UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO POLIMORFISMO DO GENE TP53 (CÓDON 72) EM INDIVÍDUOS PORTADORES DE GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO MARCELO JORDÃO LOPES DA SILVA RIBEIRÃO PRETO 2011

2 MARCELO JORDÃO LOPES DA SILVA POLIMORFISMO DO GENE TP53 (CÓDON 72) EM INDIVÍDUOS PORTADORES DE GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto de São Paulo, para obtenção do Titulo de Doutor em Ciências Médicas. Área de Concentração: Mecanismos Fisiopatológicos no Sistema Visual e Áudio- Vestibular. Orientadora: Profa. Dra. Maria de Lourdes Veronese Rodrigues Ribeirão Preto 2011

3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL E PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA Silva, Marcelo Jordão Lopes da Polimorfismo do gene TP53 (CÓDON 72) em indivíduos portadores de Glaucoma Primário de Ângulo Fechado. Marcelo Jordão Lopes da Silva, Ribeirão Preto, SP. 118p. ; 30 cm Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Mecanismos Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Áudio-Vestibular. Orientador: Rodrigues, Maria de Lourdes Veronese 1. Gene TP53; 2. Genética; 3. Glaucoma Primário de Ângulo Fechado; 4. Apoptose; 5. Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço.

4 BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO EM CIÊNCIAS MÉDICAS Presidente da Banca: Prof. Dr.... Prof. Dr.... Prof. Dr.... Prof. Dr.... Prof. Dr.... Curso de Pós-graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo. Aprovada em: / /

5 iv Dedicatória A minha amada esposa Iara, pelo apoio incessante e companheirismo. As minhas amadas filhas Julia e Lara, pelo carinho e amor. Aos meus amados pais, Nelson e Arlene, pela dedicação abnegada à minha formação. À minha família, pelo apoio.

6 v A Professora Dra. Maria de Lourdes Veronese Rodrigues Orientadora desta Tese, amiga e mestre, por seu apoio, incentivo e ensinamentos.

7 vi Agradecimentos Ao Prof. Dr. Remo Susanna Junior, meu professor, por me ensinar apaixonadamente o caminho das atividades acadêmica e profissional. Ao Prof. Dr. Jorge Alberto F. Caldeira, pelo ingresso no Hospital das Clínicas da FMUSP. e pelo exemplo profissional. Ao Prof. Dr. Newton Kara José, que me orientou, com seus exemplos, para o caminho das atividades acadêmica e profissional. Aos Profs. Drs. Roberto F. S. Malta, Marcelo Nicolela, Alberto Jorge Betinjane, por seus ensinamentos e amizade. Aos colegas e funcionários do Departamento de Oftalmologia do Hospital das Clínicas do FMRP, pela amizade e apoio. À Biomédica Dra. Neifi H. S. Dhegaide e Dra. Márcia Abelin Vargas por sua importante ajuda, em todas as fases deste Trabalho. Ao Prof. Dr. Eduardo Antonio Donadi, por autorizar a utilização do Laboratório de Imunologia Molecular do HCFMRP-USP, sem o qual este Trabalho não seria realizado. Ao Prof. Dr. Carlos Akira Omi, meu amigo, por seus ensinamentos e exemplo profissional. Ao Prof. Dr. Vital Paulino Costa, meu amigo, que me orientou, com seus exemplos, para o caminho das atividades acadêmica e profissional. Ao Prof. Dr. Jayter Silva de Paula, meu amigo, por seus ensinamentos, apoio nesta Tese e exemplo profissional.

8 vii Sumário DEDICATÓRIA...iv AGRADECIMENTOS...vi LISTA DE QUADROS E TABELAS...ix LISTA DE FIGURAS...x LISTA DE ABREVIATURAS...xi RESUMO...xii ABSTRACT...xiii 1. INTRODUÇÃO Revisão Bibliográfica sobre Glaucoma Primário de Ângulo Fechado Aspectos Gerais Histórico Prevalência Aspectos gonioscópicos Mecanismos de fechamento angular Classificação Fatores de risco Fatores ecobiométricos Fatores demográficos Outros fatores de risco Evolução Tratamento Genética e Glaucoma Gene TP Aspectos gerais Localização e estrutura do gene TP Proteína p Polimorfismo do gene TP Glaucoma e a expressão do gene TP

9 viii 2. OBJETIVOS MÉTODO Casuística Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão Controle populacional Método Coleta de sangue e extração do DNA Amplificação do DNA e restrição enzimática Análise Estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS...97 Anexo 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO...98 Anexo 2 - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa...99 Artigo para Publicação (portugues) Artigo para Publicação (ingles)...110

10 ix Lista de quadros e tabelas Quadro 1. Loci genéticos descritos para o glaucoma primário de ângulo aberto...43 Tabela 1. Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos pacientes com GPAF...63 Tabela 2. Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos 72 controles...65 Tabela 3. Tabela 4. Freqüência genotípica dos grupos com GPAF e do grupo- controle, de acordo com o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO) do gene TP53 (códon 72)...68 Freqüência alélica dos grupos com GPAF e do grupo- controle, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72)...68 Tabela 5. Freqüência alélica dos grupos com GPAF, com história de crise e do grupo-controle, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72)...69 Tabela 6. Tabela 7. Tabela 8. Tabela 9. Tabela 10. Freqüência alélica dos grupos com GPAF, sem história de crise e do grupo-controle, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon72)...69 Freqüência alélica dos grupos com GPAF, sem história de crise, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72)...70 Freqüência alélica nos pacientes com GPAF, considerando-se o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72)...70 Freqüência alélica dos grupos com GPAF com crise, considerandose o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72)...71 Freqüência alélica dos grupos com GPAF sem crise, considerandose o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72)...71

11 x Lista de figuras Figura 1. Eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida de coloração com nitrato de prata...62

12 xi Lista de abreviaturas ARG CGR CAX DNA DPAC FMRP USP GPAA GPAF arginina células ganglionares da retina comprimento axial ácido desoxirribonucléico diâmetro ântero-posterior do cristalino Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo glaucoma primário de ângulo aberto glaucoma primário de ângulo fechado HCFMRP USP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo HSPE kda MYOC NO OPTN OR pb PCR PIO Pro RFLP SNP א 2 Hospital dos Servidores Público Estadual KiloDalton gene miocilina nervo óptico gene optineurina Odds Ratio pares de base Polymerase Chain Reaction pressão intra-ocular prolina Restriction Fragment Length Polymorphism Single Nucleotide Polymorphism qui-quadrado

13 xii Resumo Os objetivos deste Estudo são: determinar as distribuições alélicas e genotípicas do polimorfismo do gene TP53 (códon 72), em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF), em comparação a controles sadios e verificar a associação alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) com GPAF, sem e com história de crise aguda por bloqueio pupilar. O diagnóstico de GPAF foi baseado na biomicroscopia, gonioscopia, tonometria, biomicroscopia de fundo do olho e perimetria visual computadorizada. O ácido desoxirribonucléico (DNA) foi amplificado, através da reação em cadeia catalisada pela polimerase. A região do éxon 4, do gene TP53, foi amplificada e digerida através da enzima de restrição BseDI. A análise estatística foi realizada pelo teste do Qui-Quadrado א) 2 ), com correção de Yates, ou pelo teste exato de Fisher Bicaudal, quando necessário (p < 0,05). Foram avaliados 66 pacientes com GPAF e 72 controles normais para este estudo. A média de idade dos indivíduos foi de 65,64 ± 10,33 anos; nos 47 pacientes, no grupo com GPAF, com história de crise aguda, a idade foi de 66,2 ± 8,7 anos e nos 19 pacientes com GPAF, sem história de crise aguda, foi de 63,9 ± 14,1 anos; 43 pacientes (65,1%) eram do sexo feminino; 64 pacientes (97,2%) eram brancos. Nesse estudo concluiu-se que não houve diferença significativa na freqüência genotípica para o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO) do gene TP53 (códon 72), entre grupo com GPAF e do grupo controle (p = 0,3984) e, para os alelos (PRO e ARG), houve diferença significativa entre o grupo com GPAF, com crise aguda, em comparação ao grupo com GPAF, sem crise (p = 0,0251). Os resultados indicam associação dos genótipos do polimorfismo do gene TP53 (códon 72) nos pacientes com GPAF, com história de crise aguda de glaucoma. Palavras-chave: gene TP53, glaucoma primário de ângulo fechado, genética, apoptose.

14 xiii Abstract The objectives of this study are: to determine the allelic and genotypic polymorphism of the TP53 gene (codon 72) in Brazilian patients with GPAF and in healthy controls and verify the allelic association (Proline and Arginine) TP53 (codon 72) with primary angle closure glaucoma (PACG) with and without history of acute crisis for pupillary block. Sixty-six patients with GPAF for this study and 72 normal controls were consecutively recruited. The mean age of subjects was 65.6 ± 10.3 years; 47 patients in the GPAF with a history of acute crisis age was 66.2 ± 8.7 years and 19 patients with no history of crisis GPAF acute was 63.9 ± 14.1 years; 43 patients (65.1%) were female; 64 (97.2%) were white. The diagnosis was based on the observation of typical fundings of GPAF biomicroscopy, gonioscopy, tonometry, ophthalmoscopy and perimetry. Desoxirribonucleico acid (DNA) was amplified through the chain reaction catalyzed by polymerase. The region of exon 4 of TP53 was amplified and digested by restriction enzyme BseDI. Statistical analysis was performed by chisquare א) 2) with Yates correction or by two-tailed Fisher exact test when necessary (p <0.05). This study funded that: there was no significant difference in genotype frequency for the polymorphism (PRO / PRO, ARG / ARG and ARG / PRO) of the TP53 gene among GPAF group and control group (p = p = ) and the alleles (ARG and PRO) were significant differences between the groups with GPAF with acute compared with the group without GPAF crisis (p = ). The results indicate that the genotype of the TP53 polymorphism (codon 72) in patients with GPAF with a history of acute glaucoma. Keywords: TP53, angle closure glaucoma, genetics, apoptosis.

15 1. INTRODUÇÃO

16 Introdução Revisão Bibliográfica sobre Glaucoma Primário de Ângulo Fechado Aspectos Gerais O glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF) é uma doença que apresenta como característica comum a aposição mecânica da malha trabecular pela periferia da íris. Por mecanismos ainda desconhecidos, esta aposição leva a goniosinéquias, resultando na obstrução do trabeculado filtrante e conseqüente aumento da pressão intra-ocular (PIO). Dessa forma, o processo de fechamento angular, com conseqüente aumento da PIO, pode ocasionar dano glaucomatoso do nervo óptico (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b) Histórico O primeiro relato associando o aumento da PIO com o glaucoma foi descrito na literatura por AT TABARI* (século X), citado por DUKE-ELDER (1969). Esse autor descreveu um quadro clínico com processo inflamatório crônico, associado a aumento da pressão intra-ocular. Em 1969, DUKE-ELDER (1969) relatou que, nos livros de aforismo hipocrático (460 a.c. e 397 a.c.), o termo glaucoma era utilizado para descrever a cegueira advinda da cor da pupila opaca e esverdeada. Nesta época, o glaucoma e a catarata ainda eram considerados como uma única doença. Sams-ad-Din** (1348) citado por DUKE-ELDER (1969), descreveu um quadro clínico caracterizado por dor ocular, cefaléia hemicraniana e opacidade dos humores, seguida por dilatação pupilar e catarata. Esta condição foi definida pelo autor como enxaqueca ocular ou cefaléia pupilar. * Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System of Ophthalmology, London, v.xi, 1969.p ** Sams-ad-Din. Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System of Ophthalmology, London, v.xi, 1969.p

17 Introdução 16 O reconhecimento do glaucoma como uma doença específica aconteceu em 1622, quando Banister*, citado em DUKE-ELDER (1969), descreveu um quadro clínico caracterizado por aumento crônico da pressão intra-ocular, ausência de percepção luminosa e pupila fixa. Entretanto, o conceito de glaucoma como uma patologia caracterizada pelo aumento da pressão intra-ocular, somente foi aceito, na Europa, em 1818 com a publicação do livro Traité des Maladies des Yeux, escrito por Antoine Pierre Demours** (1818), citado por DUKE-ELDER (1969). Lawrence*** (1829) citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), utilizou o termo glaucoma agudo, pela primeira vez, para descrever um quadro de inflamação ocular severa. O processo de reconhecimento do glaucoma de ângulo fechado como uma forma distinta de glaucoma aconteceu de maneira lenta e gradativa (Ritch, R. e Lowe, R., 1996b). O conceito da obstrução fisiológica da passagem do humor aquoso pela pupila (bloqueio pupilar) foi introduzido por Curran**** (1920), citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b). Em 1923, Raeder*****, citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), diferenciou casos de glaucoma com profundidade da câmara anterior rasa dos casos com câmara anterior com profundidade normal ou aumentada. * Banister R. Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System of Ophthalmology, London, v.xi,1969.p ** Demours, AP. Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System of Ophthalmology, London, v.xi,1969.p *** Lawrence W. Lectures on surgery: medical and operative, lectures LXX-LXXII. Lancet 1829;1:705. **** Curran EJ. A new operation for glaucoma involving a new principle in the aetiology and treatment of chronic primary glaucoma. Arch Ophthalmol 1920;49:131, ***** Raeder J. Untersuchungen der lage und Dicke der Linse im menschlichen Augen bei physiologischen und pathologischen Zustanden nach einer neuen methode gemessen. Arch of Ophthalmol 1923;112:44.

