UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC ANDRÉIA SILVA CAIO BIZ MALASSISE DANIEL JOSÉ DA SILVA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC ANDRÉIA SILVA CAIO BIZ MALASSISE DANIEL JOSÉ DA SILVA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI RELATÓRIO DE BASES EXPERIMENTAIS DA CIÊNCIA SANTO ANDRÉ 2009

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC ANDRÉIA SILVA CAIO BIZ MALASSISE DANIEL JOSÉ DA SILVA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI EXPERIÊNCIA 4 MICROBIOLOGIA Trabalho apresentado como avaliação parcial da disciplina de Bases Experimentais de Ciência do BC&T da UFABC. Orientador: Profª Raquel SANTO ANDRÉ 2009

3 Sumário 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS PARTE EXPERIMENTAL Materiais Métodos Preparo do meio de cultura Preparação das placas Testes RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS Anexo Anexo

4 3 1. INTRODUÇÃO O estudo da microbiologia, ramo da ciência responsável por analisar e estudar microorganismos de maneira geral iniciou-se há apenas algumas centenas de anos, apesar destes organismos invisíveis estarem presentes na vida humana há milhares de anos. (TORTORA, FUNKE & CASE p. 1-6). Muitos pensam que os microorganismos são, como um todo, prejudiciais aos seres humanos, sendo associados comumente a doenças como AIDS, infecções e inconveniências mais comuns, como comida estragada. Porém, os microorganismos patogênicos representam apenas uma ínfima parte, sendo que existem diversas aplicações práticas, artificiais ou naturais, úteis ao homem, como os micróbios, que no solo, auxiliam na decomposição de matéria orgânica, na indústria sintetizam acetona, ácidos orgânicos, vinagre, queijos, iogurtes e outras dezenas de produtos alimentícios. (TORTORA, FUNKE & CASE p. 1-6). Dentre os microorganismos que podemos encontrar a nossa volta, estão as Bactérias, Archaeas, Fungos, Protozoários, Algas, Vírus e parasitas multicelulares, como os Helmintos. (TORTORA, FUNKE & CASE p. 1-6). No caso de microorganismos utilizados comercialmente ou em estudos de laboratório, é necessário cultivá-los em um meio nutritivo, chamado de Meio de Cultura, que pode variar de composição de acordo com o organismo que se deseja cultivar. Assim que um microrganismo é inserido no meio de cultura, passa a ser chamado de inóculo. Se houver crescimento, passará a ser chamado de cultura. (TORTORA, FUNKE & CASE p. 163). É importante, antes que se inicie o cultivo de qualquer microrganismo, que seja feita a esterilização do ambiente em que ocorrerá o cultivo, e inclusive saber como controlar sua propagação indesejada. Um método eficiente de esterilização é a fervura de água (calor úmido) à alta pressão, mais conhecida como autoclave, em que a água atinge temperaturas superiores a 100 ºC, eliminando possíveis microorganismos indesejados. (TORTORA, FUNKE & CASE p. 186,187). No caso de necessidade de controle de microrganismos patogênicos, como é o caso de algumas bactérias, são usados antibióticos, como penicilina e ampicilina. A penicilina é altamente eficiente, apresentando nível de toxidade extremamente baixo. Seu composto básico é um ácido orgânico com um anel β-lactânico, obtido na cultura do bolor Pennicillium Chrysogenum, que interferem na síntese da parede

5 4 celular bacteriana. A ampicilina é uma penicilina de amplo espectro, que tem atividades contra Cocos Gram-positivos bactérias que possuem uma camada espessa de peptidoglicano que contém os ácidos teicóico e lipoteicóico equivalentes à das penicilinas naturais; é ativa também contra alguns bastonetes Gram-negativos bactérias que possuem uma fina camada de peptidoglicano e uma membrana externa que contém lipopolissacarídios, fosforolipídios e proteínas. (MURRAY; ROSETHAL & PFALLER p ). 2. OBJETIVOS Este experiência tem por objetivo analisar a presença de microorganismos de diversos ambientes através do cultivo em meios de cultura. Também é objetivo desta experiência compreender os processos laboratoriais para garantir um ambiente estéril de trabalho e evitar contaminações nos materiais cultivados. 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Materiais Na prática experimental foram utilizados os seguintes equipamentos e materiais: balança analítica, duas espátulas de pesagem, glicose, preparo para meio de cultura LB + ágar, água estéril, um béquer de 50 ml, proveta de 50 ml, bastão de vidro, garrafa de vidro com tampa de rosca, papel alumínio, autoclave, solução de ampilicina 1 mg.ml-1, um tubo falcon de 50 ml, tubo eppendorf, duas placas de petri, caneta de retroprojetor, dois cotonetes, filme de PVC estufa, uma moeda de R$0,50 e uma cédula de R$2, Métodos Preparo do meio de cultura Foram preparados 40 ml de meio de cultura utilizando-se de 1,6 g de LB + ágar (4% m/v do meio) e 0,8 g de glicose (2% m/v do meio), que foram pesados em um béquer. Mediu-se 40 ml de água em proveta que foram acrescentados aos poucos aos reagentes (LB + ágar e glicose) para se ter uma dissolução e aproveitamento dos reagentes mais eficiente. Esta mistura foi transferida à garrafa de vidro, que foi

