CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO: DESENVOLVIMENTO DE EQUIPAMENTOS PARA CONGELAMENTO EM ACELERAÇÃO E PARA DESCONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO (98ºC/4seg)

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1 CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO: DESENVOLVIMENTO DE EQUIPAMENTOS PARA CONGELAMENTO EM ACELERAÇÃO E PARA DESCONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO (98ºC/4seg) GUILHERME VALENTE DE SOUZA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ SETEMBRO 2006

2 CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO: DESENVOLVIMENTO DE EQUIPAMENTOS PARA CONGELAMENTO EM ACELERAÇÃO E PARA DESCONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO (98ºC/4seg) GUILHERME VALENTE DE SOUZA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Orientador: Prof. José Frederico Straggiotti Silva CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ SETEMBRO 2006

3 CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO: DESENVOLVIMENTO DE EQUIPAMENTOS PARA CONGELAMENTO EM ACELERAÇÃO E PARA DESCONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO (98ºC/4seg) GUILHERME VALENTE DE SOUZA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Aprovada em 27 de setembro de Comissão Examinadora: Prof. José Antonio Silva Ribas (DS. Produção Animal) - UFF Prof. José Tarcisio Lima Thiébaut (DS. Produção Animal) - UENF Prof a. Isabel Cândia Nunes da Cunha (DS. Reprodução Animal) - UENF Prof. José Frederico Straggiotti Silva (DS. Reprodução Animal) UENF (Orientador)

4 ORAÇÃO DO CAVALO DONO MEU: Dá-me, freqüentemente, de comer e beber, e, quando tenhas terminado de trabalhar-me, dá-me uma cama na qual eu possa descansar comodamente. Examina todos os dias os meus pés e limpa meu pêlo. Quando eu recusar a forragem, examina meus dentes e minha boca, porque bem pode ser que eu tenha uma travagem que me impeça de comer. Fala-me; tua voz é sempre mais eficaz e mais conveniente para mim que o chicote, que as rédeas e que as esporas. Acaricia-me freqüentemente para que eu possa compreender-te, querer-te e servir-te da melhor maneira e de acordo com os teus desejos. Não corte o meu rabo muito curto, privando-me do melhor meio que tenho para espantar as moscas e insetos. Não me batas violentamente e nem dês golpes violentos nas rédeas, pois, se não obedeço, como queres, é porque ou não te compreendo ou porque estou mal encilhado, com o freio mal colocado, com alguma coisa nos meus pés ou no meu ombro que me causam dor. Se eu me assustar, não deves bater-me sem saberes a causa disso, pois bem pode ser o defeito de minha vista ou um proverbial aviso para ti. Não me obrigues a andar muito depressa em subidas, descidas, estradas empedradas ou escorregadias. Não permaneças montado sem necessidade, pois prefiro marchar, a ficar parado com uma sobrecarga sobre o dorso. Quando cair, tenha paciência comigo e ajuda-me a levantar, pois, faço quanto posso para não cair

5 e não causar-te desgosto algum. Se tropeçar, não deves pôr a culpa para cima de mim, aumentando minha dor e a impressão de perigo com tuas chicotadas; isso só servirá para aumentar meu medo e minha má vontade. Procura defender-me da tortura do freio, não no trabalho, mas quando esteja em descanso, e cobre-me com a manta ou com uma capa apropriada. Enfim meu dono, quando a velhice me tornar inútil, não esqueça o serviço que te prestei, obrigando-me a morrer de dor e privações sob o jogo de um dono cruel ou nos varais de uma carroça, se não puderes manter-me, ou mandar-me para o campo, mata-me com tuas próprias mãos, sem me fazer sofrer. Eis tudo o que eu te peço, em nome daquele que quis nascer numa baia, minha morada e não num palácio, tua casa. Autor desconhecido

6 Aos meus pais, pela educação desde meu primeiro dia de vida até hoje e, também, pelo mais puro amor, carinho, dedicação e companheirismo nas horas mais difíceis dessa dura caminhada. Aos meus irmãos, William e Marden, pela força em todos os momentos de nosso dia-a-dia. À minha noiva, Lívia, pela sua imensa dedicação, compreensão, amor e carinho em todos os momentos e a seus familiares, pela atenção e carinho. Ao meu avô e ao meu tio-avô, Walcy e Hervan, respectivamente, por passarem as suas experiências de vida de forma simples, mas de tão bela grandeza para minha formação como pessoa e, a todos meus familiares tanto os presentes em vida quanto os ausentes. DEDICO

7 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me dado forças para finalizar este trabalho e por sempre estar presente para que eu superasse os obstáculos encontrados nessa minha árdua caminhada. À Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) e ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) pelo oferecimento deste curso. Ao CNPq pela concessão de bolsa de estudo, pois sem ela seria impossível permanecer nesta cidade. Ao orientador e professor José Frederico Straggiotti Silva, principalmente pela amizade e confiança, pela orientação neste trabalho de forma integral e incansável, por me fazer um pesquisador capaz de vencer obstáculos dando estímulos, sugestões e apresentando algumas dificuldades para desenvolver a capacidade de pensar. Ao meu amigo Bruno Fagundes, pela sua amizade fraterna, desde o início de nossa difícil caminhada pela graduação, mestrado e doutorado, mostrando-se presente em todos os momentos, sem medir esforços para ajudar. Ao Cláudio Wermelinger, por sua amizade e ajuda para a realização deste trabalho de pesquisa. Aos nobres amigos José Renato e Marcus Barreto, pela amizade fraterna e companheirismo, mostrando sempre prontos nas horas difíceis como também no compartilhamento do conhecimento.

8 Ao Vinícius, caro Watson, meu co-orientado de Iniciação Científica, por sua intensa e incansável ajuda e pela sua amizade. Aos técnicos do LMGA, Thiago e Vânia, pelos auxílios nos trabalhos desenvolvidos, pela organização e manutenção de equipamentos do laboratório. Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

9 BIOGRAFIA GUILHERME VALENTE DE SOUZA, filho de Telmo Marden de Souza e Anna Maria Valente de Souza, nasceu em 21 de junho de 1977, na cidade de Rio Bonito RJ. Em março de 1996, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes RJ, onde se formou em março de Em março de 2001, deu início ao Curso de Pós-graduação em Produção Animal, ao nível de Mestrado, na área de Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese, para conclusão do curso, em março de Em março de 2003, deu início ao Curso de Pós-graduação em Produção Animal, ao nível de Doutorado, na área de Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese, para conclusão do curso, em setembro de 2006.