18 Introdução 17 Em 1931, Curran *, citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), relatou a eficácia da iridectomia periférica em casos de glaucoma com câmara anterior rasa, mas não nos casos com câmara anterior normal. Foi somente em 1938 que Barkan**, citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), descreveu a abertura do seio camerular, após a realização da iridectomia periférica e introduziu o termo glaucoma de ângulo fechado Prevalência QUIGLEY (1996) estimou que o número de pessoas afetadas por glaucoma, em todo o mundo, seria de aproximadamente 66,8 milhões. Isso se confirmou no estudo de QUIGLEY, FRIEDMAN et al. (2003) em que se constatou que a prevalência de glaucoma, em todo o mundo, era de mais de 50 milhões de pessoas. Aproximadamente um terço destes pacientes eram portadores de GPAF QUIGLEY, FRIEDMAN et al. (2003), principalmente devido às altas taxas de prevalência relatadas na população dos países asiáticos (FOSTER, BAASANHU et al., 1996; DANDONA, DANDONA et al., 2000; FOSTER, OEN et al., 2000; FOSTER E JOHNSON, 2001; FOSTER, BUHRMANN et al., 2002). A maioria dos estudos epidemiológicos utilizou diferentes critérios para o diagnóstico do GPAF (FOSTER, BUHRMANN et al., 2002). Apesar desta falta de uniformidade nas definições utilizadas, a prevalência do glaucoma de ângulo fechado parece variar consideravelmente entre os grupos étnicos avaliados. Assim, acredita-se que a prevalência desta doença seja bem maior em esquimós e asiáticos, quando comparados com populações da Europa e dos Estados Unidos (SALMON, 1999a; FOSTER, BUHRMANN et al., 2002). * Curran, EJ. Peripheral iridotomy in acute and chronic glaucoma: some results after 10 years duration: anatomical classification of glaucoma. Trans Ophthalmol Soc UK 1931;51:520. ** Barkan O. Glaucoma: classification, causes, and surgical control. Am J Ophthalmol 1938;21:1099.

19 Introdução 18 As populações da África e as de origem latina apresentariam uma taxa de prevalência intermediária, quando comparados aos Asiáticos e Europeus (ALSBIRK, 1975b; QUIGLEY, 1996; SALMON, 1999b; FOSTER, 2002; WANG, WU et al., 2002). ALSBIRK (1975b), avaliando uma população de esquimós da Groenlândia, observou uma das maiores taxas de prevalência de glaucoma de ângulo fechado em todos : 5,1% em mulheres e 1,6% em homens acima de 40 anos de idade. Uma pesquisa, realizada em sete cidades do Japão, avaliou indivíduos e observou a prevalência de 0,4% em mulheres e 0,2% em homens. Nesse estudo, os casos diagnosticados como glaucoma de ângulo fechado incluíam indivíduos que apresentavam elevação da PIO e seio camerular estreito, independente da presença de goniosinéquias e lesão glaucomatosa estrutural e/ou funcional (SHIOSE, KITAZAWA et al., 1991). Na África do Sul, foram estudados 987 indivíduos com mais de 40 anos de idade: metade da amostra era originária das regiões do Sudeste da Ásia e a outra metade apresentava ascendência africana. A prevalência do glaucoma de ângulo fechado, nessa população, foi de 2,3% (23/987) e os critérios diagnósticos exigiam a presença de ângulo oclusível, associado a várias combinações de outros achados clínicos relacionados com PIO, oftalmoscopia direta e resultados de perimetria automatizada. Contudo, apenas oito dos 23 pacientes diagnosticados como casos de glaucoma de ângulo fechado apresentavam neuropatia óptica glaucomatosa (SALMON, MERMOUD et al., 1993). Estudos epidemiológicos, realizados no Continente Asiático, vêm observando altas taxas de prevalência do GPAF (FOSTER, BAASANHU et al., 1996; DANDONA, DANDONA et al., 2000; FOSTER, OEN et al., 2000; FOSTER E JOHNSON, 2001).

20 Introdução 19 Utilizando a classificação de FOSTER, OEN et al., 2000; FOSTER e JOHNSON, 2001 para fechamento angular primário, foram avaliadas duas populações, acima de 40 anos de idade do Sudeste asiático. Na população proveniente da área rural da Mongólia, observou-se que 2% dos indivíduos apresentavam fechamento angular primário e 0,8% apresentavam GPAF (fechamento angular primário associado à neuropatia óptica glaucomatosa) (FOSTER, BAASANHU et al., 1996). Na população, proveniente da área urbana de Singapura, foram observados resultados praticamente idênticos, ou seja, 2,2% apresentavam fechamento angular primário, e 0,8% apresentavam GPAF (FOSTER, OEN et al., 2000; Foster e Johnson, 2001). Nos países da Europa, de modo geral, a prevalência do glaucoma de ângulo fechado se encontra ao redor de 0,1%, em indivíduos acima de 40 anos (FOSTER, 2002). No Brasil, um estudo epidemiológico avaliou um total de 1772 indivíduos, que representavam 83% da população com mais de 40 anos de idade, em dois bairros da cidade de Piraquara (PR) (SAKATA, SAKATA et al., 2007). O diagnóstico do GPAF exigia a presença de sinais de fechamento angular prévio, associado a um dos seguintes critérios: lesão estrutural tipicamente glaucomatosa avançada (razão: escavação-disco maior que 0,8 com afinamento localizado da rima neural) ou lesão estrutural tipicamente glaucomatosa, associada a defeitos de campo visual (SAKATA, SAKATA et al., 2007). A prevalência do GPAF foi de 0,65% (11 casos) e representou 16% de todos os casos de glaucoma diagnosticados nessa população (SAKATA, SAKATA et al., 2007).

21 Introdução Aspectos gonioscópicos A avaliação gonioscópica é o exame mais importante para a detecção dos olhos com ângulos oclusíveis (WILENSKY, RITCH et al., 1996). A gonioscopia de indentação é praticamente indispensável na diferenciação do fechamento angular aposicional do fechamento angular por sinéquias anteriores periféricas (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Entretanto, esse exame demanda uma técnica apurada e a correta interpretação dos seus resultados depende da experiência do examinador. Segundo WILENSKY, RITCH et al. (1996), os sinais gonioscópicos mais importantes, na identificação de um olho sob alto risco de oclusão angular, são as goniosinéquias e o sinal da impressão de pigmentos irianos na parede do seio camerular. Esses sinais não só indicam que o ângulo é oclusível como, de fato, representam seqüelas de um episódio de fechamento angular prévio. O grande desafio ao oftalmologista é identificar ângulos oclusíveis em olhos que não apresentam goniosinéquias, mas apresentam um ângulo estreito à gonioscopia. Na população geral, existem muito mais indivíduos que apresentam seio camerular estreito do que pacientes que realmente desenvolvem uma crise de GPAF assintomático (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Acredita-se que, aproximadamente, 2% da população caucasiana apresentem olhos com ângulo estreito e apenas 0,1% irá apresentar episódio de fechamento angular(wilensky, RITCH et al., 1996). WILENSKY, KAUFMAN et al. (1993) realizaram um estudo prospectivo em 127 olhos considerados sob risco de apresentarem episódio de fechamento angular, por meio do exame de gonioscopia. Esses casos foram seguidos, sem tratamento, por um período médio de 2,7 anos. Durante este período, 20% (25/127) desses

22 Introdução 21 olhos desenvolveram episódios de fechamento angular, sendo que 17 apresentaram episódios assintomáticos (WILENSKY, RITCH et al., 1996). MAPSTONE (1981) avaliou prospectivamente 202 olhos contralaterais de pacientes que apresentaram glaucoma agudo unilateral. Esse autor observou que, mesmo sem tratamento, 34% dos olhos contralaterais não apresentaram glaucoma agudo, durante um período de seguimento de 10 anos Mecanismos de fechamento angular O GPAF ocorre em olhos anatomicamente predispostos, em que determinadas estruturas apresentam alterações no seu tamanho absoluto ou relativo, como também, na sua posição dentro do globo ocular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; TELLO, TRAN et al., 2002). Essas relações anatômicas anormais levam a um complexo conjunto de forças, no segmento anterior do olho, que apresentam, como resultado final, a aposição da periferia da íris sobre a malha trabecular (RITCH, R. E LOWE, R., 1996a). Por mecanismos ainda desconhecidos, esta aposição pode se tornar permanente, sendo então denominada de goniosinéquia (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b; SAKUMA, SAWADA et al., 1997). A aposição da periferia da íris sobre a parede do seio camerular, quer seja temporária quer permanente, leva a um bloqueio mecânico do trabeculado filtrante (SAKUMA, SAWADA et al., 1997). Este obstáculo na drenagem do humor aquoso pode resultar em um aumento da PIO que, por sua vez, pode ocasionar a lesão glaucomatosa do nervo óptico (dano estrutural) e seus característicos defeitos no campo visual (dano funcional) (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b).

23 Introdução 22 Segundo RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), os mecanismos de fechamento angular podem ser divididos em quatro categorias: devido ao bloqueio pupilar, pela íris em plateau, induzidos pelo cristalino e por causas retro-cristalinianas. O fechamento angular pode ocorrer exclusivamente por qualquer um desses mecanismos, como também pela associação de dois ou mais (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b; AUNG, ANG et al., 2001). O componente de bloqueio pupilar representa a causa mais comum de fechamento angular e pode ser classificado como absoluto (quando a íris se encontra aderida na cápsula anterior do cristalino por sinéquias posteriores) ou relativo (quando ocorre um bloqueio funcional) (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b). A passagem do humor aquoso da câmara posterior para a câmara anterior ocorre, principalmente, através da pupila. Um bloqueio pupilar relativo irá provocar uma dificuldade de fluxo do humor aquoso, levando a aumento da pressão, na câmara posterior. A maior pressão na câmara posterior, em relação à câmara anterior, provocará o abaulamento anterior da íris, empurrando-a contra o trabeculado e desencadeando o fechamento angular (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b). A iridotomia periférica é um procedimento que produz uma passagem de humor aquoso entre a câmara posterior e anterior, através da íris, proporcionando um equilíbrio pressórico entre estas duas câmaras, eliminando o componente de bloqueio pupilar e retificando o perfil iriano (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b). A configuração da íris em plateau é definida por um conjunto de características anatômicas do segmento anterior do olho. A íris apresenta uma angulação anterior em sua base e, depois, assume uma angulação na direção central, formando o aspecto de uma íris plana, em plateau (PAVLIN, RITCH et al., 1992; RITCH, R. e LOWE, R., 1996b; a). Dessa maneira, a profundidade da câmara

24 Introdução 23 anterior central é relativamente ampla (MANDELL, PAVLIN et al., 2003). Apesar disso, a característica angulação da periferia da íris resulta em uma repentina queda na sua parte mais próxima ao ângulo irido-corneano, caracterizando a típica configuração em plateau (AUNG, FRIEDMAN et al., 2004). Segundo PAVLIN, RITCH et al. (1992), os casos de íris em plateau apresentam processos ciliares suficientemente anteriorizados, para sustentar a periferia da íris contra o trabeculado córneo-escleral. A síndrome da íris em plateau representa a condição patológica, em que o fechamento angular ocorre a despeito da presença de uma iridotomia ou iridectomia patente (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Essa síndrome pode ter duas formas de apresentação clinica: a completa e a incompleta (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). A forma completa compreende a situação clássica e rara, quando o paciente apresenta uma crise congestiva recorrente, mesmo após a eliminação do componente de bloqueio pupilar (RITCH, R. E LOWE, R., 1996c). Nesse caso, a íris periférica obstrui todo o trabeculado filtrante, levando ao fechamento angular completo e ao aumento agudo da PIO (RITCH, R. E LOWE, R., 1996c). Na forma incompleta, não se observa o aumento agudo da PIO e o paciente não apresenta episódio de glaucoma agudo recorrente. Contudo, esses casos podem levar à formação de goniosinéquias progressivas, em 360 do ângulo irido-corneano, iniciando-se nas regiões mais posteriores, evoluindo para as mais anteriores e acarretando uma inserção da íris progressivamente mais anterior (RITCH, R. E LOWE, R., 1996c). LOWE (1964) definiu esta forma de fechamento angular em zíper. Assim, a principal característica que diferencia a síndrome completa da incompleta é o nível que o estroma da íris alcança, em relação às estruturas do ângulo ou, em outras palavras, a altura em que o plateau se forma. Quando a íris

25 Introdução 24 periférica ocasiona a oclusão do ângulo acima da malha trabecular, a PIO se eleva de maneira aguda, desencadeando a crise congestiva. Se o ângulo se fecha apenas parcialmente, poupando a porção superior do trabeculado filtrante, a PIO não se eleva de maneira aguda, mas pode haver o desenvolvimento de um processo de fechamento angular crônico e silencioso (AUNG, NOLAN et al., 2005). Em muitos casos, o mecanismo da íris em plateau pode estar associado ao mecanismo do bloqueio pupilar (WANG, WU et al., 2002). Nesses casos, o diagnóstico da íris em plateau não pode ser confirmado até que o bloqueio pupilar relativo seja eliminado, por meio da realização de uma iridotomia (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Cabe ainda ressaltar que a presença de cistos de íris ou do corpo ciliar pode levar ao fechamento angular e à configuração do seio camerular semelhantemente aos casos da íris em plateau. Entretanto, esses casos são facilmente identificados pela gonioscopia, que demonstra o fechamento angular em apenas algumas partes do seio camerular e não em 360. (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Os episódios de fechamento angular, induzidos pelo cristalino, abrangem um grupo diverso de anormalidades, como a intumescência do cristalino (glaucoma facomórfico), a subluxação e/ou deslocamento do cristalino, assim como o aumento do diâmetro ântero-posterior do cristalino e a pequena anteriorização dessa estrutura, que surgem com o decorrer da idade (LOWE, 1970). O aumento fisiológico do diâmetro do cristalino altera as relações anatômicas das estruturas do segmento anterior, levando a uma diminuição gradual da profundidade da câmara anterior (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Apesar de o componente de bloqueio pupilar não ser considerado como uma desordem relacionada ao aumento do cristalino, a alteração da posição da superfície anterior dessa estrutura

26 Introdução 25 ocasionará uma alteração da relação da extremidade da íris com a face anterior do cristalino (ao nível da pupila), predispondo ao aparecimento do bloqueio pupilar relativo (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Além disso, a íris e o corpo ciliar são deslocados anteriormente, provocando um estreitamento do seio camerular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Desta maneira, esse mecanismo, induzido pelo cristalino, pode colaborar com o mecanismo de bloqueio pupilar (antes da iridotomia) e/ou com o mecanismo da íris em plateau (após a iridotomia) (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Entretanto, o papel do cristalino, na fisiopatologia do fechamento angular, apresenta algumas controvérsias. As causas retro-cristalinianas de fechamento angular representam os casos de glaucoma maligno ou glaucoma por bloqueio ciliar. Nesses casos, forças provenientes da região posterior à lente provocam a anteriorização de todo o diafragma irido-cristaliniano, levando à oclusão do seio camerular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Acredita-se que esse mecanismo seja desencadeado pelo direcionamento anômalo do humor aquoso para a cavidade vítrea (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). No entanto, a exata etiopatogenia dessa agressiva forma de fechamento angular ainda permanece obscura (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; QUIGLEY, FRIEDMAN et al., 2003). Apesar de essa classificação proposta por RITCH, R. e LOWE, R., 1996b ser considerada adequada para diferenciar os vários mecanismos de fechamento angular, ela apresenta alguns conceitos mal definidos Classificação O GPAF é classificado segundo os sinais e sintomas presentes no momento do diagnóstico (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Os pacientes com fechamento

27 Introdução 26 angular podem se apresentar com um amplo espectro de sintomas, variando desde a ausência de queixa até um exuberante quadro clínico com dor severa, náuseas e diminuição súbita da acuidade visual (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Assim, esta classificação subdivide o GPAF em: fechamento angular intermitente ou glaucoma subagudo, glaucoma agudo ou congestivo e glaucoma crônico de ângulo fechado (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). O glaucoma subagudo apresenta episódios de fechamento angular de curta duração e com sintomatologia moderada (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Nesses casos, o aumento da PIO é suficiente para provocar sintomas, mas não para desencadear todo o exuberante quadro clínico de uma crise congestiva (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Em geral, sintomas de diminuição da acuidade visual, dor e visão de halos duram em média 30 minutos e tendem a apresentar resolução espontânea (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Esses episódios de fechamento angular podem recorrer durante meses ou anos até que, eventualmente, ocorra uma crise congestiva (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). O glaucoma agudo representa o fechamento do ângulo em toda a sua extensão, resultando em súbita elevação da PIO. Essas crises geralmente ocorrem durante o período noturno, iniciando com sintomas moderados, e evoluindo rapidamente para os sintomas mais severos (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Aproximadamente um terço dos pacientes com crise de glaucoma agudo relatam sintomas de crises intermitentes ou subagudas prévias (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). No momento da crise congestiva, os pacientes relatam dor ocular e/ou periorbitária intensa, diminuição da acuidade visual, náuseas e vômitos. Ao exame, os olhos apresentam uma córnea edemaciada, midríase média não fotorreagente e câmara anterior rasa (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a).

28 Introdução 27 O termo GPAF descreve um olho em que parte do seio camerular se encontra permanentemente obstruído pela presença de goniosinéquias (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Segundo RITCH, R. e LOWE, R. (1996b), a evolução para esta forma de GPAF pode ocorrer de modo sintomático ou assintomático. De uma maneira geral, os olhos com GPAF apresentam câmara anterior mais profunda do que os olhos com glaucoma agudo e a elevação gradual da PIO não provoca edema da córnea. Estes olhos podem eventualmente desenvolver crise congestiva, porém, na maioria dos casos, o aumento da PIO e o conseqüente processo da lesão glaucomatosa do nervo óptico ocorre de maneira assintomática (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Entretanto, apesar de esta classificação tradicional do fechamento angular primário estar sendo utilizada há várias décadas (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b), seu uso vem sendo considerado inadequado e sistematicamente criticado (QUIGLEY, 1996; BONOMI, MARCHINI, MARRAFFA, BERNARDI, DE FRANCO et al., 2000; FOSTER, 2002). Seus principais pontos negativos são atribuídos à falta de uniformidade nos conceitos utilizados e à inerente subjetividade em abordar e interpretar os sintomas relatados pelos pacientes (FOSTER, BAASANHU et al., 1996; FOSTER, 2002). Inúmeros trabalhos publicados sobre glaucoma de ângulo fechado utilizaram critérios próprios para a definição de cada tipo de glaucoma. Dessa maneira, a comparação dos resultados entre diferentes trabalhos fica bastante prejudicada (FOSTER, 2002). Atualmente, a definição de glaucoma primário, utilizada pelas pesquisas epidemiológicas, adota o conceito de lesão do órgão alvo. Segundo esse conceito, esta doença seria caracterizada pela neuropatia óptica glaucomatosa, identificada por meio de uma combinação de anormalidades estruturais, associada à perda

29 Introdução 28 visual funcional, detectada através do exame de campo visual (FOSTER, 2002; FOSTER, BUHRMANN et al., 2002). Em contrapartida, a presença da neuropatia óptica glaucomatosa não está incluída como um dos critérios da classificação do glaucoma de ângulo fechado baseada em sintomas. Os termos glaucoma agudo ou glaucoma subagudo são utilizados independentemente do aspecto do disco óptico. Assim, segundo o conceito de lesão do órgão alvo, pacientes que apresentam uma crise congestiva, mas não possuem sinais de glaucoma no nervo óptico, não poderiam ser definidos como casos de glaucoma agudo (FOSTER, 2002). Apesar de esta situação parecer um contra-senso, na verdade a presença ou ausência de sintomas parece não se correlacionar com o prognóstico do dano glaucomatoso (FOSTER, 2002). Tanto é que (Douglas, Drance et al., 1975) e Dhillon et al* (1975), citado por FOSTER (2002), relataram que 60-75% dos pacientes caucasianos, que apresentaram crises congestivas, evoluíram sem neuropatia óptica glaucomatosa ou lesão de campo visual. Por todos esses motivos, uma nova classificação de glaucoma de ângulo fechado foi adotada pela Academia Americana de Oftalmologia no ano de 2000 (BONOMI, MARCHINI, MARRAFFA, BERNARDI, DE FRANCO et al., 2000; FOSTER, 2002). Nessa nova proposta, os pacientes são classificados conforme o estágio da lesão glaucomatosa em que se encontram, em associação com os seus respectivos achados gonioscópicos. Assim, os pacientes com fechamento angular primário podem ser classificados em: suspeitos de fechamento angular primário, com fechamento angular primário e com GPAF (FOSTER, 2002). * Dhillon B, Chew PT, Lim ASM. Field loss in primary angle closure glaucoma. Asia-Pac J Ophthalmol 1990;2:85-87.

30 Introdução 29 Os pacientes ditos suspeitos de fechamento angular primário não apresentam nenhum dano glaucomatoso estrutural ou funcional e, também, não apresentam nenhuma sinéquia anterior periférica. Esse termo se aplica aos olhos dos pacientes que são considerados anatomicamente predispostos a apresentar episódios de fechamento angular, em outras palavras, olhos que apresentam ângulos potencialmente oclusíveis (FOSTER, 2002). Os pacientes com fechamento angular primário também não apresentam sinais da lesão glaucomatosa no disco óptico e no exame de campo visual, entretanto, já apresentam sinais de fechamento angular como goniosinéquias e isquemia da íris (FOSTER, 2002). Os pacientes sem neuropatia óptica glaucomatosa, que apresentam um quadro de glaucoma agudo, são incluídos nesta classificação. Portanto, o termo apropriado, nesses casos, seria fechamento angular primário agudo. Por sua vez, os pacientes com glaucoma primário de ângulo fechado apresentam não somente sinais de fechamento angular prévio, como também já apresentam neuropatia óptica glaucomatosa (FOSTER, 2002). Assim, esse termo é utilizado a despeito da presença dos sintomas relacionados aos episódios de fechamento angular prévio Fatores de risco Fatores ecobiométricos Vários estudos avaliaram as características dos parâmetros ecobiométricos nos olhos com fechamento angular primário (CHEUNG, LIU et al.; MALTA, CARVALHO et al., 1982; MALTA, CARVALHO et al., 1983; CALIXTO E CRONEMBERGER, 1986; SALMON, SWANEVELDER et al., 1994; SUN, JI et al.,

31 Introdução ; RITCH, R. e LOWE, R., 1996b; CONGDON, YOULIN et al., 1997; SIHOTA, GUPTA et al., 2000; SIHOTA, LAKSHMAIAH et al., 2000; FOSTER, 2002; FRIEDMAN, GAZZARD et al., 2003; GAZZARD, FRIEDMAN et al., 2003; LAN, HSIEH et al., 2007; LAVANYA, WONG et al., 2008; JONAS, XU et al., 2009; MELLO, MEIRELLES et al., 2009). De maneira geral, essas pesquisas relatam que esses olhos apresentam menor comprimento axial (CAX), menor profundidade da câmara anterior, maior diâmetro ântero-posterior do cristalino (DAPC), curvatura e espessura da íris, maior razão DAPC/CAX e posição relativa do cristalino mais anterior que os olhos normais (CHEUNG, LIU et al. em pub). CALIXTO e CRONEMBERGER (1986) verificaram que os olhos, em que se constatou glaucoma agudo, apresentavam diâmetro axial e profundidade da câmara anterior menores que os dos olhos com glaucoma primário de ângulo aberto, porém, nenhuma diferença foi observada com relação à espessura do cristalino. Esses autores ainda verificaram que os olhos que apresentaram crise congestiva tinham menor profundidade da câmara anterior que seus olhos contralaterais. Assim, olhos que apresentam essas anormalidades anatômicas estão predispostos à oclusão do ângulo irido-corneano, por terem um segmento anterior mais compactado, o que se reflete no seio camerular mais estreito Fatores demográficos Dados da prevalência e incidência demonstram que o glaucoma de ângulo fechado apresenta uma nítida tendência de acometer mulheres, pacientes mais idosos e de origem asiática (FOSTER, BUHRMANN et al., 2002). As mulheres de todas as raças estão mais suscetíveis ao glaucoma de ângulo fechado (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; SALMON, 1999a). Esta maior

32 Introdução 31 predisposição, provavelmente, está relacionada com os parâmetros ecobiométricos (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; SALMON, 1999a; FOSTER, BUHRMANN et al., 2002). Considerando-se os olhos normais (sem fechamento angular), as mulheres apresentam comprimento axial e câmara anterior significativamente menor que os homens (OH, MINELLI et al., 1994; RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; FOSTER, ALSBIRK et al., 1997; QUIGLEY, FRIEDMAN et al., 2003). QUIGLEY, FRIEDMAN et al. (2003) acrescentam que esta maior prevalência pode também estar relacionada com o fato de que as mulheres têm uma maior predisposição de apresentar alterações da permeabilidade vascular e/ou vasoespasmos. Com o decorrer da idade, existe um aumento no diâmetro ântero- posterior do cristalino e um pequeno movimento anterior desta estrutura, devido à perda da tensão zonular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; RITCH, R. e LOWE, R. F., 1996). A câmara anterior também diminui em profundidade e em volume (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; FOSTER, 2002). Dessa maneira, a prevalência do fechamento angular agudo aumenta com a idade, sendo mais freqüente entre os 55 e 70 anos (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Conforme já citado, a prevalência do glaucoma de ângulo fechado varia consideravelmente entre diferentes grupos étnicos. Entretanto, CONGDON, FOSTER et al. (2002) compararam os parâmetros ecobiométricos de 170 pacientes brancos, 188 negros e 531 chineses. Esses autores não observaram nenhuma diferença significativa na profundidade da câmara anterior e no comprimento axial nos três grupos avaliados. Esses resultados sugerem que devem existir outros fatores de risco relacionados com a maior prevalência do glaucoma de ângulo fechado em pacientes asiáticos.

33 Introdução 32 OH, MINELLI et al. (1994) avaliaram 291 indivíduos normais de origem afroamericana, caucasiana e asiática. Esses autores relataram que os olhos estudados não demonstraram, através da gonioscopia, diferenças no grau da abertura angular. Entretanto, os pacientes asiáticos apresentaram inserção da íris no corpo ciliar cuja localização anatômica está situada em posição mais anteriorizada Outros fatores de risco A herança do GPAF é, provavelmente, multifatorial (TORNQUIST, 1953; SARFARAZI, 1997). As características oculares relativas aos GPAF são mais comuns entre parentes próximos dos portadores do que na população geral; essas características incluem uma posição anteriorizada do cristalino, espessura aumentada do cristalino e uma câmara anterior mais estreita (LOWE, 1972a; SPAETH, 1978; ALSBIRK, 1982). Estima-se que a prevalência do GPAF entre os parentes de primeiro grau, em uma população branca afetada, esteja entre 1 e 12%, o que é maior que os 0,1% de prevalência na população geral (PATERSON, 1961; LOWE, 1972b; ALSBIRK, 1975a). A história familiar parece representar um fator de risco para o desenvolvimento do fechamento angular primário (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). ALSBIRK (1976) relatou que parentes de primeiro grau de um paciente afetado apresentam um risco de fechamento angular 3,5 vezes maior que pacientes sem história familiar positiva. Alguns fatores ambientais também parecem estar relacionados com o desencadeamento do fechamento angular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; FOSTER, 2002). A incidência de crises congestivas demonstra uma variação

34 Introdução 33 sazonal, sendo mais comum nos períodos de temperaturas extremas. (FOSTER, 2002). Há também diferenças raciais, com uma alta prevalência entre os esquimós (2 a 8%), asiáticos (0,3 a 1,4%) e ameríndios (4,2%), se comparadas com os caucasianos (0,1%), o que é sugestivo de uma predisposição genética para esta afecção (CONGDON, WANG et al., 1992; CARVALHO, 1999). Segundo TEIKARI (1988), doença de herança monogênica tem 100% de concordância em gêmeos monozigóticos. Em um estudo de coorte com gêmeos, 2 pares de irmãos monozigóticos foram concordantes para GPAF, 5 pares foram discordantes, e 13 pares de irmãos dizigóticos foram discordantes, o que apóia a hipótese de herança poligênica ou multifatorial do GPAF. Estudos procuram correlacionar o GPAF com alguns lócus gênico ou marcador genético como os grupos sanguíneos ABO, RH, Duffy e com antígenos e alelos de HLA, em várias populações, porém os dados ainda não são conclusivos (GIESER e WILENSKY, 1979; WANG, GUO et al., 1986; SALMON e MARTELL, 1994) Há mais de 15 loci e sete genes identificados em pacientes com GPAF(CRAIG e MACKEY, 1999), entre eles, dois genes foram identificados em mutações causando GPAA: MYOC myocilin e OPTN optineurin(sheffield, STONE et al., 1993; STONE, FINGERT et al., 1997; REZAIE, CHILD et al., 2002). Nanoftalmia é uma desordem autossômica dominante com associação significativa com GPAF, identificada especificamente em dois loci (OTHMAN, SULLIVAN et al., 1998); no entanto, a Nanoftalmia é muito diferente do fechamento primário de ângulo (OTHMAN, SULLIVAN et al., 1998). WANG, CHIANG et al. (2006) estudaram a relação entre polimorfismo simples de nucleotídeos (SNPs) da matrix extracelular, matrix metaloprotease (MMPs), inibidores

35 Introdução 34 tissulares da MMPs e outros genes associados a glaucoma e GPAF. Foram extraídos DNAs de 78 pacientes com GPAF, com história de crise aguda e 86 sujeitos-controles. Encontrou-se associação do SNP rs , localizado no gene MMP9, com GPAF. AYUB, KHAN et al. (em pub) em estudo de coorte, na população paquistanesa, investigaram o envolvimento da sintetase endotelial oxido nítrico (enos) e heat shock proteína 70 (HSP70) com GPAA e GAAF. Encontrou-se associação significativa com o polimorfismo G+190C do HSP70 (p < 0,05) Evolução Conforme já citado, o GPAF é uma doença provocada por várias anormalidades que apresentam, como característica comum, a aposição mecânica da malha trabecular pela periferia da íris. Esta aposição pode levar à formação de goniosinéquias que resultam na obstrução do trabeculado filtrante, com conseqüente aumento da PIO (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Dessa maneira, o processo de fechamento angular pode ocasionar o dano glaucomatoso do nervo óptico. Com este conceito em mente, pode-se admitir que, se o mecanismo responsável pelo bloqueio mecânico do trabeculado for eliminado de maneira precoce, antes de ocorrerem lesões no sistema de drenagem do humor aquoso, existe a possibilidade teórica da interrupção do processo da doença (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Assim, o diagnóstico precoce do ângulo irido-corneano oclusível representa um fator fundamental para o bom prognóstico visual do paciente, principalmente quando se considera a possibilidade do desenvolvimento de uma crise aguda, em que os níveis muito elevados da PIO podem acarretar graves seqüelas visuais em um curto período de tempo (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Entretanto, a despeito da eliminação do mecanismo de bloqueio pupilar, o processo de lesão à malha

36 Introdução 35 trabecular pode continuar ocorrendo. Teoricamente, a lesão ao sistema de drenagem do aquoso, mesmo após a realização da iridotomia, pode ocorrer ou pela manutenção do processo de fechamento angular (mecanismos de não bloqueio pupilar) ou pela lesão ultra-estrutural da matrix extracelular da malha trabecular (mecanismo do dano trabecular, observado nos casos de glaucoma primário de ângulo aberto) (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Além do mais, o processo glaucomatoso pode continuar progredindo em virtude de outros mecanismos, que podem lesar diretamente o nervo óptico, como as anormalidades na sua perfusão sanguínea e/ou anormalidades nas suas propriedades biomecânicas (BURGOYNE, QUIGLEY et al., 1995). A realização da iridotomia periférica é o tratamento de escolha na maioria dos casos com ângulos oclusíveis (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Esse procedimento elimina o bloqueio pupilar relativo, que é o mecanismo de fechamento angular mais comum. Após a realização da iridotomia, podemos teoricamente pensar e tentar descrever pelo menos quatro evoluções clínicas (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Como primeiro quadro clínico possível, o diagnóstico do ângulo oclusível foi realizado de maneira precoce, no momento em que o dano ao trabeculado ainda não era extenso o suficiente para comprometer a sua função. O bloqueio pupilar relativo era o único mecanismo do fechamento angular e não existia nenhuma outra condição associada que pudesse levar ao aumento da PIO ou à neuropatia óptica glaucomatosa. Portanto, nesses casos, a realização da iridotomia poderia, teoricamente, bloquear todo o processo glaucomatoso (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Em uma segunda hipotética situação, o diagnóstico do ângulo oclusível foi feito de maneira precoce, no momento em que o dano ao trabeculado ainda não era extenso o suficiente para comprometer a sua função. O bloqueio pupilar relativo era o único

37 Introdução 36 mecanismo de fechamento angular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Entretanto, existiam outras condições associadas, que poderiam elevar a PIO ou causar a neuropatia óptica glaucomatosa. Assim, a iridotomia bloqueou o processo de fechamento angular, porém outras condições associadas podem levar ao aparecimento ou progressão da lesão glaucomatosa, tais como lesões ultra-estruturais da malha trabecular (DRECOLL e ROHEN, 1996) e anormalidades nas propriedades biomecânicas da cabeça do nervo óptico (BURGOYNE, QUIGLEY et al., 1995). Em uma terceira situação, da mesma forma o diagnóstico do ângulo oclusível foi realizado de maneira precoce, no momento em que o dano ao trabeculado ainda não era extenso o suficiente para comprometer sua função. Entretanto, o bloqueio pupilar relativo não representava o único mecanismo de fechamento angular. Assim, mesmo após a eliminação do bloqueio pupilar, o processo do fechamento angular e o conseqüente dano progressivo à malha trabecular pode continuar ocorrendo em virtude de mecanismos de não bloqueio pupilar, tais como a síndrome da íris em plateau completa ou incompleta (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Finalmente, o diagnóstico do ângulo oclusível foi feito tardiamente, em um momento no qual a extensão das goniosinéquias já comprometia a função do trabeculado filtrante. A despeito da presença de outros mecanismos de fechamento angular ou outras condições, associadas com o desenvolvimento da neuropatia óptica glaucomatosa, este paciente já apresenta lesão no trabeculado suficientemente extensa para comprometer a drenagem do aquoso. A PIO pósiridotomia se encontra elevada, assim como os riscos de desenvolvimento da neuropatia óptica glaucomatosa (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Encerrada esta breve revisão das complexas associações entre as diferentes etiopatogenias do glaucoma de ângulo fechado, será iniciada a revisão da literatura

38 Introdução 37 sobre a evolução dessa doença. Todos os trabalhos revisados a seguir foram realizados em pacientes asiáticos, com exceção do primeiro, que envolveu pacientes caucasianos, negros, hispânicos e asiáticos. ROSMAN, AUNG et al. (2002) avaliaram, retrospectivamente, casos de glaucoma crônico de ângulo fechado (com neuropatia óptica glaucomatosa e defeitos de campo visual) já submetidos à iridotomia e que apresentavam um acompanhamento mínimo de nove meses. Esses autores compararam 80 olhos de pacientes atendidos em Nova Iorque com 83 olhos de pacientes atendidos em Singapura. Foi observado que 100% (80/80) dos olhos avaliados em Nova Iorque e 94% (78/83) dos olhos avaliados em Singapura necessitaram de tratamento adicional para controle da PIO, mesmo após a eliminação do componente de bloqueio pupilar. Entretanto, não foi descrita a extensão de goniosinéquias, na população estudada. ANG, AUNG et al. (2000) observaram que 89% (71/80) dos olhos contralaterais de pacientes que apresentaram crise congestiva não necessitaram de nenhuma medicação para controlar a PIO, por um tempo médio de 50 meses, pósiridotomia. Apesar das altas taxas de controle da PIO, os autores ressaltaram que 9% (7/80) desses olhos apresentaram descontrole da PIO e formação de novas goniosinéquias (análise retrospectiva), após a eliminação do componente de bloqueio pupilar. No entanto, a presença de mecanismos de não bloqueio pupilar não foram investigados, nesses casos. LIM, AUNG et al. (2004) acompanharam, prospectivamente, 44 pacientes que apresentaram glaucoma agudo unilateral, por um tempo médio de 12 meses, após a realização da iridotomia. Estes autores observaram uma abertura significativa do ângulo irido-corneano, após a eliminação do bloqueio pupilar e não detectaram a

39 Introdução 38 formação de goniosinéquias nos olhos que apresentaram a crise e nos respectivos olhos contra-laterais. No entanto, 41% (19/44) dos pacientes apresentaram descontrole da PIO e necessitaram de tratamento adicional. Esse estudo apresentou duas importantes limitações. A primeira diz respeito ao fato de que os pacientes não foram avaliados quanto à presença da neuropatia óptica glaucomatosa. A segunda limitação se refere à simples exclusão de todos os casos que necessitaram de intervenção cirúrgica, durante a pesquisa, selecionando-se, assim, os casos com melhor evolução clínica. Aung, Friedman et al. (2004) realizaram um estudo observacional transversal, no qual 90 pacientes foram avaliados por um período de 4 a 10 anos, após glaucoma agudo. Esses autores notaram que, após um tempo médio de 6,3 anos da crise congestiva, 18% (16/90) dos olhos que apresentaram glaucoma agudo estavam cegos. A presença de glaucoma primário de ângulo fechado (dano estrutural e funcional) foi observada em 48% (43/90) dos olhos. Verificou-se, ainda, que 49% (44/90) desses olhos apresentavam ângulo estreito à gonioscopia. (classificação de Shaffer). No entanto, como limitação do estudo, nem todos os pacientes, na época da crise congestiva, realizaram perimetria automatizada e avaliação do disco óptico Tratamento O tratamento do fechamento angular primário é realizado de acordo com o mecanismo etiopatogênico envolvido. Na grande maioria dos casos, a terapia de escolha é a realização da iridotomia periférica. Após a realização da iridotomia, a eventual necessidade de tratamento adicional é determinada segundo as causas do aumento da PIO e/ou segundo o processo de fechamento angular persistente.

40 Introdução 39 Dessa maneira, se não houver nenhum mecanismo de fechamento angular adicional após a iridotomia (mecanismos de não bloqueio pupilar), o tratamento deve envolver o uso de colírios ou drogas sistêmicas antiglaucomatosas, e, eventualmente, a realização da trabeculectomia (SUSANNA e MALTA, 1981; SUSANNA, MALTA et al., 1981; HOH, AUNG et al., 2002; LAI, THAM et al., 2002). Nos casos em que existe um mecanismo de não bloqueio pupilar, levando ao dano progressivo do trabeculado (formação de novas goniosinéquias), o tratamento pode envolver o uso de crônico da pilocarpina, a realização da iridoplastia periférica ou até mesmo a controvertida realização da remoção do cristalino(hoh, AUNG et al., 2002; LAI, THAM et al., 2002; WANG, WU et al., 2002; NONAKA, KONDO et al., 2005). Entretanto, é importante ressaltar que a eficácia de cada uma dessas modalidades terapêuticas citadas não foi comprovada em estudos longitudinais controlados (SAW, GAZZARD et al., 2003). Além disso, cada uma destas modalidades terapêuticas, cirúrgicas ou clínicas, apresentam uma série de potenciais efeitos colaterais. Assim, a conduta a ser adotada deve ser decidida criteriosamente para cada caso de glaucoma de ângulo fechado. 1.2 Genética e Glaucoma A Genética é a ciência da diversidade biológica. Nos últimos 45 anos, a Genética Humana evoluiu da diversidade fenotípica até chegar à variação do DNA propriamente dito. A Genética Médica é um ramo da Genética Humana que estuda a relação entre a diversidade biológica em humanos, saúde e doença. Dedica-se à investigação de doenças que acometem pacientes e seus familiares, seu

41 Introdução 40 diagnóstico, prevenção e tratamento (MCKUSICK, 1992). A evolução da Genética Médica permitiu determinar que as doenças podem apresentar um padrão monogênico de hereditariedade, que inclui os tipos autossômico dominante (AD), autossômico recessivo (AR), ligado ao sexo (ligado ao X) e mitocondrial ou apresentar um padrão complexo de hereditariedade, que envolve mais de um gene e possíveis fatores ambientais, na determinação etiológica da doença (herança poligênica multifatorial) (TEIKARI, 1987; 1990). A determinação exata do padrão de herança é dificultada pela variabilidade da penetrância e expressividade da doença. Penetrância é um conceito que, geralmente, se refere à expressão de um genótipo mutante, aplicado a caracteres dominantes em heterozigose. A penetrância de um alelo mutante pode variar de acordo com a porcentagem de indivíduos portadores, desde que manifestem seu fenótipo correspondente. Por exemplo: se uma condição se expressar em 100% dos indivíduos que possuam o alelo responsável, este alelo apresentaria uma penetrância de 100%; ao passo que, se esta mesma condição estiver presente em 70% das pessoas portadoras do alelo mutante, isso corresponderia a uma penetrância de 70% para este alelo. A expressividade corresponde ao grau de severidade de uma moléstia associada a uma alteração genética. Se uma condição apresentar uma expressividade variável, o fenótipo (manifestação clínica), determinado por esta alteração genética, variará em grau de intensidade (leve a intenso), mas sempre presente entre os indivíduos que possuírem o genótipo correspondente (MUSARELLA, 1992; DAMJI e ALLINGHAM, 1997). A Genética e a Oftalmologia estão historicamente associadas, desde o início do século XX. Em 1911, Wilson deduziu que a deficiência da visão de cores estava

42 Introdução 41 localizada no cromossomo X. Em 1947, observou-se a ligação no padrão de transmissão hereditária entre duas moléstias (hemofilia e deficiência de visão de cores) (DAMJI e ALLINGHAM, 1997). Em 1963, identificou-se a primeira doença humana ligada a um cromossomo autossomo: catarata pulverulenta, com grupo sangüíneo Duffy no cromosomo 1 (DAMJI e ALLINGHAM, 1997). Recentemente, com o desenvolvimento da Biologia Molecular, vários pesquisadores têm procurado identificar genes associados aos mais diversos tipos de moléstias humanas. Assim, um grande número de afecções oculares já têm seu locus (posição no cromossomo) e gene determinados por meio do mapeamento genético e da análise de ligação. A classificação proposta pela Organização Mundial do Genoma Humano designa, para os genes associados ao glaucoma, a sigla GLC (RAYMOND, 1997). Os números 1, 2 e 3 que seguem a sigla geral ( GLC ) para os glaucomas representam ângulo aberto, ângulo estreito e glaucoma congênito, respectivamente. Finalmente, as letras A, B, C,e assim por diante, indicam o primeiro e os subseqüentes loci identificados para determinado tipo de glaucoma (RAYMOND, 1997). Assim, o primeiro locus identificado, em associação com o GPAA, recebeu o nome de GLC1A, enquanto o primeiro lócus, relacionado ao glaucoma congênito, foi denominado GLC3A. Apesar de vários trabalhos, na literatura, sugerirem que o GPAA seja herdado segundo padrões de herança Mendeliana, a grande maioria dos pacientes não apresenta esse padrão de transmissão hereditária (ADAM, BELMOUDEN et al., 1997). Estudos com pares de gêmeos dizigóticos e monozigóticos, avaliando o componente genético para o GPAA sugerem a ocorrência de padrão poligênico multifatorial para a doença (TEIKARI, 1987; 1990). Essa teoria já havia sido

43 Introdução 42 postulada por ARMALY (1967b; a; 1968) e JAY e PATERSON (1970) e poderia justificar a baixa prevalência da moléstia, de 2,5% a 13,5%, entre os parentes de pacientes com GPAA (NETLAND, WIGGS et al., 1993). Até o momento temos a descrição de onze loci e três genes relacionados ao glaucoma primário de ângulo aberto (Tabela 1). O primeiro gene, situado no locus GLC1A (cromossomo 1q21-q31), foi o gene Trabecular Meshwork-Induced Glucocorticoid Response Gene/ Myocilin Gene (TIGR/MYOC), descrito em 1997 por (STONE, FINGERT et al., 1997). Mutações no gene TIGR/MYOC são a causa mais freqüente de cegueira com base molecular conhecida. O segundo gene identificado foi o gene Optineurin ( Optic Neuropathy Induced Protein OPTN), situado no locus GLC1E (cromossomo 10p14-p15) e o terceiro gene associado ao GPAA, o WD40-repeat 36 (WDR36), situado no locus GLC1G (cromossomo 5q22.1), foi identificado por (MONEMI, SPAETH et al., 2005).

44 Introdução 43 Quadro 1: Loci genéticos descritos para o glaucoma primário de ângulo aberto Localização no cromossomo Nome do locus Gene identificado Autor 1q21-q31 GLC1A MYOC Stone, Fingert et al., p4 - - Wiggs, Allingham et al., p16.3-p15 GLC1H - 2cen-q13 GLC1B - Stoilova, Child et al., q33-q Nemesure, Jiao et al., p21-p Baird, Foote et al., q21-q24 GLC1C - Wirtz, Samples et al., q22.1 GLC1G WDR36 Monemi, Spaeth et al., q35-q36 GLC1F - Wirtz, Samples et al., q23 GLC1D - Trifan, Traboulsi et al., q22 GLC1J - Wiggs, Lynch et al., p12-p Nemesure, Jiao et al., p15-p14 GLC1E OPTN Rezaie, Child et al., q Wiggs, Allingham et al., q21-q Wiggs, Allingham et al., q11-q13 GLC1I - Allingham, Wiggs et al., p Wiggs, Allingham et al., q Wiggs, Allingham et al., q12-q Wiggs, Allingham et al., p12 GLC1K - Wiggs, Lynch et al., 2004

45 Introdução Gene TP Aspectos gerais As origens da descoberta do gene TP53 são provenientes de estudos bioquímicos realizados em 1979, nos quais foi observado que uma proteína de 53kD (p53) poderia ser imunoprecipitada juntamente com um antígeno tumorigênico viral, o antígeno T SV 40. Posteriormente, mostrou-se que a p53, localizada em grande parte no núcleo celular, também era capaz de ligação com outras proteínas virais, como o antígeno E1B do adenovírus tipo 5, o antígeno 5 nuclear do vírus Epstein- Barr e o antígeno E6 do vírus papiloma humano (LANE e CRAWFORD, 1979; LINZER e LEVINE, 1979). A ligação da p53 a proteínas virais forneceu a primeira pista sobre sua importância, pois a inativação pela ligação a essas proteínas, permitiria que a célula entrasse em uma via que levaria à tumorigênese, induzida por vírus. Subseqüentemente, vários clones de DNA do gene TP53 foram isolados e observou-se que os mesmos eram capazes de imortalizar células de curta duração (JENKINS, RUDGE et al., 1984) e de cooperar com o oncogene rãs na transformação de células em cultura (PARADA, LAND et al., 1984). Esses fatos levaram o gene p53 a ser considerado um oncogene. Somente em 1989, descobriu-se que todos os clones do TP53 analisados eram mutantes, além de se observar que sua forma normal era capaz de suprimir a transformação celular iniciada por outros oncogenes. A partir de então, o gene TP53 foi denominado um gene supressor de tumores. Mutações de ponto e/ou deleções no mesmo são comuns em mais de 50% das neoplasias humanas (FUNG e FISHER, 1995).

46 Introdução Localização e estrutura do gene TP53 O gene TP53 humano está localizado no cromossomo 17p13 e é um dos alvos mais freqüentes para alterações em tumores humanos (HOLLSTEIN, SIDRANSKY et al., 1991). É extremamente conservado em diversos organismos como Xenopus laevis, aves, camundongos e humanos, sugerindo que a proteína codificada desempenhe um papel critico na célula (PROKOCIMER e ROTTER, 1994). O gene compreende 20 Kb de DNA, consistindo de 11 exons, sendo que o primeiro não é codificado e encontra-se separado do grupo de 10 exons 2, 4, 5, 7 e 8 codificam 5 grupos de seqüências de aminoácidos muito conservados durante a evolução (domínios conservados I V), localizados entre os resíduos 13 e 19, 117 e 142, 171 e 181, 236 e 258 e 270 e 288, respectivamente. O RNA mensageiro tem 2,6 Kb e contém uma grande região não codificada 3 que provavelmente está envolvida na estabilização da molécula (PROKOCIMER e ROTTER, 1994) Proteína p53 Um dos principais genes envolvidos na apoptose é o TP53 que expressa a proteína p53. Está localizada no braço curto do cromossomo 17p13.1, codificando uma fosfoproteína de 53 kda e 393 aminoácidos; tem a característica de ser expressa quando o DNA sofre algum tipo de dano, sendo sua principal função a manutenção da integridade do código genético em cada célula (LANE, 1992; PINHO, 2000). A p53 é uma proteína supressora tumoral que pertence a uma pequena família de proteínas relacionadas, que incluem dois outros membros p63 e p73. Essa proteína parece estar envolvida na prevenção de desenvolvimento de tumores, sendo ativada em resposta a vários sinais de estresse associados à malignidade,

47 Introdução 46 resultando na inibição do crescimento das células tumorais, incluindo a suspensão do ciclo celular, envelhecimento celular, diferenciação celular e apoptose, dependendo de muitos fatores que são intrínsecos e extrínsecos à célula, tais como o tipo celular, ambiente celular e outras alterações oncogênicas, que são experimentadas pela célula (BALINT e VOUSDEN, 2001; VOUSDEN e LU, 2002). Em geral, esses sinais de estresse celular provocam uma estabilização da proteína p53, o que leva a um aumento nos níveis de p53 na célula. Em algumas circunstâncias, a p53 também contribui para reparar o dano genotóxico, mas, na maioria dos casos, a indução da p53 leva a uma inibição irreversível do crescimento celular, através da ativação da apoptose (BALINT e VOUSDEN, 2001; VOUSDEN e LU, 2002). Como a p53 seleciona uma dessas conseqüências celulares (reparação celular ou apoptose) ainda permanece obscuro e é uma área de intensa pesquisa. O acesso da p53 aos sítios nucleares é regulado, primariamente, pelo transporte citoplasmático-nuclear. Nas células normais, a p53 é mantida ativa em baixos níveis no citoplasma, através da degradação proteasoma-dependente. Em resposta aos estímulos, ela é transportada rapidamente para o núcleo, onde permanece até a tarefa de vigilância ter sido completada (SHAULSKY, BEN-ZE'EV et al., 1990) Polimorfismo do gene TP53 Os polimorfismos genéticos são alterações naturais, na seqüência do DNA, que ocorrem em uma freqüência maior que 1% na população normal. A forma mais comum de polimorfismo é a que envolve a substituição de uma única base em uma seqüência de nucleotídeos (SNP Single Nucleotide Polymorphism) e é usualmente bialélica, isto é, há somente dois alelos, que são definidos pela presença de uma ou

48 Introdução 47 de outra base, em uma determinada posição (BALASUBRAMANIAN, COX et al., 2004). Algumas dessas alterações ocorrerão em seqüências não codificadoras do gene e, na maioria dos casos, não terão efeito em suas funções; outras ocorrerão em seqüência codificadoras, podendo levar à produção de proteínas defeituosas. Desse modo, em alguns casos, o polimorfismo genético pode aumentar a susceptibilidade ao câncer (LODISH, BERK et al., 2002). O polimorfismo do gene supressor de um tumor TP53, no códon 72, tem sido investigado extensamente para verificação de sua associação com vários cânceres em todo o mundo (KIETTHUBTHEW, SRIPLUNG et al., 2003). O códon 72 codifica um aminoácido arginina (CGC; Arg 72) ou um prolina (CCC, Pro72), correspondendo aos genótipos em homozigose arginina/arginina (Arg/Arg) ou prolina/prolina (Pro/Pro) e em heterozigose arginina/prolina (Arg/Pro) (ARA, LEE et al., 1990; TADA, FURUUCHI et al., 2001). O polimorfismo ocorre por simples substituição de uma base no códon, de guanina (G) para citosina (C), que resulta em alteração estrutural, bioquímica e biológica da proteína p53 (THOMAS, KALITA et al., 1999). A ocorrência de polimorfismos genéticos pode ser detectada pela técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction), combinada com técnica de restrição enzimática RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição)(izzotti, 2003) Glaucoma e a expressão do gene TP53 Geralmente, a célula recebe um estímulo para morrer. Para as células glanglionares retinianas, no glaucoma, esse estímulo pode estar na forma de perda do

49 Introdução 48 suporte neurotrófico, durante os períodos de PIO elevada (OPPENHEIM, 1991) e/ou exposição a um excesso de aminoácidos excitatórios (excitotoxinas), tais como glutamato liberado quando ocorre a isquemia do nervo óptico e das células glanglionares retinianas (LIPTON e ROSENBERG, 1994; NASKAR e DREYER, 2001). O dano celular se inicia e é detectado por alguma forma de sensor protéico que ainda não está caracterizado, cuja função crítica parece ser ativar a proteína supressora tumoral p53. A ação da p53 aumenta a expressão do gene antiapoptótico bax e diminui a expressão do gene anti-apoptótico bcl-2 (e, possivelmente, o bcl-x), cujos produtos agem como antagonistas na célula (NICKELLS, 1999). Embora a exata função desses produtos não seja conhecida, evidências indicam que eles afetam a liberação do citocromo c da mitocôndria, resultando na ativação de uma família de cisteína-proteases, denominadas caspases, que digerem os componentes celulares. Os fragmentos celulares são acondicionados em pequenas vesículas (corpos apoptóticos) que são fagocitados pelos macrófagos. Esse processo resulta na perda somente da célula ganglionar afetada e é freqüentemente considerado um suicídio celular (NICKELLS, 1999). Partindo-se do pressuposto de que o gene TP53 teria papel importante na apoptose que ocorre na neuropatia óptica glaucomatosa, o polimorfismo da proteína p53, no códon 72, foi estudado em pacientes com GPAA e comparado com o polimorfismo em indivíduos normais, em populações distintas. (LIN, CHEN et al., 2002; SENA, 2003; RESSINIOTIS, GRIFFITHS et al., 2004; DIMASI, HEWITT et al., 2005; DAUGHERTY, CURTIS et al., 2009). Este estudo se justifica, pois não há na literatura mundial qualquer publicação médica que avalie a associação do gene TP53 no GPAF.

50 2. OBJETIVOS

51 Objetivos 50 Os objetivos do presente estudo são: 1 Determinar as distribuições genotípicas do polimorfismo (Prolina/Prolina, Arginina/Arginina e Arginina/Prolina) do gene TP53 (códon 72) em pacientes brasileiros com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, comparando-se com a distribuição em controles sadios. 2 Verificar a associação alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, independentemente da presença ou não de história de crise aguda por bloqueio pupilar. 3 Verificar se a freqüência alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, sem história de crise aguda por bloqueio pupilar, difere daquela da população normal. 4 - Verificar se a freqüência alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, com história de crise aguda por bloqueio pupilar, difere daquela da população normal. 5 - Verificar se a freqüência alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, com história de crise aguda por bloqueio pupilar, difere daquela dos pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, sem história de crise aguda por bloqueio pupilar.

52 3. MÉTODO

53 Método 52 Este foi um Estudo observacional, tipo caso-controle, que incluiu cento e quarenta e cinco pacientes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP-USP e do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do Hospital do Servidor Público Estadual. O projeto desta pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética do HCFMRP- USP, tendo constituído o Processo número 8991/2001 e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa- CONEP Parecer 476/2002. Consentimento Informado Escrito foi obtido de todos os participantes. 3.1 Casuística Foram selecionados, consecutivamente, 73 pacientes portadores de GPAF, 60 pacientes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP- USP e 13 pacientes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do Hospital do Servidor Público Estadual. Desses 60 pacientes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP - USP, 38 haviam participado de estudo anterior (GOMES, 2002) e seus materiais genéticos (DNA) estavam armazenados no Hemocentro da FMRP-USP. Entre os pacientes com GPAF, 53 pacientes tinham história de crise aguda por bloqueio pupilar e 20 pacientes tinham história de GPAF, com aumento crônico da pressão ocular. Foram excluídos seis pacientes do grupo com GPAF, pois não era possível visualização adequada das características do nervo óptico. 3.2 Critérios de Inclusão Todos os pacientes foram examinados por médicos assistentes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP USP tanto nos

54 Método 53 pacientes quanto nos controles. Os critérios de inclusão foram: pacientes com GPAF - aqueles com ângulo da câmara anterior ocular fechado (verificado em gonioscopia realizada com lente de Goldmann - 3 espelhos ou lente de Zeiss); níveis de PIO iguais ou superiores a 21 mmhg, com história de crise hipertensiva aguda por bloqueio pupilar ou não, sendo as medidas realizadas com tonômetro de aplanação, tipo Goldmann, acoplado à Lâmpada de Fenda TOPCON (Modelo SL-D2, New Jersey, EUA), acompanhados de alterações sugestivas de glaucoma na cabeça do NO (observáveis na oftalmoscopia direta) e no campo visual (realizado com o perímetro computadorizado de Humphrey, Marca Zeiss ). A alteração do NO avançada foi caracterizada pela presença de pelo menos dois dos seguintes critérios: escavação do nervo óptico maior ou igual a 0,7, perda de rima neural localizada, hemorragia de disco ou assimetria da escavação do NO maior que 0,2. Definiu-se defeito de campo visual compatível com glaucoma, de acordo com um dos seguintes critérios: GHT anormal, PSD menor que 5%, escotoma paracentral, defeito arqueado típico (Bjerrum), degrau nasal, defeito em cunha temporal, defeito difuso, escotoma denso e ilha de visão. Todos os campos visuais foram avaliados por um glaucomatólogo experiente em campimetria visual e os resultados dessa avaliação foram aceitos pelo investigador. Foram incluídos, no estudo, os pacientes portadores de GPAF que não tivessem história de hipertensão arterial sistêmica, diabete melito e/ou doença de Chagas, na ocasião da coleta do sangue para extração do DNA. Utilizando-se os prontuários dos pacientes, foram colhidos os dados relativos ao exame físico (biomicroscopia, fundoscopia direta, gonioscopia e tonometria), dados de identificação (nome, registro, idade e sexo), bem como registro das alterações campimétricas.

55 Método 54 Foi definida crise congestiva: os pacientes relatam dor ocular e/ou periorbitária intensa, diminuição da acuidade visual, náuseas e vômitos. Ao exame, os olhos apresentam uma córnea edemaciada, midríase média não fotorreagente e câmara anterior rasa (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Na gonioscopia, foram observados goniosinéquias e o sinal da impressão de pigmentos irianos na parede do seio camerular. 3.3 Critérios de Exclusão Pacientes, com ângulo da câmara anterior ocular aberto (verificado em gonioscopia realizada com lente de Goldmann - 3 espelhos ou lente de Zeiss), que apresentassem cirurgia intra-ocular, refrativa ou conjuntival prévias, inflamação intraocular ou história de trauma ocular foram excluídos. Pacientes em que não era possível visualização adequada do fundo do olho. 3.4 Controle populacional Foram utilizados, como controles, 72 indivíduos caucasóides que não apresentavam qualquer doença sistêmica ou ocular, doadores de medula óssea do Hemocentro da USP de Ribeirão Preto, sendo 54 indivíduos do sexo masculino e 18 do sexo feminino. A idade dos controles variou de 22 a 52 anos de idade (mediana 38). 3.5 Método A análise das amostras foi realizada no Laboratório de Imunologia Molecular do HCFMRP-USP, com as etapas abaixo relacionadas:

56 Método Coleta de sangue e extração do DNA O DNA de ambos os grupos foi extraído após a colheita, em veia periférica, de 10 ml de sangue total, em tubos de vidro (Vácuo II-Labnew) estéreis, contendo EDTA a 15% - 54 microlitros / tubo. Em seguida, o sangue foi transferido para um tubo de 50 ml, sendo adicionado 40 ml de tampão de lise de hemácias gelado (sacarose 0,3 M, Tris-HCl 10 mm ph 7,5; MgCl 2 5 mm e Triton X %). Após a homogeneização e a centrifugação a 2400 x g a 4 o C por 10 minutos, o sobrenadante foi retirado e o precipitado novamente suspenso em 4,5 ml de tampão de lise de leucócitos (NaCl 0,075M e Na 2 EDTA 0,024M), adicionando-se 125 microlitros de SDS 10% e 1,1 ml de perclorato de sódio 5M, agitando-se por 10 segundos na temperatura ambiente. Para extração das proteínas foram acrescidos 2 ml de NaCl saturado (6M), seguido de agitação por 15 segundos e centrifugação a 2400 x g na temperatura ambiente, durante 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 50 ml, adicionando-se 7 ml de isopropanol absoluto. Após a inversão manual lenta do tubo, ocorreu a precipitação do DNA que, em seguida foi retirado com o uso da pipeta de Pasteur selada e colocado em tubo tipo Eppendorf, estéril, de 1,7 ml. Realizada a lavagem por uma vez em 1,5 ml de etanol 70% gelado, o DNA foi re-dissolvido em 250 microlitros de água autoclavada. O DNA foi homogeneizado e a sua concentração determinada por espectrofotometria, com leituras feitas em 260 e 280 nm (CASTALDELLI, 2000; MILLER, DYKES; POLESKY, 1988), sendo posteriormente estocado em freezer a -20 o C Amplificação do DNA e restrição enzimática As amostras de DNA obtidas de ambos os grupos foram amplificadas por PCR, utilizando-se uma combinação de oligonucleotídeos previamente preparados. Em seguida, o produto obtido foi submetido a RFLP com uma enzima de restrição

57 Método 56 específica, para que os principais grupos alélicos fossem distinguidos de acordo com o tamanho dos fragmentos gerados. Para amplificar a região do éxon 4 do gene TP53, que contêm o DNA polimórfico, foram utilizados dois iniciadores distintos, um para prolina e outro para arginina, descritos em estudo semelhante (SENA, 2003), cujas seqüências foram: Senso 5 3 : - Pro (5 CGT GCA AGT CAC AGA CTT -3, com 94 pb) para o polimorfismo do gene TP53 (códon 72) na forma de prolina (XXIDT 119 ). Anti-senso 5 3 : - Arg + (5 TCC CCC TTG CCG TCC CAA -3, com 138 pb) para o polimorfismo do gene TP53 (códon 72) na forma de arginina (XXIDT 119 ). Foi padronizada a condição da PCR para cada amostra de DNA conforme segue: - 21,92 microlitros de água estéril - 3,0 microlitros de tampão 10x Taq (Invitrogen) - 1,2 microlitros de cloreto de magnésio (MgCl 2 ) (Invitrogen) - 0,38 microlitro de desoxirribonucleotídeos fosfatados (dntp s ) (Invitrogen) - 0,9 microlitros de cada oligonucleotídeo iniciador (senso e anti-senso) (Invitrogen) - 0,2 microlitro de enzima Taq DNA polimerase (5U/microlitro) (Invitrogen) - 1,5 microlitros de DNA purificado Todos os reagentes estavam estocados à -20 o C.

58 Método 57 Procedimento: 1 - Todos os reagentes foram reunidos formando uma mistura com volume de 28,5 microlitros, ao qual foram adicionados os 1,5 microlitros de DNA purificado, totalizando um volume de 30 microlitros. A enzima Taq polimerase foi adicionada imediatamente antes de se colocar a preparação no termociclador. Como controle negativo, foram utilizados todos os reagentes acima citados, exceto o DNA, com o intuito de assegurar que não houve contaminação das amostras. Cada amostra foi aliquotada em um microtubo de 500 microlitros devidamente numerado. 2 - A amplificação da região do éxon 4 do gene TP53 foi realizada através de um programa de ciclo térmico no termociclador (Biocycler MJ96G-Biosystems), com duração aproximada de 2 horas e 15 minutos e consistiu de três etapas: - 1 ciclo a 94 o C durante 5 minutos, aquecendo a amostra para que haja a desnaturação do DNA, ou seja, a separação das fitas complementares (dupla hélice); - 35 ciclos: 94 o C por 45 segundos, 60 o C por 45 segundos e 72 o C por 45 segundos. Nesta etapa os iniciadores de oligonucleotídeos, complementares à região a ser amplificada, hibridizam-se com as respectivas extremidades das fitas despareadas de DNA. - 1 ciclo final a 72 o C durante 4 minutos, que é quando a Taq polimerase acrescenta nucleotídeos em seqüência aos iniciadores, formando a fita complementar. Assim, duas novas fitas são sintetizadas nos moldes das duas originais, completando o ciclo da PCR. Para cada ciclo da PCR, o número de cópias da seqüência do DNA nos locais do iniciador é duplicado e acumulado exponencialmente.

59 Método Cinco microlitros do produto final da PCR, corados com 5 microlitros de Azul de Bromofenol 0,025%, foram analisados através da eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, não desnaturante, corado com nitrato de prata 2%, verificandose se houve a correta amplificação (produto final com 279 pb). Foi padronizada a condição da RFLP para cada amostra de DNA conforme segue: - 1,5 microlitros de água estéril - 1,0 microlitro de tampão 10x Tango TN com BSA (Fermentas,U.S.A) - 0,5 microlitro da enzima de restrição BseDI (10 U/microlitro) (Fermentas, U.S.A) - 7,0 microlitros de DNA amplificado - Banho-Maria (BM-100, FANEM - São Paulo-Brasil) Procedimento: 1 - Sete microlitros do produto da PCR foram submetidos à RFLP em uma solução de 3,0 microlitros (total da mistura dos reagentes), totalizando 10 microlitros. Cada amostra foi aliquotada em um microtubo de 500 microlitros devidamente numerado. 2 - A amostra foi colocada no banho-maria durante 12 horas a 55 o C. 3 - Os fragmentos de DNA resultantes dessa restrição enzimática (5 microlitros da amostra corados com 5 microlitros de Azul de Bromofenol 0,025%), foram analisados em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata 2%, analisando-se o padrão de bandeamento do DNA para se distinguirem os principais grupos alélicos, de acordo com o tamanho dos fragmentos gerados.

60 Método 59 A presença do fragmento com 138 pb representa o alelo Arg, e do fragmento com 94 pb, o alelo Pro. O genótipo da amostra poderia ser homozigoto Arg/Arg ou homozigoto Pro/Pro ou heterozigoto Arg/Pro. Material utilizado para a preparação do gel de poliacrilamida 10% e eletroforese : - 2 placas de vidro de tamanho médio,espaçadores e pente - 20 ml de Mix gel não desnaturante a 10% - 20 microlitros TEMED (C 6 H 16 N 2 ) microlitros de perssulfato de potássio (K 2 O 8 S 2 ) -marcador de DNA de peso molecular de 100 pb (Promega-Madison, U.S.A) - amostras de DNA coradas com Azul de Bromofenol 0,025% - TBE 1x (Tris Boric Acid) - condutor - cuba de eletroforese - fonte de eletroforese fixada em 200 V ml de solução fixadora alcoólica 10% com ácido acético - 1 ml nitrato de prata 2% ml de solução reveladora com 1 ml formaldeído ml de solução fixadora Após a preparação, o gel foi imediatamente aplicado a um cassete de tamanho determinado, previamente montado. Este cassete é composto por duas placas de vidro colocadas sobre um suporte, separadas por espaçadores de teflon e presas com grampos de aço. Logo em seguida da aplicação do gel entre as placas, colocou-se um pente de teflon na borda superior, este tem por função formar os sulcos onde, posteriormente,serão aplicadas as amostras. O tempo de polimerização foi de aproximadamente 15 minutos.

61 Método 60 Com o gel polimerizado, o pente foi retirado e este montado em uma cuba de eletroforese vertical contendo tampão TBE em ambos os pólos. As amostras, misturadas ao corante, foram aplicadas no gel, assim como o marcador de migração, e o equipamento ligado a uma fonte de alta voltagem e submetido à voltagem constante, pelo tempo aproximado de 1 hora e 30 minutos. Retirado da placa, o gel foi colocado na solução fixadora por 5 minutos e, em seguida, adicionou-se à solução fixadora 1 ml de solução de nitrato de prata. O gel foi agitado por 5 minutos nessa solução. Depois de descartada a solução fixadora com prata, o gel foi lavado 1 vez em água. Desprezada a água, foi colocada a solução reveladora com formaldeído sobre o gel, que foi agitado até o aparecimento das bandas. Realizada a leitura dos géis, estes foram secos para serem arquivados. A secagem foi feita colocando-se os mesmos entre duas folhas de papel celofane embebidas em água, sobre uma placa de vidro, à temperatura ambiente por 2 ou 3 dias. 3.6 Análise Estatística A freqüência do polimorfismo do gene TP53 foi calculada para a amostra total de 67 pacientes e para os 72 indivíduos-controle. A análise estatística foi realizada pelo teste do Qui-Quadrado א) 2 ), com correção de Yates, ou pelo teste exato de Fisher Bicaudal, quando necessário. O mesmo foi aplicado para verificar a significância estatística das associações, quando comparadas com as freqüências de cada genótipo, alelos e antígenos estudados na amostra total de pacientes e controles. Os valores iguais ou inferiores a 0,05 (Intervalo de Confiança=95%) foram considerados significantes(hennekens e BURING, 1987). Todas as análises foram realizadas utilizando-se o software StatCal (Epi Info,versão 6.0).

62 4. RESULTADOS

63 Resultados 62 Foram selecionados 73 pacientes com GPAF para este Estudo, sendo que seis pacientes foram excluídos, pois não era possível visualização adequada das características do nervo óptico. Para análise dos resultados foram escolhidos um olho de cada paciente, que apresentavam maior alteração no nervo óptico. A média de idade dos indivíduos foi de 65,64 ± 10,33 anos (variando de 34 a 84 anos), sendo 48 pacientes, no grupo com GPAF, com história de crise aguda, a idade foi de 66,25 ± 8,72 anos (variando de 46 a 81 anos) e 19 pacientes com GPAF, sem história de crise aguda, foi de 63,95 ± 14,04 anos (variando de 34 a 84 anos). 43 pacientes (65,1%) eram do sexo feminino, 2 (2,8%) eram pardos, 64 (97,2%) eram brancos. A proporção de pacientes do sexo feminino e do sexo masculino, no grupo com GPAF, foi estatisticamente diferente da do grupo-controle (p < 0,05). A sensibilidade da eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida de coloração com nitrato de prata, permitiu a visualização bem definida dos alelos no loci analisados (Figura 1). Figura 1. Eletroforese em gel de poliacrilamida seguida de coloração com nitrato de prata.

64 Resultados 63 PCR RFLC para a detecção do polimorfismo Arg72Pro no exon 4 do gene TP53, digeridos com a enzima de BseDI. Gel de poliacrilamida 10% não desnaturante, corado com nitrato de prata. Tabela 1 e 2 apresentam os resultados da tipificação dos subtipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro do polimorfismo do gene TP53 (códon 72), nos 73 pacientes com GPAF e 72 nos pacientes controles. Tabela 1. Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos pacientes com GPAF. REGISTRO GENÓTIPO SEXO IDADE COR AV OD AV OE AMETROPIA FO OD FO OE CRISE I ARG/ARG F 51 B CD 0,9 Hipermetrope 1,0/1,0 0,9/1,0 SIM K PRO/PRO M 57 B 1 0,4 Míope 0,6/0,6 0,9/0,9 SIM K ARG/ARG F 65 B SPL CD Hipermetrope inviável 0,6/0,7 SIM I ARG/PRO M 65 B 0,7 0,8 Míope 0,8/0,8 0,8/0,8 SIM G ARG/ARG M 65 B 0,8 PL Hipermetrope 0,4/0,4 1,0/1,0 SIM F ARG/PRO F 66 B 0,3 0,5 Míope 0,1/0,1 0,2/0,1 SIM E ARG/ARG M 66 B 1 CD Hipermetrope 0,9/0,8 1,0/1,0 SIM E ARG/PRO M 66 B MM SPL Hipermetrope 0,9/1,0 1,0/1,0 SIM A ARG/PRO F 67 B SPL 0,7 Míope inviável 1,0/0,9 SIM E ARG/ARG F 68 B CD 0,4 Míope 0,5/0,5 0,5/0,5 SIM C ARG/ARG M 74 B SPL 0,4 Hipermetrope inviável 0,2/0,2 SIM A ARG/PRO M 76 B 0,8 0,1 Míope 1,0/0,8 0,9/0,7 SIM G ARG/ARG M 78 B CD 0,05 Hipermetrope 1,0/0,9 0,9/0,8 SIM H ARG/ARG F 80 B MM CD Míope inviavel 0,8/0,8 SIM K ARG/PRO F 81 B 0,3 SPL Hipermetrope 0,5/0,4 1,0/1,0 SIM F ARG/ARG F 81 B 1 CD Míope 0,4/0,4 0,6/0,6 SIM B ARG/ARG F 75 P SPL SPL Hipermetrope inviavel inviavel SIM 0156H ARG/PRO F 65 N SPL CD Míope 1,0/1,0 0,9/0,9 SIM A ARG/ARG F 50 B 0,8 0,9 Hiperm 0,4/0,4 0,8/0,8 SIM K ARG/ARG M 64 B MM 0,8 Hiperm 0,9/0,9 0,7/0,7 SIM C ARG/PRO M 67 B 0,2 0,2 Hiperm 0,4/0,4 0,4/0,4 SIM

65 Resultados 64 REGISTRO GENÓTIPO SEXO IDADE COR AV OD AV OE AMETROPIA FO OD FO OE CRISE A PRO/PRO M 80 B 1 0,8 Hiperm 0,9/0,9 0,8/0,8 SIM H ARG/ARG F 64 B 0,8 0,4 Hiperm 0,9/0,9 0,9/0,9 SIM J ARG/PRO M 68 B 0,8 0,8 Hiperm 0,9/0,9 0,9/0,9 SIM E ARG/ARG F 76 B 0,3 MM Hiperm 0,9/0,8 0,9/0,8 SIM PRO/PRO F 71 B 0,4 0,4 Hiperm 08/0,8 08/0,8 SIM ARG/PRO F 56 B 0,2 0,2 Hiperm 0,9/0,9 0,9/0,9 SIM ARG/ARG F 59 B 0,4 0,8 Hiperm 0,8/0,8 0,4/0,5 SIM ARG/PRO F 81 B 1 1 Hiperm 0,3/0,4 0,3/0,4 SIM B ARG/PRO F 76 B 0,2 0,1 Hiperm 0,9/0,9 0,9/0,8 SIM I ARG/PRO F 71 B 0,7 0,5 Hiperm 0,7/0,7 0,7/0,6 SIM ARG/PRO F 69 B 0,6 0,5 Hiperm 0,7/0,7 0,8/0,7 SIM G ARG/PRO F 53 B 0,8 0,8 Hiperm 0,4/0,5 0,5/0,4 SIM F ARG/PRO F 54 B 0,7 0,8 Hiperm 0,7/0,6 0,7/0,8 SIM A ARG/PRO F 55 B 0,5 0,7 Hiperm 0,7/0,8 0,8/0,8 SIM PRO/PRO F 67 B 0,1 0,2 Hiperm 0,9/0,8 0,9/0,9 SIM ARG/ARG F 62 B 0,9 0,8 Hiperm 0,7/0,8 0,7/0,8 SIM H ARG/ARG M 46 B 0,84 0,84 Hiperm 0,5/0,6 0,5/0,6 SIM A ARG/PRO F 72 B 0,84 0,84 Hiperm 0,8/0,8 0,8/0,8 SIM I ARG/PRO F 60 B 0,84 0,5 Hiperm 0,5/0,6 0,7/0,6 SIM I ARG/ARG F 65 B 0,9 0,9 Hiperm 0,4/0,4 0,4/0,4 SIM C ARG/PRO F 68 B 0,2 0,84 Hiperm 0,8/0,8 0,4/0,4 SIM A ARG/PRO M 72 B 0,28 0,84 Hiperm 0,8/0,8 0,2/0,2 SIM C PRO/PRO F 63 B CD 0,84 Hiperm 0,8/0,8 0,4/0,5 SIM I ARG/ARG F 63 B CD 0,84 Hiperm 0,8/0,8 0,4/0,5 SIM A PRO/PRO M 53 B CD 0,7 Hiperm 0,9/0,8 0,9/0,8 SIM J ARG/ARG F 78 N 0,2 0,2 Hiperm 0,9/0,9 0,9/0,9 SIM J ARG/PRO F 60 B 0,4 CD Hiperm 0,7/0,7 0,9/0,9 SIM E ARG/PRO F 69 B 0,9 0,9 Hiperm 0,4/0,4 0,4/0,4 SIM C ARG/PRO F 56 B 0,9 0,1 Hiperm 0,3/0,3 0,9/0,9 SIM F ARG/PRO F 72 B 0,6 0,4 Míope 0,9/0,9 0,9/,9 SIM B ARG/ARG F 61 B 0,9 0,9 Hiperm 0,7/0,7 0,7/0,7 SIM D ARG/PRO M 64 B 0,8 0,4 Hiperm 0,6/0,6 0,7/0,7 SIM

66 Resultados 65 REGISTRO GENÓTIPO SEXO IDADE COR AV OD AV OE AMETROPIA FO OD FO OE CRISE I ARG/ARG M 34 B 0,6 1 Míope 0,9/1,0 0,9/1,0 NÃO F ARG/ARG F 40 B 1 1 Hipermetrope 0,4/0,4 0,6/0,5 NÃO I ARG/PRO F 41 B 1 1 Míope 0,7/0,6 0,5/0,5 NÃO K ARG/ARG M 50 B 0,7 0,8 Míope 0,2/0,3 0,2/0,3 NÃO I ARG/ARG F 57 B 0,9 1 Hipermetrope 0,4/0,4 0,3/0,4 NÃO A ARG/ARG F 65 B 1 0,9 Hipermetrope 0,4/0,3 0,4/0,4 NÃO B ARG/ARG F 66 B 0,3 0,1 Hipermetrope 0,5/0,6 0,2/0,3 NÃO G ARG/ARG M 66 B 0,8 0,8 Míope 0,9/0,8 0,9/0,8 NÃO J ARG/PRO F 67 B 0,8 0,4 Míope 0,3/0,3 0,4/0,5 NÃO I ARG/PRO M 69 B CD CD Hipermetrope 0,9/0,9 0,9/0,9 NÃO B ARG/ARG M 69 B 1 CD Hipermetrope 0,5/0,5 0,5/0,5 NÃO C ARG/ARG F 70 B 0,7 SPL Hipermetrope 0,7/0,6 1,0/1,0 NÃO I ARG/ARG M 71 B 0,8 0,1 Míope 0,3/0,3 0,6/0,6 NÃO D ARG/PRO M 73 B 1 1 Míope 0,1/0,2 0,2/0,2 NÃO J ARG/ARG F 76 B 0,7 0,7 Hipermetrope 0,5/0,5 0,4/0,4 NÃO K ARG/ARG M 78 B 0,3 0,1 Míope 0,8/0,8 0,5/0,6 NÃO K ARG/PRO F 81 B 0,2 0,3 Míope 0,3/0,3 0,3/0,3 NÃO A ARG/PRO F 84 B 0,1 0,1 Míope 0,5/0,5 0,6/0,6 NÃO B ARG/PRO F 58 P 0,9 0,6 Míope 0,7/0,6 0,8/0,7 NÃO K PRO/PRO F 55 N 1 SPL Míope 0,5/0,5 inviavel NÃO Tabela 2. Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos 72 controles. REGISTRO GENÓTIPO SEXO IDADE 616 ARG/ARG Fem ARG/ARG Fem ARG/ARG Fem ARG/PRO Masc ARG/ARG Fem PRO/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Fem 30

67 Resultados 66 REGISTRO GENÓTIPO SEXO IDADE 784 ARG/ARG Fem ARG/ARG Fem ARG/ARG Masc ARG/ARG Fem ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Fem ARG/PRO Fem ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Fem ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/PRO Fem ARG/ARG Masc ARG/PRO Fem ARG/ARG Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Fem ARG/ARG Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Fem ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Fem 43

68 Resultados 67 REGISTRO GENÓTIPO SEXO IDADE 898 ARG/ARG Masc ARG/ARG Fem ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc PRO/PRO Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc PRO/PRO Masc PRO/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/PRO Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc ARG/ARG Fem ARG/ARG Masc ARG/ARG Masc 34

69 Resultados 68 No cálculo dos valores de probabilidade (p), não houve diferença significativa na freqüência genotípica para o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO) do gene p53, entre grupo com GPAF e do grupo- controle; obteve-se p = 0,3984 (Tabela 3) Tabela 3. Freqüência genotípica absoluta e relativa dos grupos com GPAF e do grupo-controle, de acordo com o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO) do gene TP53 (códon 72). Grupo Genótipo PRO/PRO N(%) ARG/ARG N(%) ARG/PRO N(%) GPAF 6 (8,9%) 29 (43,3%) 32(47,8%) Controles 4 (5,5%) 39 (54,2%) 29 (40,3%) No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve diferença significativa entre os alelos do grupo com GPAF e do grupo- controle; obteve-se p = 0,2345. (Tabela 4) Tabela 4. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF e do grupocontrole, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72). Prolina Arginina Total GPAF 44 (32,8%) 90 (67,2%) 134 Controles 37 (25,7%) 107 (74,3%) 144 Total

70 Resultados 69 No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, houve diferença significativa entre o grupo com GPAF, com crise aguda, quando comparado ao grupo-controle; obteve-se p = 0,0455. (Tabela 5) Tabela 5. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF, com história de crise, e do grupo-controle de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72). Prolina Arginina Total GPAF com crise 37 (38,5%) 59 (62,5%) 88 Controle 37 (25,7%) 107 (74,3%) 144 Total No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve diferença significativa entre o grupo com GPAF, sem crise aguda, quando comparado ao grupo-controle; obteve-se p = 0,4017 (tabela 6). Tabela 6. Mostra a freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF, sem história de crise, e do grupo-controle, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72). Prolina Arginina Total GPAF sem crise 7 (18,4%) 31 (81,6%) 38 Controle 37 (25,7%) 107 (74,3%) 144 Total

71 Resultados 70 No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, houve diferença significativa entre o grupo com GPAF, com crise aguda, quando comparado ao grupo com GPAF sem crise; obteve-se p = 0,0251 OR: 2,9 (Tabela 7). Tabela 7. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF, sem história de crise, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72). Prolina Arginina Total GPAF com crise 38 (39,6%) 58 (60,4%) 96 GPAF sem crise 7 (18,4%) 31 (81,6%) 38 Total No grupo com GPAF, classificou-se grave aqueles que tinham escavação do nervo óptico maior ou igual a 0,7 e leve aqueles que tinham escavação do nervo óptico menor que 0,6. No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve diferença significativa entre os grupos com GPAF, considerando-se a escavação do nervo óptico; obteve-se p = 0,0744 (tabela 8). Tabela 8. Freqüência alélica absoluta e relativa nos pacientes com GPAF, considerando-se o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72). Prolina Arginina Total GPAF graves 35 (38,0%) 57 (62%) 92 GPAF leves 9 (16,7%) 33 (83,3%) 42 Total

72 Resultados 71 No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve diferença significativa entre os grupos com GPAF com crise, considerando-se a escavação do nervo óptico; obteve-se p = 0,4217 (Tabela 9). Tabela 9. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF com crise, considerando-se o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72). Prolina Arginina Total GPAF graves 32 (41%) 46 (59%) 78 GPAF leves 5 (24,5%) 13 (75,5%) 18 Total No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve diferença significativa entre os grupos com GPAF sem crise, considerando-se a escavação do nervo óptico; obteve-se p = 1,000 (Tabela 10). Tabela 10. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF sem crise, considerando-se o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72). Prolina Arginina Total GPAF graves 3 (21,4%) 11 (78,6%) 14 GPAF leves 4 (16,7%) 20 (83,3%) 24 Total

73 5. DISCUSSÃO

74 Discussão 73 Desde a descrição da estrutura do DNA, por WATSON e CRICK (1953), e o desenvolvimento do Projeto Genoma Humano, a extensão de informações contida nessa molécula ainda é uma incógnita para muitas doenças. Sabe-se, hoje, que existem por volta de 35 mil genes, muitos com função conhecida e que codificam um número muito maior de proteínas do que se supunha (FINISHING THE EUCHROMATIC SEQUENCE OF THE HUMAN GENOME, 2004). O rápido avanço tecnológico, na análise dos genes, informações do genoma humano e a viabilidade da bioinformática, têm levado à indicação de muitos genes candidatos às doenças oculares, como o glaucoma(fan, WANG et al., 2006). A análise molecular desses genes candidatos às doenças tem fornecido informações para o estabelecimento de marcadores genéticos úteis ao diagnóstico. Há muitas vantagens no diagnóstico molecular como, por exemplo: (a) providenciar um teste inequívoco de alta especificidade; (b) possibilitar a identificação de portadores assintomáticos, mais susceptíveis de desenvolverem a doença do que os nãoportadores, predizendo o risco de doença ocular genética intratável e efetiva prevenção das tratáveis; (c) providenciar informações para consulta genética; (d) instituir serviços de diagnóstico pré-natal(fan, WANG et al., 2006). O GPAA é uma doença neurodegenerativa que reduz a visão à medida que as células ganglionares morrem(harris, 1965; STONE, FINGERT et al., 1997; REZAIE, CHILD et al., 2002, MELLO, MANDIA et al., 2006). A pressão intra-ocular (JONAS, XU et al., 2009), hereditariedade(libby, GOULD et al., 2005), idade (JONAS, XU et al., 2009), miopia(lam, THAM et al., 2002), diabetes (ARMALY e BALOGLOU, 1967), hipotensão arterial (BONOMI, MARCHINI, MARRAFFA, BERNARDI, MORBIO et al., 2000), entre outros, são citados como fatores de risco para desenvolvimento e progressão do glaucoma.

75 Discussão 74 A apoptose pode ser a via final comum da morte das células ganglionares no glaucoma, pois marcadores de apoptose têm sido observados na retina de pacientes glaucomatosos e em glaucoma experimental (QUIGLEY, NICKELLS et al., 1995). O processo apoptótico requer a expressão de genes específicos e pode ser identificado usando-se métodos histoquímicos e bioquímicos (QUIGLEY, NICKELLS et al., 1995; KERRIGAN, ZACK et al., 1997; OKISAKA, MURAKAMI et al., 1997). Um dos principais genes envolvidos na apoptose é o TP53, que expressa a proteína p53 (LANE, 1992; PINHO, 2000). Essa é uma proteína supressora tumoral que parece estar envolvida na prevenção de desenvolvimento de tumores, sendo ativada em resposta a vários sinais de estresse, associados à malignidade, resultando na inibição do crescimento das células tumorais, incluindo-se a suspensão do ciclo celular, envelhecimento celular, diferenciação celular e apoptose, dependendo de muitos fatores que são intrínsecos e extrínsecos à célula, tais como o tipo celular, ambiente celular e outras alterações oncogênicas que são experimentais pela célula (BALINT e VOUSDEN, 2001; VOUSDEN e LU, 2002). Geralmente, a célula recebe o estímulo para morrer. Para as células ganglionares retinianas, no glaucoma, esse estímulo pode ser na forma de perda do suporte neurotrófico, durante os períodos de PIO elevada (OPPENHEIM, 1991) e/ou exposição a um excesso de aminoácidos excitatórios (excitotoxinas), tais como glutamato liberado quando ocorre a isquemia do nervo óptico e das células glanglionares retinianas (LIPTON e ROSENBERG, 1994; NASKAR e DREYER, 2001). O dano celular se inicia e é detectado por alguma forma de sensor protéico que ainda não está caracterizado, cuja função crítica parece ser ativar a proteína supressora tumoral p53, que desencadeia a apoptose (NICKELLS, 1999),

76 Discussão 75 Partindo-se da hipótese de que o gene TP53 poderia ter algum papel na neuropatia glaucomatosa, foram desenvolvidos vários estudos em pacientes com GPAA como os de LIN, CHEN et al. (2002) que encontraram predominância da forma Pro/Pro, porém ACHARYA, MITRA et al. (2002) não encontraram nenhuma associação. O presente Estudo investigou o polimorfismo do gene TP53 (códon 72) em pacientes com GPAF, recrutados no ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP-USP e do HSPE e em controles sadios, através da técnica PCR-RFLP, em virtude de ser uma técnica de realização simples e de baixo custo, ao contrário da técnica de seqüência direta do DNA. Segundo o Consenso da Sociedade Brasileira de Glaucoma, o GPAF é uma entidade clínica caracterizada pelo fechamento parcial ou completo do ângulo da câmara anterior, decorrente de condições anatômicas que propiciam formações de goniossinéquias, com conseqüente elevação da PIO de forma aguda, intermitente ou crônica, com eventual lesão do disco óptico (MELLO, MANDIA et al., 2006). Na população geral, existem muito mais indivíduos que apresentam seio camerular estreito do que pacientes que realmente desenvolvem uma crise congestiva ou GPAF assintomático (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Admite-se que, se o mecanismo responsável pelo bloqueio mecânico do trabeculado for eliminado de maneira precoce, antes de ocorrerem lesões no sistema de drenagem do humor aquoso, existe a possibilidade teórica da interrupção do processo da doença (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Na população desse estudo de GPAF, comparada aos controles, não houve diferença significativa: na distribuição gênica com 47,8%, Arg Homozigótica, 43,3% heterozigótica e 8,9% Pro homozigótica 47,8% Arg Homozigótica, 43,3% heterozigótica

77 Discussão 76 e 8,9% Pro homozigótica, enquanto nos normais foi de 40,3% Arg Homozigótica, 54,2% heterozigótica e 5,5% Pro homozigótica (p = 0,3984). Também SILVA, ARRUDA et al. (2009) avaliaram a ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) Arg-Pro (CGC to CCC) na população brasileira. Foram avaliados 104 pacientes com GPAA e 58 normais, não havendo diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,3311). A distribuição gênica, nos pacientes com GPAA, foi 23,07% Arg homozigótica, 75% heterozigótica e 1,93% Pro homozigótica, enquanto que, para os normais, encontrou-se 31,04% Arg homozigótica, 68,96% heterozigótica e 0% Pro homozigótica. O alelo mais comum, nos pacientes com GPAF e nos controles, foi a Arg72 (67,2% e 74,3%, respectivamente); também não houve diferença significativa (p = 0,2345). Em pacientes com GPAA, LIN, CHEN et al. (2002) estudaram pacientes chineses e encontraram diferenças significativas na distribuição do polimorfismo do gene p53 no códon 72 (p = 0,00782). Também demonstraram que o alelo Pro foi fator de risco para os pacientes com GPAA (odds ratio 2.389, 95% confidence interval: 1.14 to 5.01). Com SENA (2003), em seu estudo, a forma Pro/Pro, embora menos freqüente nos pacientes americanos com GPAA e com GPN, apareceu em proporção maior nesses pacientes do que nos indivíduos controle e foi associada à presença de alterações no campo visual atribuíveis ao glaucoma. RESSINIOTIS, GRIFFITHS et al. (2004) estudaram esse mesmo polimorfismo, bem como uma duplicação de 16 pares de base (pb) no ítron 3 do gene TP53, em uma população britânica, e observaram diferença significativa na distribuição do haplóide p53, que tinha a inserção de 16pb em conjunção com o polimorfismo do alelo Arg, no códon 72, em pacientes com GPAA.

78 Discussão 77 DAUGHERTY, CURTIS et al. (2009) estudaram, na população caucasiana, a incidência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72). Foram estudados 191 pacientes caucasianos com GPAA e 167 controles caucasianos. Foi encontrada significativa diferença na freqüência da Arg72Pro entre o grupo de GPAA e controle (p = 0,008). Pacientes, com homozigóticos para Arg, tinham risco 1,9 maior no desenvolvimento de glaucoma (p = 0,01). Foi encontrada, também, maior freqüência desse alelo nos pacientes com glaucoma de pressão normal do que com GPAA (0,81 versus 0,76). Diferentemente dos anteriores, ACHARYA, MITRA et al. (2002) também avaliaram a ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) mais o polimorfismo de uma duplicação no íntron 3 de 16 db. Na população indiana com GPAA, não foi encontrada diferença significativa em relação à população controle (p = 0,5627) DIMASI, HEWITT et al. (2005) também estudaram a ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) e da inserção 16dp no íntron 3 do gene TP53, em australianos com GPAA, comparando-os com um grupo- controle e concluíram que o polimorfismo da proteína p53, na forma Arg/Pro, não está associado com a presença de GPAA. MABUCHI, SAKURADA et al. (2009) avaliaram, na população japonesa, a ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) do exon 4 e da inserção 16dp no íntron 3. Avaliaram-se 425 pacientes com GPAA, incluindo 213 com pressão elevada e 212 com pressão normal, comparando-os com 189 normais. Não foram encontradas diferenças significativa entre os grupos e ainda não foi encontrada 16dp, no íntron 3.

79 Discussão 78 SAGLAR, YUCEL et al. (2009), em estudo de cohort, investigaram, na população turca, a associação entre a Apoliprotein E (APOE), proteína supressora tumoral (p53) e do inibidor 1A da quinase ciclina dependente (p21), em pacientes com GPAA. Foram avaliados 75 pacientes com GPAA e 119 normais. Não foi encontrada diferença significativa na distribuição de APOE, p53 e p21, entre os pacientes normais e GPAA (p = 0,38, p = 0,12 e p = 0,2 respectivamente). Em outro trabalho, realizado pelo grupo de pesquisa da FMRP-USP VARGAS (2009), verificou-se que, em GPAA, o genótipo mais freqüente nos pacientes com GPAA foi o Arg/Pro (49%) e o alelo mais freqüente é a Arginina ( 67,6% ). Neste Estudo, o alelo Pro72 ocorreu em maior freqüência e a diferença foi significativa, no grupo com GPAF com história de crise aguda, quando comparado ao grupo controle (p = 0,0455), enquanto que, nos pacientes com GPAF, sem história de crise aguda, não houve diferença estatística (p = 0,4017). Quando se compararam os grupos com GPAF, com e sem história de crise aguda, houve diferença estatisticamente significativa para o alelo Pro72 (p = 0,0251/OR 2,9); assim, os indivíduos que apresentam o alelo Pro72 têm chance 2,9% maior de ter crise aguda do que os que têm GPAF, mas não apresentam esse alelo. Não se encontrou, na literatura, explicação para o fato, pois a hipótese era a de que, em todas as formas de glaucoma, a Arginina estivesse mais freqüente, uma vez que o alelo Arg72 tem se mostrado com maior capacidade para provocar apoptose (DUMONT, LEU et al., 2003). Assim, apesar de não fazer parte dos objetivos iniciais, decidiu-se verificar se participantes do estudo não desenvolveram co-morbidades que pudessem estar causando vieses nos resultados. Apenas um indivíduo apresentou tumor maligno e a sua retirada do estudo não modificaria os resultados.

80 Discussão 79 Considerou-se, também, a hipótese de que o gene TP53 poderia estar envolvido em mecanismos determinantes das condições anatômicas dos olhos com fechamento angular, mas nem o método utilizado para inclusão dos pacientes no estudo, nem a revisão da literatura permitiram a confirmação dessa hipótese. Por isso, pretende-se continuar com a linha de pesquisa, para esclarecer melhor os achados. Neste Estudo, dividiram-se os indivíduos em dois grupos: GPAF graveaqueles olhos com nervos ópticos com escavação maior ou igual a 0,7 e não gravecom nervos ópticos com escavação menor que 0,6. Quando avaliada a freqüência alélica do grupo com GPAF e do grupo-controle, não foi encontrada diferença significativa (p = 0,0744), tanto para o grupo com história de crise ou sem (p = 0,4217 e 1,000, respectivamente), o que sugere que, apesar da presença significativa do alelo Pro72 nos pacientes com crise, a evolução foi a mesma. A presente pesquisa tem limitações, tanto no tamanho da amostra, quanto na dificuldade de encontrar alguma explicação lógica para a maior freqüência do alelo Pro72, em pacientes com crise aguda. Apesar do fato de a população brasileira ser multirracial, o que dificulta a comparação adequada com os achados dos diferentes estudos aqui citados, julga-se que o estudo contribuiu para apontar que existem diferenças entre o polimorfismo desse gene maior em pacientes com GPAF e crise aguda e a população normal.

81 6. CONCLUSÕES

82 Conclusões 81 O presente estudo permite concluir que: 1 - A distribuição genotípica no grupo com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado revelou que o polimorfismo não difere estatisticamente daquela do grupo-controle, composto por indivíduos sadios. 2 - Considerando-se pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, independentemente da presença ou não de história de crise aguda por bloqueio pupilar, não há associação entre essa doença e os alelos do gene TP Não existem diferenças significativas entre as freqüências do polimorfismo do gene TP53 em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, sem história de crise aguda por bloqueio pupilar, e nos controles sadios. 4 - O alelo Prolina do gene TP53 (códon 72) é significantemente mais freqüente em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado com história de crise aguda por bloqueio pupilar, do que em controles sadios. 5 - Não existem diferenças significativas entre as freqüências do polimorfismo do gene TP53, em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado com e sem história de crise aguda por bloqueio pupilar.

83 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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98 8. ANEXOS

99 Anexos 98 Anexo 1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Estamos convidando-o (a) para participar do projeto de pesquisa ANÁLISE DO POLIMORFISMO DO GENE TP53 (CODON 72) EM PACIENTES BRASILEIROS COM GLAUCOMA. Esta pesquisa tem por objetivo estudar a predisposição genética para desenvolver Glaucoma. Para isso, uma pequena quantidade de sangue será colhida, como amostra, no dia de hoje, ou se preferir no próximo retorno, para podermos estudar fatores genéticos presentes ou não em seu organismo, associados a essa doença. O único desconforto é o da picada da agulha, para uma coleta de 15 ml de sangue (mais ou menos uma colher de sopa). Outro pequeno problema, que raramente ocorre, seria o aparecimento de mancha escura no local da coleta, que desaparece em poucos dias. Das células desse sangue, extrairemos o material necessário para pesquisa das características de um dos genes que podem explicar o desenvolvimento do Glaucoma. Esse estudo trará benefícios para você (ou paciente sob sua responsabilidade), assim como para seus familiares e a população em geral, pois se espera, com este estudo, conhecer melhor as alterações genéticas associadas ao glaucoma, que nos auxiliarão no diagnóstico precoce e no aconselhamento genético familiar. A participação nesta pesquisa é VOLUNTÁRIA e seu nome (nome do paciente) vai ficar em segredo (com codificação numérica) e não aparecerá nos resultados da pesquisa, não havendo, assim, possibilidade de ser identificado (mantendo-se total privacidade). O(A) senhor(a) (ou paciente sob sua responsabilidade legal) não é obrigado(a) a participar desta pesquisa e o seu tratamento será feito da mesma maneira, mesmo se não concordar em participar. Além disso, se for de sua vontade, nos comprometemos a prestar informações ou esclarecimentos atualizados, durante todas as fases do estudo, mesmo que esses possam afetar a sua vontade de continuar participando. Caso concorde em participar, poderá também desistir em qualquer momento, sem qualquer prejuízo para o seu tratamento ou para o acompanhamento clínico, durante e após a conclusão do trabalho. Paciente/ Responsável legal : Ribeirão Preto, de de 20. Pesquisadora responsável: Profa. Dra. Maria de Lourdes V. Rodrigues (contato: )

100 Anexo 2 Anexos 99