6 5 parcialmente fechada e coberta em papel alumínio para a esterilização em autoclave por quinze minutos a pressão de 15 lb Preparação das placas Ligou-se o bico de Bunsen regulado para se produzir uma chama azul, e todos os procedimentos a seguir foram realizados em torno da sua chama. Após o resfriamento (temperatura em que foi possível encostar a garrafa no antebraço), 20 ml do meio foram transferidos ao tubo falcon e adicionado 1 ml da solução de ampicilina 1 mg.l -1. Esta porção do meio foi então transferida para uma das placas de petri, onde já se tinha feito a inscrição com caneta de retroprojetor na parte inferior conforme a Figura 1. E colocada para esfriar e endurecer com a tampa da placa semi-aberta. A outra porção foi transferida para outra placa e colocada para esfriar também com a tampa semi-aberta. Figura 1 Divisões das placas de Petri Testes Os quadrantes Controle 1 e Controle 3 foram usados como controle negativo, onde não se passou nada. Os quadrantes Controle 2 e Controle 4 foram usados como controle positivo, esfregou-se um cotonete na boca de um dos componentes do grupo, e passou-se então na no quadrante da placa sem anti-biótico e depois na placa com antibiótico, para evitar o arraste do antibiótico para a outra placa. Nos quadrantes Teste 1, foi esfregado uma ponta de cotonete que havia sido passada em uma moeda de R$0,50 (Anexo ). E nos quadrantes Teste 2, foi esfregada uma ponta de cotonete que havia sido passada em uma cédula de R$2,00 (Anexo ).

7 6 As placas foram lacradas com filme de PVC e condicionadas em estufa a 37 C por dois dias. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Após o período de aproximadamente 48 horas, as placas foram abertas. A figura 2 mostra o aspecto das duas placas. Tanto a placa com meio de cultura sem antibiótico e a com antibiótico apresentavam gotículas d água em sua tampa. Figura 2 Aspecto das placas após o período de 48 horas. A placa sem antibiótico, como se pode notar nas figuras 3 e 4, apresentou colônias de coloração branca de forma arredondada nos quatro quadrantes da placa de Petri. Sendo que no controle positivo C2 observou-se que a colônia era formada por círculos menores.

8 7 Figura 3 Placa sem antibiótico Figura 4 Placa sem antibiótico Como também foram encontradas colônias no controle negativo C1 não se pode afirmar que as colônias formadas nos quadrantes T1 e T2 eram provenientes das amostras de moeda ou cédula que foram coletadas. Essa contaminação pode ter sido provocada pelas gotículas de água que condensaram na tampa, e podem ter caído no meio, e espalhado o inóculo. Já na placa com meio de cultura com antibiótico, conforme a figura 5 e 6, não foram produzidas colônias, nem mesmo no controle positivo, o que evidência que as colônias observadas na placa sem antibiótico eram de natureza bacteriana. Figura 5 Placa com antibiótico Figura 6 Placa com antibiótico 5. CONCLUSÃO Através deste experimento, foi possível verificar que a Ampicilina é um antibiótico eficiente no que diz respeito a evitar proliferação de bactérias. O fato de ter sido detectada a presença de microrganismos no controle negativo da placa sem antibiótico se deve a uma possível contaminação do material por ocorrência de erro na realização das manobras assépticas e esterilização do ambiente, durante o

9 8 experimento. E não foi possível observar diferenças nas culturas provenientes da cédula e da moeda, pois se desenvolveram em proporções muito próximas e, devido à possível contaminação da placa sem antibiótico, não é possível afirmar qual é a fonte desses microorganismos. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BANCO Central do Brasil. Disponível em < Acesso 27 de mar MURRAY, Patrick R.; ROSENTHAL, Ken S.; PFALLER, Michael A. Microbiologia Médica. 5. ed. Rio de Janeiro, Elsevier, p TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 8. ed. Porto Alegre, Artmed, p. 1-6; 163,186,187

10 9 7. ANEXOS 7.1. Anexo 1 Questões de verificação Questão 1. O controle negativo seriam os controles 1 e 3, quadrantes onde não foi passado o cotonete, e ele mostra se as colônias formadas são da amostra ou do próprio sistema de cultura. O controle positivo seriam os controles 2 e 4, pois neles esfregou-se um cotonete que havia sido passado em um local em que a presença de microorganismos é conhecida. Questão 2. Porque os antibióticos têm ação bactericida ou bacterioestática, assim no meio com antibiótico os inóculos bacterianos não conseguiriam se desenvolver, a não ser que as bactérias inoculadas sejam de uma cepa resistente ao antibiótico em uso. Questão Macroscopicamente: analisando o aspecto na colônia, por exemplo, se apresentar aspecto filamentoso ou cremoso, trata-se provavelmente de fungos 2. Microscopicamente: pode-se diferenciar bactérias de fungos, pois as bactérias têm células menores que as dos eucariotos e de diferentes formatos, possibilitando sua diferenciação em grupos 3. Microscopicamente com uso de corantes: podem diferenciar diferentes grupos de bactérias através da adsorção ou não de um determinado corante, exemplo: bactérias gram-positivas ou gram-negativas. Questão 4. Em um material estéril todos os microorganismos, até os de forma mais resistentes (esporos bacterianos) estão destruídos. Já em um material limpo (desinfetado), as formas mais resistentes não estão necessariamente destruídas.

11 Anexo 2 Materiais da nota e da moeda Figura 2 Moedas de 50 centavos. Fonte: Banco Central do Brasil. Figura 3 Anverso: Efígie Simbólica da República, interpretada sob a forma de escultura. Reverso: Figura de uma tartaruga de pente (Eretmochelys imbricata), uma das cinco espécies de tartarugas marinhas encontradas na costa brasileira. Fonte: Banco Central do Brasil. As moedas de 50 centavos feitas com aço inoxidável, material que é utilizado em indústrias alimentícias por dificultar a proliferação de microorganismos. As notas de real são feitas com papel-moeda, este papel não possui nenhum mecanismo anti-microorganismos, dessa forma a proliferação de microorganismo pode acontecer sem grandes dificuldades.