10 RESUMO Souza, Guilherme Valente; DSc; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; setembro/2006; Criopreservação de sêmen eqüino: desenvolvimento de equipamentos para congelamento em aceleração e para descongelamento ultrarápido (98ºC/4seg); Professor orientador: José Frederico Straggiotti Silva. Professora conselheira: Isabel Cândia Nunes da Cunha. O sêmen criopreservado de mamífero é reconhecidamente caracterizado por ter uma fertilidade menor em comparação com o sêmen fresco. A redução da fertilidade transparece tanto em uma menor viabilidade pós-descongelamento como nas disfunções sub-letais da porção da sub-população sobrevivente. Torna-se necessário, então, uma otimização da criopreservação do sêmen eqüino e conseqüente padronização desta metodologia, pois facilitaria o armazenamento e a propagação da genética de cavalos de grande valor através da reprodução assistida. Pretendeu-se, neste trabalho, desenvolver um novo protocolo de congelamento e de descongelamento de sêmen eqüino utilizando um sistema automatizado eletroeletrônico para o congelamento e outro para o descongelamento. No congelamento foram utilizadas 4 curvas de resfriamento, obtidas à 1cm, 4cm e 8cm acima do nível do nitrogênio líquido e, a outra através da máquina de congelamento, sendo a taxa de resfriamento para o congelamento à 1cm do nitrogênio foi de - 87ºC/min de 5 à -120ºC e -8,65ºC/min de -120 à -196ºC, taxa de resfriamento para o congelamento à 4cm do nitrogênio foi de -46,8ºC/min de 5 à -120ºC e -9,86ºC/min de -120 à -196ºC, taxa de resfriamento para o congelamento à 8cm do nitrogênio foi de -15,26ºC/min de 5 à -120ºC e -31,71ºC/min de -120 à -196ºC e taxa de resfriamento para o congelamento na máquina foi de -12,20ºC/min de 5 à -120ºC e -85ºC/min de à -196ºC. No descongelamento utilizou-se duas metodologias, a convencional (37±1ºC/1minuto) e na máquina de descongelamento ultra-rápido (98±1ºC/4 seg e depois 37±1ºC até completar 1 minuto). Foi verificado que a interação máquina de congelamento com a máquina de descongelamento ultra-rápido foi a melhor interação, visto que a proporção da integridade de acrossoma foi maior entre as médias populacionais por intervalo de confiança, com 95% de probabilidade.

11 Propõe-se como novo protocolo de criopreservação de sêmen eqüino a interação das duas máquinas. Palavras-chave: Eqüino, espermatozóides, congelamento, descongelamento, máquina de descongelamento ultra-rápido e máquina de congelamento.

12 ABSTRACT The mammalian criopreservated semen is characterized by having a lower fertility rate when compared to fresh semen. The reduction of the fertility is presented in a lower post-thawing semen viability and also in a sub-lethal damage of the cryosurvival sob-population. Then, the optimization of the stallion semen cryopreservation and standardization of this procedure is a must, since it enables the storage and propagation of high genetic stallions through the attended reproduction. The aim of this work was to develop a new freezing and thawing stallion semen protocols using an electronic programmable system for freezing and another one for thawing. To freeze, four cooling rates have been used, and have been obtained at 1cm (-87ºC/min from 5 to -120ºC and -8,65ºC/min from -120 to -196ºC), 4cm (46,8ºC/min from 5 to -120ºC and -9,86ºC/min from -120 to -196ºC) and 8cm (- 15,26ºC/min from 5 to -120ºC and -31,71ºC/min from -120 to -196ºC) above the liquid nitrogen vapour and the other one through the freezing machine (-12,20ºC/min from 5 to -120ºC and -85ºC/min from -120 to -196ºC). Two methods have been used at the thawing process, the standard one (37±1ºC/1min) and the ultra-fast thawing machine (98±1ºC/4sec and after 37±1ºC until one full minute). This study demonstrates that the interaction of both machines (the freezing and the thawing ones) was better than all the other interactions, since the acrossome integrity proportion was higher among population standards per confidence interval, with 95% of probability. The interaction between these two machines is proposed as a new protocol of stallion semen cryopreservation.

13 Key-words: Equine, spermatozoa, freezing, tthawing, ultra-fast thawing machine and freezing machine.

14 SUMÁRIO RESUMO viii ABSTRACT x 1 INTRODUÇÃO 01 2 REVISÃO DE LITERATURA Sêmen Células espermáticas Membrana Plasmática do espermatozóide Plasma seminal Efeitos da temperatura Taxa de resfriamento Formação e dissolução dos cristais de gelo Processos da Criopreservação Congelamento Descongelamento Pressão osmótica 24 3 MATERIAL E METODOS Animais Sêmen Soluções Diluentes Diluente de centrifugação Diluente de congelamento Formol-citrato Diacetato carboxifluoresceína e iodeto de propídio CFDA Fitc-PNA e iodeto de propídio - Fitc-PNA Concentração das amostras Sêmen nativo Células em diluente de centrifugação Células em diluente de congelamento Congelamento Temperatura e tempo de descongelamento Motilidade espermática 32

15 3.8 Integridade de membranas CFDA Integridade de acrossoma - Fitc-PNA Máquina de descongelamento Máquina de congelamento em aceleração Estatística 38 4 RESULTADOS Motilidade Integridade de membrana Integridade de acrossoma Curvas de congelamento Curva de resfriamento 20±1ºC à 5±1ºC Curva de congelamento à 1cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC Curva de congelamento à 4cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC Curva de congelamento à 8cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC Curva de congelamento na máquina de 5±1ºC à -196ºC Curvas de descongelamento Curvas de descongelamento convencional Curvas de descongelamento na máquina ultra-rápida 51 5 DISCUSSÃO 52 6 CONCLUSÃO 61 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 62 8 ANEXOS 70

16 1 1. INTRODUÇÃO A inseminação artificial foi a biotecnologia mais importante aplicada aos animais e, com seu desenvolvimento, houve o melhoramento nos métodos de manejo dos machos e coleta, avaliação, preservação de sêmen e inseminação, não deixando de salientar avanços ocorridos nas metodologias de detecção do cio e no controle do ciclo estral nas fêmeas. O desenvolvimento da inseminação artificial foi um marco histórico de incansáveis pesquisadores dedicados na busca do conhecimento para substituir a ficção em fatos e, conseqüentemente, a aplicação desta ferramenta biotecnológica. Existe uma história não documentada que os árabes obtinham sêmen de esponjas introduzidas na vagina de éguas cobertas de grupos rivais e usavam estas para inseminar suas próprias éguas. Os primeiros a visualizarem os espermatozóides foram LEEWENHOEK e seu assistente, HAMM, no ano de 1678, denominando-os de animacules (FOOTE, 2002). A primeira inseminação artificial com sucesso foi feita por Spallanzani, no ano de 1784, feita em cão, obtendo como resultado 3 filhotes após 62 dias da inseminação (FOOTE, 2002). As pesquisas sobre inseminação artificial em eqüinos iniciaram-se na Rússia em 1899 (IVANOFF, 1922, citado por FOOTE, 2002) estimuladas pela necessidade de cavalos para uso das forças militares. ISHIKAWA iniciou estudos similares no Japão em 1912 (NISHIKAWA, 1962, citado por FOOTE, 2002); já nos Estados

17 2 Unidos os estudos sobre coleta, processamento e inseminação em eqüinos foram iniciados por MCKENZIE e colaboradores em 1939 e BERLINER em As primeiras coletas de sêmen foram realizadas colocando um saco de coleta de borracha na vagina de éguas em cio. Em 1930 e 1940, outros modelos de vagina artificiais foram desenvolvidos e vêm sendo modificados. A primeira versão de modelo de vagina artificial para eqüino foi desenvolvida por NISHIKAWA (DAVEIS MOREL, 1999). Antes da II Guerra Mundial a principal fonte de garanhões provinha dos plantéis de cavalos militares (MAULE, 1962, citado por FOOTE, 2002), e, no pósguerra, muitos desses plantéis foram eliminados porque a população de cavalos decresceu. A regulamentação de algumas associações de criadores de cavalos ao restringir o uso da inseminação artificial desestimulou as pesquisas nesta área e a sua aplicação. Entretanto a China foi a que mais utilizou a inseminação artificial em eqüino neste período. No decorrer da história da criopreservação, POLGE et al. (1949) tiveram sucesso no congelamento de sêmen de ave ao incluir no diluente o glicerol. Muitos pesquisadores realizaram experimentos, no ano de 1940, para congelar sêmen de touro utilizando etileno glicerol e conservando-o a 10ºC, porém, não tiveram sucesso. Também foram utilizados açúcares como crioprotetor, mas sem sucesso (FOOTE, 2002). O diluente utilizado por POLGE foi originalmente citrato-gema mais glicerol (SALISBURY et al., 1941). ALQUIMIST e colaboradores (O DELL e ALQUIMIST, 1957) desenvolveram o meio para criopreservação de sêmen de touros utilizando leite integral mais glicerol. O diluente tampão tris-gema mais glicerol também promoveu excelente proteção aos espermatozóides congelados e não-congelados (FOOTE, 1998). Outra grande mudança ocorreu nos anos de 1950 com a troca da substância criogênica utilizada para o armazenamento do sêmen congelado. O dióxido de carbono sólido à 79ºC foi substituído pelo nitrogênio líquido à 196ºC. Alguns pesquisadores demonstraram que a sobrevida dos espermatozóides à 196ºC era infinita, enquanto que à 79ºC ocorriam mudanças biológicas nas células espermáticas. Também o armazenamento com o dióxido de carbono sólido não era conveniente, pois necessitava de recargas mais freqüentes (FOOTE, 2002).

18 3 O armazenamento do sêmen congelado em dióxido de carbono sólido (gelo seco) ou nitrogênio líquido foi um problema ao se utilizar ampolas de vidro que, freqüentemente, quebravam durante o congelamento e descongelamento (FOOTE, 2002). CASSOU (1964) modificou o sistema desenvolvido por SORENSEN (1940), através da utilização de um método de selar as palhetas de plástico e um dispositivo para a deposição do sêmen no útero (PICKETE e BERNDTSON, 1974). Foram utilizadas inicialmente palhetas com capacidade de 0,5 ml para envasar o sêmen a ser congelado, porém, mais recentemente, as palhetas de 0,25 ml têm sido mais utilizadas devido estas requererem menor espaço para armazenamento (FOOTE, 2002). No início da utilização do nitrogênio líquido para armazenamento, foram encontrados problemas na conservação por um tempo mais prolongado do mesmo, pois o isolamento dos botijões era ineficiente e também havia necessidade de recarga freqüente para se manter a temperatura de 196ºC. Alguns anos mais tarde, J. Rockfeller Prentice financiou o desenvolvimento de botijões que ofereciam melhor isolamento térmico e, com isso, houve um crescimento na indústria de criopreservação (FOOTE, 2002). Com os avanços na criopreservação de sêmen de touros, observou-se um crescente interesse pela criopreservação de sêmen eqüino. Vários métodos foram desenvolvidos para o congelamento de sêmen eqüino, porém a inseminação artificial nesta espécie vem sendo, ainda hoje, realizada utilizando sêmen resfriado diluído e inseminado num período máximo de 48 horas após coleta. O sêmen congelado é menos fértil do que o sêmen fresco (SHANNON e VISHWANATH, 1995). Muitos aditivos na preparação dos diluentes para o congelamento de células espermáticas não obtiveram resultados satisfatórios na melhoria da fertilidade do sêmen congelado (FOOTE, 1999). Entretanto, alguns pesquisadores afirmam que a adição de peptídeo melhora a fertilidade do sêmen congelado e descongelado (AMANN et al., 1999). FAGUNDES (2003) observou que a adição de proteínas concentradas, com massa molecular superior a 10 kda, do plasma seminal no diluente melhoraria as características espermáticas no congelamento e descongelamento, enquanto que a troca do plasma seminal de garanhões bons congeladores pelo plasma seminal de maus congeladores resultou na melhora da motilidade pós-descongelamento (VIANNA, 2001).

19 4 O sêmen criopreservado de mamífero é reconhecidamente caracterizado por ter uma fertilidade menor em comparação com o sêmen fresco. A redução da fertilidade transparece tanto em uma menor viabilidade pós-descongelamento como nas disfunções sub-letais da porção da sub-população sobrevivente. As razões da perda da fertilidade são várias, dentre elas podemos destacar os fatores que afetam a porção das células sobreviventes, como: susceptibilidade ao choque-térmico, taxa de resfriamento, composição do diluente e estresse osmótico, e os fatores que influenciam no estado funcional, que são: estabilidade de membrana, danos oxidativos, integridade dos receptores de membrana e estrutura nuclear. A criopreservação prolonga a viabilidade do espermatozóide para a fertilização, entretanto, o potencial fertilizante de sêmen descongelado é comprometido pelas alterações estruturais e fisiológicas das células espermáticas. Estas alterações estão presentes na população móvel, diminuindo a viabilidade espermática, a capacidade de interação com o trato da fêmea e a capacidade fertilizante. A etiologia dessas alterações pode ser representada por uma combinação de fatores como a fragilidade hereditária das células espermáticas em resistir aos processos de criopreservação e diluição do sêmen. Quando se trata do uso de sêmen congelado eqüino, verifica-se que esse mostra-se, ainda, pouco eficiente e difundido devido a algumas associações de produtores de cavalos não permitir em a utilização desta biotécnica, além do uso desta biotécnica estar associada a baixa fertilidade e aos resultados inconsistentes. Existem no mercado várias máquinas para congelamento de sêmen que visam uma padronização da técnica do congelamento e, assim, permitir uma precisa taxa de resfriamento das amostras. Quanto ao descongelamento não foi observado nenhuma máquina no mercado, somente foram verificados dois trabalhos, bovinos e caninos, sendo esta desenvolvida por mim e meu professor orientador, em nosso laboratório cuja utilização melhorou as características de motilidade e integridade de membrana. Atualmente, persistem os problemas de resultados inconsistentes quando se utiliza sêmen congelado de eqüino e, conseqüentemente, ainda não foi possível padronizar a metodologia de congelamento do sêmen desta espécie. Então, torna-se necessário, ainda hoje, uma otimização da criopreservação do sêmen eqüino e conseqüente padronização desta metodologia, pois facilitaria o

20 5 armazenamento e a propagação da genética de cavalos de grande valor através da reprodução assistida. Pretende-se, neste trabalho de pesquisa, propor um novo protocolo de congelamento e descongelamento de sêmen eqüino utilizando um sistema automatizado eletroeletrônico para o congelamento e outro para o descongelamento.

21 6 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Sêmen Células espermáticas Os espermatozóides são células haplóides carentes de citoplasma e outras organelas, exceto o núcleo, acrossoma e uma série de mitocôndrias num arranjo helicoidal localizado na região anterior do flagelo (EDDY, E.M. e O BRIEN, D.A. citado por MEDEIROS et al., 2002). As células espermáticas de eqüino, como a de todas as espécies de mamíferos, são altamente especializadas e são constituídas por cabeça, peça intermediária, principal e terminal, que tem como único objetivo a fertilização do óvulo (HAFEZ,1995; SAMPER, 2000). Portanto, na tentativa de manter os espermatozóides estruturalmente íntegros para que possam exercer sua função na fisiologia reprodutiva, deve-se proporcionar a eles, durante seu processamento, um ambiente o mais favorável possível, já que nos mamíferos, os espermatozóides ejaculados ou inseminados, pósprocessamento, necessitam de ambiente favorável no trato genital da fêmea espécie-específica por um determinado tempo, o que é necessário para preparar o espermatozóide para a fertilização do óvulo. Este tempo é controlado por hormônios da fêmea para evitar a inviabilidade do gameta. O deslocamento do espermatozóide nos sistemas genital tanto no masculino quanto no feminino induz mudanças

22 7 bioquímicas sucessivas necessárias para o espermatozóide desenvolver a sua capacidade de fertilizar o óvulo (AUSTIN, C. R., 1951 e CHANG, M. C., 1951 citados por MEDEIROS et al., 2002) Membrana Plasmática do espermatozóide O conhecimento da membrana plasmática nos espermatozóides é o ponto inicial para o êxito nos processos de manipulação do sêmen, principalmente nas espécies como a eqüina e a suína, as quais possuem baixa resistência à manipulação extra-corpórea. Toda manipulação do sêmen fresco ou congelado produz alterações nas células espermáticas (VALLE e SILVA FILHO, 2002). A membrana plasmática é o componente mais externo da célula espermática e está envolvendo toda a superfície do espermatozóide exceto após a reação acrossômica, envelhecimento e morte (AMANN e GRAHAM, 1992). SAMPER (2000) descreve que as células espermáticas são recobertas pela membrana plasmática, e esta é constituída de uma bicamada fosfolipídica incorporada por colesterol, complexos carboidratados e proteínas. O colesterol, provavelmente, serve como substância estabilizadora de membrana. A bicamada lipídica é composta por fosfolipídeos com sua cadeia de ácido graxo hidrofóbico direcionado internamente e sua cadeia hidrofílica com cabeça polar orientada externamente (AMANN e GRAHAM, 1992; STRYER, 1988) (figura 1). Algumas das proteínas estão entremeadas dentro da camada lipídica variando o seu tamanho, outras estão localizadas no exterior da camada lipídica ou estão associadas ao glicocálice. As proteínas presentes na membrana plasmáticas são classificadas como proteína integral (trans-membrana), essenciais na estrutura da membrana, e periféricas, associadas a membrana, mas facilmente removidas. Certas proteínas trans-membrana têm sido relatadas por se localizarem na bicamada lipídica como canais de íons, poros, receptores e componentes transdutores de sinal, valendo ressaltar que foram encontradas proteínas entre a bicamada. As proteínas que compõem a membrana espermática representam cerca de 50% do peso molecular total da membrana (AMANN e GRAHAM, 1992; SAMPER, 2000). Muitas das proteínas da superfície externa da membrana plasmática contêm cadeias de carboidratos na parte lateral, as quais tendem ter carga negativa e atrair

23 8 outras proteínas do meio extracelular ao redor do espermatozóide (AMANN e GRAHAM, 1992). Figura 1: Representação da membrana plasmática, mostrando seus componentes, como proteínas trans-membrana e periféricas, colesterol e carboidratos ligados às proteínas (AMANN e GRAHAM, 1992). Nos espermatozóides de mamíferos a composição e a distribuição dos fosfolipídios diferem dentro de certos domínios e regiões da membrana plasmática. Normalmente, os fosfolipídios diferentes são aleatoriamente arranjados na membrana e são livres para se movimentar lateralmente no folheto da bicamada, isto se dá porque a membrana está fluida a temperatura corporal. A relação colesterol/fosfolipídio bem como a natureza dos fosfolipídios determinam a fluidez da membrana, portanto, quanto maior for a presença de colesterol menor será a fluidez (AMANN e GRAHAM, 1992). O colesterol auxilia no arranjo aleatório dos fosfolipídios da membrana. Uma adequada quantidade de colesterol e uma distribuição aleatória das proteínas transmembranas exercem uma configuração sobre fosfolipídios, fazendo com que a bicamada normal seja mantida. Em certas condições, os lipídeos podem mudar para uma forma cristalina (fase de transição), ocorrendo a agregação protéica que leva a uma desestabilização da membrana, o que pode causar danos irreversíveis, sendo o resfriamento um fator que induz a essa mudança (AMANN e GRAHAM, 1992).

24 Plasma seminal A fonte dos constituintes do plasma seminal varia com as espécies, assim como o número e tamanho dos órgãos acessórios (HAFEZ, 1995). O plasma seminal do eqüino é constituído por uma coleção de fluidos proveniente do epidídimo, ampola, próstata, vesícula seminal e glândula bulbouretral, onde os espermatozóides são suspensos na hora da ejaculação (SAMPER, 2000). No que tange ao assunto plasma seminal existem muitas contradições em relação ao utilizá-lo ou não para resfriamento e congelamento das células espermáticas. Segundo NISHIKAWA (1975), a remoção do plasma seminal antes do congelamento ajuda a manter a motilidade dos espermatozóides após o descongelamento. Uma das razões do plasma seminal ser prejudicial seria a alta concentração de cloreto de sódio. Alguns pesquisadores relatam que a remoção do plasma seminal do sêmen eqüino antes do resfriamento e armazenamento a 5ºC é benéfico (DRAWSON et al., 1999; JASKO et al., 1991; PRUITT et al., 1993 citado por CROCKETT et al e VIDAMENT et al., 2001). Outros pesquisadores como FAGUNDES (2003), observou que a adição de proteínas concentradas do plasma seminal, com massa molecular superior a 10 kda, no diluente, melhoraria características espermáticas no congelamento e descongelamento, enquanto que a troca do plasma seminal de garanhões bons congeladores pelo plasma seminal de maus congeladores resultou na melhora da motilidade pós-descongelamento (VIANNA, 2001). NUNES et al. (1982) observaram efeito positivo da presença do plasma seminal na sobrevivência dos espermatozóides submetidos ao congelamento. Alguns componentes foram descritos como deletérios aos espermatozóides, sendo identificados na secreção da glândula bulbouretral, de caprinos, um componente apresentando este efeito nos espermatozóides diluídos em meio contendo gema de ovo (RITAR e SALAMON, 1982 citado por AZEREDO et al., 2001) ou leite (CORTEEL, 1974 citado por AZEREDO et al., 2001). Este componente foi identificado como uma glicoproteina de 60kDa (PELLICER et al., 1997). AL-SOMAI et al. (1994) relataram que os componentes protéicos de baixa massa molecular causam danos aos espermatozóides e a remoção desses componentes do plasma seminal é benéfica à sobrevivência dos espermatozóides.

25 Efeitos da temperatura Taxa de resfriamento WOELDERS et al. (2005) relataram que as células podem apresentar danos pela diminuição da temperatura por si só (danos do resfriamento), pelo resfriamento brusco (danos do choque térmico) ou por ambos. Os danos do resfriamento podem ser reduzidos pela inclusão de gema de ovo no diluente quando abaixo de 15ºC e o choque térmico pelo lento e gradual resfriamento (aproximadamente -1ºC/min.) de 15 a 5ºC. A determinação da taxa de resfriamento ideal para os espermatozóides eqüino é um dos assuntos mais importantes para a conservação da motilidade e da fertilidade. Este é um assunto complexo que envolve a individualidade do garanhão, constituição da membrana do espermatozóide, natureza do diluente e temperatura final de armazenamento (SILVA FILHO, J. M., 1994 citado por SNOECK e HENRY, 2002a). WATSON (1995) relatou que os espermatozóides sofrem o primeiro estresse térmico no resfriamento do sêmen entre 19º a 5ºC, pois nesta faixa de temperatura a membrana plasmática passa por uma fase de transição, do estado líquido cristalino para o gel, podendo ocorrer perda de movimentos progressivos, alterações na membrana plasmática e acrossomal. LOOMIS (1992) relatou que o êxito do resfriamento do sêmen eqüino depende da diluição adequada, taxas relativamente lentas de resfriamento e manutenção em temperaturas específicas. Esses fatores associados irão reduzir o metabolismo espermático e minimizar as lesões de membrana, evitando a indução prematura da capacitação e/ou reação acrossômica. MOORE et al. (2006) relataram que a taxa de resfriamento a qual as células são submetidas é que vai determinar a extensão da desidratação. Observaram, também, que não houve diferença na motilidade e viabilidade espermática quando os espermatozóides eram submetidos a taxas de resfriamento de -5 a -45 º C/min, sendo esses dados similares ao encontrado por DEVIREDDY et al. (2002) que determinaram que os espermatozóides de garanhões sobrevivem a taxas de resfriamento de -20 a C/min. Esses resultados vêm confirmar que existe uma

26 11 ampla taxa de resfriamento que é considerada como ótima para o congelamento de sêmen eqüino. MOORE et al. (2006) observaram uma diferença na viabilidade espermática, sendo que a taxa de resfriamento de C/min apresentou maior viabilidade que a de C/min. KAYSER et al. (1992) concluíram que o sêmen eqüino pode ser resfriado rapidamente de 37º e 20ºC, mas entre 20º e 5ºC deve ser resfriado de forma a se obter uma curva em que a temperatura seja reduzida 0,1ºC/min. VIDAMENT et al. (2000), utilizando sêmen eqüino, verificaram que a taxa moderada de resfriamento (0,55ºC/min de 37 a 4ºC) obteve maior motilidade comparado com a taxa lenta (0,13ºC/min). Há tempos se conhece que o resfriamento muito rápido de sêmen de ungulados entre 30º e 0ºC induz a um estresse letal em algumas células, proporcionado pela taxa de resfriamento, intervalo e variação de temperatura (WATSON, 1981 citado por WATSON, 2000). Tratando do processo de congelamento do sêmen eqüino, AMANN e PICKETT (1987) afirmam que diversos problemas não observados à temperatura ambiente (em torno de 22 C) são introduzidos com a queda da temperatura. São umas séries de alterações não completamente entendidas e parcialmente irreversíveis ocorridas durante o resfriamento de 20 a 1 C. Este fenômeno é conhecido como choque-térmico ou estresse-térmico (AMANN E PICKETT, 1987; WATSON, 1981 citado por WATSON, 2000). O fenômeno é identificado por um grande número de espermatozóides com movimento circular, perda da motilidade, queda na produção de energia, aumento na permeabilidade da membrana e perda de íons e moléculas intracelulares. A extensão dos danos é dependente da taxa de resfriamento. Ao contrário, o reaquecimento é raramente prejudicial, ou menos danoso à célula espermática (WATSON, 2000). Isto vem a confrontar com o descrito por HOLT e NORTH (1994) que observaram não haver danos de integridade de membrana das células espermáticas de ovino através dos processos de resfriamento e congelamento na ausência de crioprotetores, onde esses danos não foram observados imediatamente após o descongelamento, mas durante o reaquecimento após o descongelamento na faixa de temperatura entre 2 a 30 0 C. No resfriamento quando a temperatura da fase de transição de um lipídeo é alcançada este lipídeo muda de fase, somente esse lipídeo, e se agrega em

27 12 microdomínios de gel lipídico em uma membrana ainda líquida, fazendo com que formem buracos permeáveis a íons entre os microdomínios e o restante da membrana (figura 2) e, assim, podendo ocasionar ruptura ou a fusão da membrana (AMANN e GRAHAM, 1992). Figura 2: Representação esquemática do polimorfismo dos lipídeos na membrana plasmática. A) Configuração planar da membrana dos fosfolipídeos com sua cadeia de ácido graxo hidrofóbico direcionado internamente e sua cadeia hidrofílica com cabeça polar orientada externamente. B) Forma hexagonal-ii, onde a cadeia hidrofílica com cabeça polar está voltado para o centro e a cadeia de ácido graxo hidrofóbico estão orientadas externamente (AMANN e GRAHAM, 1992). DEVIREDDY et al. (2002) verificaram que a taxa de resfriamento considerada ótima era aproximadamente 29 0 C/min, isto na ausência de crioprotetor; já na presença observaram que a taxa de 60 0 C/min era a melhor Formação e dissolução dos cristais de gelo As lesões induzidas pela formação dos cristais de gelo são, principalmente, associados às mudanças da pressão osmótica na fração não congelada (WATSON e DUNCAN,1988). Quando a solução é resfriada abaixo do ponto de congelamento, cristais de gelo são formados e a água de fora das células se cristaliza (figura 3). Os solutos são dissolvidos na porção da água líquida restante, fazendo com que a pressão osmótica da solução aumente. A relação em que a água cristaliza depende da temperatura, ou seja, quanto mais baixa a temperatura, menor será a fração não congelada e, assim, maior será a pressão osmótica da solução (WATSON, 2000).

28 13 Figura 3: Movimentação da água do interior do espermatozóide para dentro dos canais de água descongelada, com a resultante redução do volume e um aumento da concentração de soluto na célula. Conforme o esquema, a maior parte da água extracelular já esta sob forma de gelo (MAZUR, 1984). As células espermáticas são geralmente congeladas numa taxa relativamente rápida num intervalo que varia de -15 a -60ºC/min., que foi empiricamente determinado como apresentando as melhores taxas de sobrevivência. Obviamente se fosse conhecida a permeabilidade da célula à água e sua energia de ativação, seria possível predizer a taxa de resfriamento máxima compatível com o equilíbrio osmótico e então determinar ótimos protocolos de criopreservação. Tais observações foram consideradas importantes para outros tipos celulares (MAZUR, 1984). Alguns pesquisadores mediram a permeabilidade da água das membranas de espermatozóide de diferentes espécies. Com exceção do coelho (CURRY et al., 1995a), a maioria das espécies apresentou uma permeabilidade superior em comparação com a permeabilidade de outros tipos celulares (GILMORE et al., 1996; NOILES et al., 1997). A modulação dos canais de glicose das membranas de espermatozóide afeta a permeabilidade da água (CURRY et al., 1995b). A proporção de células que sobrevivem aos protocolos de criopreservação é determinada pela sensibilidade ao estresse osmótico durante a adição e remoção do crioprotetor e durante o resfriamento e reaquecimento (WATSON, 2000).

29 Processos da criopreservação Os processos da criopreservação estão fundamentados nas características físicas celulares a fim de manter a viabilidade e limitar os danos de membrana que podem ocorrer durante a exposição das células espermáticas a condições não fisiológicas como a temperatura sub-zero, formação dos cristais de gelo e altas concentrações do soluto (LUVONI, 2006). Desde 1990, HARMMERSTEDT et al. e WATSON, após suas revisões sobre os processos da criopreservação do sêmen, enfatizaram que o progresso na melhoria da viabilidade espermática não seria atingido simplesmente pela modificação dos diluentes de criopreservação. Relatam que o mais fundamental entendimento dos processos biofísico e bioquímico que acompanham o congelamento e descongelamento do sêmen é o pré-requisito essencial para desenvolver, com sucesso, protocolos de criopreservação (HOLT e NORTH, 1994). MAZUR et al. (1972, citado por DEVIREDDY et al., 2002) discorreram sobre a taxa de resfriamento dizendo que a taxa que otimiza as respostas de qualquer sistema celular pode ser definida como a mais rápida taxa de resfriamento de um dado meio que impede os danos pela formação dos cristais de gelo intracelular Congelamento O grande prejuízo que o congelamento acarreta à célula é a ruptura da membrana, principalmente devido às alterações térmicas, mecânicas, químicas e ao estresse osmótico. Estes danos são atribuídos à desidratação celular e formação intracelular de cristais de gelo (PARKS E GRAHAM, 1992). Segundo DAVIES MOREL (1999), a taxa de resfriamento ou taxa de congelamento do sêmen depende do método de processamento e de armazenamento. JASKO (1994) estabeleceu em seu experimento que o sêmen eqüino deve ser submetido previamente a uma curva de resfriamento com duração de duas a três horas, envasado e colocado no vapor de nitrogênio líquido para se dar início ao congelamento. O grande problema da criopreservação não está na habilidade do espermatozóide em manter-se viável à temperatura de 196ºC, mas sim nos danos

30 15 que a célula sofre durante o resfriamento e descongelamento, numa temperatura intermediária de 15ºC e 60ºC (AMANN e PICKETT, 1987; PARKS e GRAHAM, 1992). Sabe-se que o resfriamento rápido na faixa entre 20 C e 5ºC leva o sêmen eqüino ao choque térmico, onde nessa faixa crítica de temperatura o sêmen deve ser resfriado lentamente (MCKINNON, 1996 citado por SNOECK e HENRY, 2002b) (figura 4). O resfriamento moderadamente rápido (-25ºC a -40ºC/min) provoca desidratação celular, formando cristais de gelo intracelular. Se o congelamento é lento, causa danos à célula devido à alta concentração de soluto intracelular durante o processo. Quando o espermatozóide é resfriado muito rápido (-60ºC/min) pode ocorrer o fenômeno da recristalização após o descongelamento, com a formação de grandes cristais de gelo que provocam danos físicos às células (GRAHAM, 1996). Figura 4: Representação esquemática de prováveis mudanças em espermatozóides de eqüino, e no diluente ao seu redor durante o congelamento e descongelamento. Efeito da velocidade de resfriamento e reaquecimento (setas verticais grandes e pequenas) e formação de cristais de gelo ou micro-cristais (estrelas grandes e pequenas) são mostrados na representação esquemática. Após o resfriamento inicial e formação de micro-cristais de gelo no meio extracelular a uma temperatura de cerca de -5 C, a velocidade de resfriamento afeta tanto a movimentação de água como a quantidade de formação intracelular de gelo. Danos podem ocorrer como resultado de velocidades inapropriadas de resfriamento e reaquecimento. Na velocidade de resfriamento ótima (seta do meio), a água move-se para fora do espermatozóide, murchando-o lentamente como conseqüência da desidratação. Durante o reaquecimento, a movimentação intensa de água e glicerol pode provocar danos pelo inchamento da célula. Se a velocidade de reaquecimento é sub-ótima pode ocorrer a recristalização de micro-cristais de gelo, danificando também a célula. No reaquecimento ótimo, a entrada de água rehidratando os espermatozóides equilibra a concentração de solutos e os micro-cristais internos

31 16 descongelam sem formarem grandes cristais de gelo, isto é, recristalização (MAZUR, 1984). MOORE et al. (2006) observaram uma diferença na viabilidade espermática, entre as taxas de resfriamento -10ºC/min e -50ºC/min, sendo que à -10ºC/min apresentou maior viabilidade. Observaram, também, que não houve diferença na motilidade e viabilidade espermática quando os espermatozóides eram submetidos a taxas de resfriamento de -5 a -45ºC/min, sendo esses dados similares ao encontrado por DEVIREDDY et al. (2002) que determinaram que os espermatozóides de garanhões sobrevivem a taxas de resfriamento de -20 a -100ºC/min. JANUSKAUSKAS et al. (1999) observaram, para sêmen de bovino, não haver diferença estatística entre a taxa de resfriamento lenta com a rápida, ressaltando que a taxa de resfriamento lenta não é mais benéfica do que a rápida quando analisado os parâmetros de viabilidade espermática após o descongelamento e fertilidade após a inseminação artificial. WATSON (1995) relata que o resfriamento e a criopreservação desestabilizam as membranas espermáticas e conseqüentemente induzem reação acrossômica prematura, diminuindo a vida útil do espermatozóide no trato reprodutivo feminino e a fertilidade na inseminação artificial. Alguns pesquisadores observaram que a taxa de resfriamento lenta, de - 0,5ºC/min de 5 à -20ºC, seguida de rápida taxa de resfriamento, -3ºC/min de -20 à - 196ºC, foi o que apresentou menor incidência de dano de acrossoma (CHAO e CHANG, 1962; ADVENA, 1990; HEITLAND et al.,1996, citado por DAVIS MOREL, 1999). Resumindo os eventos osmóticos que ocorrem durante o congelamento, pode-se salientar que no congelamento a fase de transição da água induz a diminuição no potencial de água extracelular, já que a água passa através da membrana plasmática. Isto induziria a uma mudança do fluxo da água e da desidratação celular. Os danos do resfriamento lento têm sido atribuídos ao aumento na concentração interna e externa do soluto (cloreto de sódio; DAW et al., 1973 citado por WOELDERS et al., 2005), ao pequeno tamanho da porção não congelada, ao estresse mecânico causado pela diminuição do volume celular (MAZUR et al., 1983 citado por WOELDERS et al., 2005) e a desestabilização das membranas e proteínas pelo baixo potencial de água (CARPENTER et al., 1988 citado por WOELDERS et al., 2005). A alta taxa de resfriamento a desidratação intracelular (pelo efluxo da água) não pode acompanhar os passos da desidratação

32 17 extracelular (pela fase de transição da água). Como conseqüência, as altas taxas de resfriamento resultam em maior nível de super-resfriamento intracelular, maior diferença na pressão osmótica trans-membrana e concentração de soluto e maior taxa de efluxo de água através da membrana. Os danos do resfriamento rápido parecem estar relacionados, particularmente, a formação de gelo intracelular (MAZUR et al., 1963; MAZUR et al., 1972; MAZUR et al., 1977; citado por WOELDERS et al., 2005). Outros pesquisadores têm atribuído o dano de membrana a alta diferença na pressão osmótica trans-membrana resultando numa alta taxa de fluxo de água trans-membrana. Alternativamente, danos do resfriamento rápido poderiam resultar do fato de que as células são expostas a grandes mudanças repentinas de tamanho, forma e ultra-estrutura devido ao rápido efluxo de água e encolhimento das células (WOELDERS et al., 1997 citado por WOELDERS et al., 2005). PAPA et al. (2003), observaram que não houve diferença estatística quando amostras de sêmen de eqüinos foram congeladas em diferentes alturas do nível de nitrogênio líquido (1, 3, 6 e 9cm) e, NÖTHLING e SHUTTLEWORTH (2005), também, não observaram diferença no congelamento à 3,5cm e 8cm do nível do nitrogênio líquido, tendo uma leve tendência de maior motilidade para o congelamento à 8cm e menor dano de integridade de acrossoma. Em atual época, existe comercialmente uma vasta quantidade de máquinas para congelamento de sêmen. A princípio estas poderiam ajudar na manipulação de amostras com grande volume, principalmente pela sua padronização de congelamento e permitir o preciso resfriamento das amostras para a taxa desejada. As principais máquinas de congelamento de sêmen encontradas no mercado são: CryoLogic Freeze Control CL3000, Planer Products Kryo Save Compact KS1.7, Sanyo 152ºC (MDF-1155 ATN), Planer Kryo 10 Series III (desenvolvida por Watson) e TK3000 (TK Tecnologia em Congelação Ltda). O que se faz hoje em dia, comercialmente, de forma menos onerosa, é o congelamento na caixa de isopor colocando as palhetas à 4cm sobre o nível de nitrogênio por 10 minutos e, depois estas são imersas no nitrogênio para congelar, valendo salientar que a taxa de resfriamento de 20 à 5ºC é de 0,5ºC/min. Durante o congelamento podemos observar nas curvas de resfriamento que existe um pico, ou seja, um aumento na temperatura devido ao aquecimento provocado pela liberação de energia durante a fusão dos cristais de gelo e,

33 18 conseqüentemente, aumentando a temperatura da amostra submetida ao congelamento (HOLT, 2000; THURSTON et al., 2003; CHAVEIRO et al., 2006). Muitos pesquisadores chamam este aumento na curva de resfriamento de platô de congelamento, sendo este considerado o ponto mais prejudicial na viabilidade espermática durante o processamento. HOLT (2000) relata que este platô pode permanecer por 2 a 3 minutos antes do resfriamento recomeçar, já CHAVEIRO et al. (2006) observaram um platô com duração média de 30 segundos. SIEME et al. (2001) ressaltam que para prevenir a ocorrência do platô no congelamento do sêmen deve-se induzir o seeding nas amostras a serem congeladas. Também observaram que ao reduzir o platô havia uma melhora na viabilidade espermática do sêmen de garanhões. THURSTON et al. (2003) verificaram que ao fazer o seeding nas amostras de sêmen de suínos, a dissipação do calor foi menor, minimizando, assim, a flutuação da temperatura dentro da amostra na formação de gelo e melhorando a motilidade do sêmen descongelado quando comparado com as outras taxas de resfriamento. WOELDERS et al. (2005) relataram que o super-resfriamento causa uma mudança brusca da temperatura e da osmolaridade, causando danos no congelamento. Isto pode ser evitado através do seeding, usando um volume e geometria da amostra que permite rápida propagação do frio através desta. Relatam, também, que a curva após a formação dos cristais de gelo é de extrema importância no congelamento. HAMMADEH et al. (2001a) observaram que a utilização da máquina de congelamento (Planer Kryo 10 Series III) para sêmen humano apresentava menor dano as células espermáticas quando comparado com o congelamento convencional (20cm acima do nível do nitrogênio líquido). THURSTON et al. (2003) realizaram um experimento, com sêmen de suíno, testando três máquinas de congelamentos (CryoLogic Freeze Control CL3000, Planer Products Kryo Save Compact KS1.7 e Planer Kryo 10 Series III, desenvolvida por Watson) onde observaram reduzida viabilidade espermática na curva de resfriamento à -6ºC/min (14,2±2,8% - CryoLogic Freeze Control CL3000) quando comparada à -40ºC/min (KS1.7 e Planer Kryo 10 Series III, 18,4±3,2% e 25,7±3,7%, respectivamente).

34 19 ÁLAMO et al. (2005) testaram a viabilidade de um ultra-freezer (Sanyo ) para congelamento e armazenamento de sêmen de cães como alternativa do uso do nitrogênio líquido e, observaram que este poderia ser utilizado, pois as características eram semelhantes com as observadas no congelamento com nitrogênio líquido. A taxa de resfriamento foi lenta (-5ºC/min) de 5 a -10ºC, rápida (- 30ºC/min) de -10 a -100ºC e depois -100ºC a -130ºC a taxa foi de -10ºC/min. ARRUDA et al. (2005) observaram que não houve diferença significativa quando comparou o congelamento de sêmen de bovino à 3cm do nível do nitrogênio líquido (-19ºC/min) com o congelamento no aparelho programável (-15,5ºC/min). ROTA et al. (2005) verificaram que a taxa de resfriamento lento (0,5ºC/min de 5 a -10ºC, 8ºC/min de -10 a -60ºC e imersão no nitrogênio líquido), utilizando um sistema de congelamento programável, foi melhor quanto a motilidade e integridade de membrana quando comparado com a taxa de resfriamento convencional, ou seja, à 4cm do nível de nitrogênio (taxa de resfriamento rápido). DOUGLAS-HAMILTON et al. (1984, citado por FÜRST et al., 2003) comparando as taxas de resfriamento rápida (maiores que -1ºC/min), média (entre - 1ºC/min e -0,33ºC/min) e lenta (menores que -0,33ºC/min) concluíram que as taxas de resfriamento lenta e rápida causam maiores danos à célula espermática que a taxa média. SIEME et al. (2001) utilizaram um sistema multi-gradiente direcional, denominado IMT (ARAV, 1999 citado por SIEME et al. 2001), para congelamento de sêmen de garanhões, onde a taxa de resfriamento e formação dos cristais de gelo eram precisamente controlados. Estes pesquisadores observaram que através deste sistema de congelamento era possível evitar o aumento da temperatura no momento em que começava a formação dos cristais de gelo. HAMMADEH et al. (2001b) verificaram que a utilização de um sistema de congelamento computadorizado com diminuição gradual da temperatura mostrou-se ser melhor que o congelamento convencional, principalmente para amostras de sêmen de doadores considerados subnormais (inférteis), sendo recomendado este tipo de congelamento para espermatozóides de humanos, especialmente para aqueles que apresentam baixa qualidade seminal com o objetivo de evitar danos nas células espermáticas. DAVIS MOREL (1999) em sua revisão relata que existe uma curva apropriada para congelamento de sêmen eqüino utilizando um sistema programado de