global benefits to health. Phytotherapy Research, 16(7), Lee, J., & Mitchell, A. E. (2011). Quercetin and isorhamnetin glycosides in onion (Allium cepa L.): Varietal comparison, physical distribution, co-product evaluation, ans long-term storage stability. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(3), Prakash, D., Singh, B. N., & Upadhyay, G. (2007). Antioxidant and free radical scavenging activities of phenols from onion (Allium cepa). Food Chemistry, 102, R Core Team (2014). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL Shim, S. M., Yi, H. L., & Kim, Y. S. (2011). Bioaccessibility of flavonoids and total phenolic content in onions and its relationship with antioxidant activity. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 62(8), Souza, M. M de. (2008). Avaliação da atividade antifúngica e antimicotoxinas de extratos de farelo de arroz, cebola e microalga chlorella. (Dissertação de mestrado). Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande.