Annapaula Aguiar de Oliveira Faculdade de Odontologia Centro Ciências da Vida

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1 AVALIAÇÃO DE CAPACIDADE DE REDUÇÃO MICROBIANA DO FOTOSSENSIBILIZANTE AZUL DE TOLUIDINA IRRADIADO COM LASER DE BAIXA INTENSIDADE EM LESÕES DE CÁRIE DENTI- NÁRIAS Annapaula Aguiar de Oliveira Faculdade de Odontologia Centro Ciências da Vida Sérgio Luiz Pinheiro Dentística Minimamente Invasiva Centro Ciências da Vida Resumo: A odontopediatria preconiza a manutenção da dentina afetada pela doença cárie que apresenta potencial de reorganização. Esse substrato apresenta contaminação microbiana que pode acarretar injúrias pulpares e progressão da lesão. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade de redução microbiana da terapia fotodinâmica na dentina afetada. Foram selecionadas 20 lesões de cárie na Clínica da PUC-Campinas. Após isolamento absoluto e remoção da lesão de cárie em esmalte e da dentina infectada, foram realizadas as coletas da seguinte maneira: G1: dentina afetada (DA); G2: DA + azul de toluidina (AT); G3: DA + laser (L); G4: DA antes da terapia fotodinâmica (TF); G5: DA após TF. A terapia fotodinâmica foi realizada com aplicação ativa do fotossensibilizante AT 0.005% por 3 minutos com microbrush e irradiação com laser de baixa intensidade (4 J/cm2 de energia, comprimento de onda de 660 nm e potência de 100 mw). Todas as amostras foram homogeneizadas, diluídas até 10-5 e semeadas em placas de Agar sangue para a contagem do total de bactérias viáveis. As comparações da redução microbiana antes e após a terapia fotodinâmica foram feitas através do teste de Wilcoxon. Houve redução de 59.02% do total de bactérias viáveis da lesão de cárie dentinária após a realização da terapia fotodinâmica (p=0.0051). O fotossensibilizante sozinho, assim como a irradiação da dentina afetada somente com laser não acarretou diminuição significativa do total de bactérias viáveis. Palavras-chave: Terapia a Laser de Baixa Intensidade, Cárie Dentária, Agentes Fotossensibilizantes. Área do Conhecimento: Grande Área do Conhecimento: Ciências da Saúde Sub-Área do Conhecimento: Odontologia. 1. INTRODUÇÃO Corantes azuis, principalmente o azul de toluidina (TBO) e azul de metileno (MB) associado ao laser com comprimento de onda de 632,8 nm a- presentam resultados significativos na redução microbiana de diversas culturas de bactérias e fungos in vivo. As reações químicas acontecem entre fotossensibilizador, luz e substrato. Mantendo-se a mesma dose (densidade de energia ou fluência), porém variando-se a intensidade ou o tempo de exposição, podem-se obter diferentes resultados e os efeitos também podem ser dependentes da concentração do fotossensibilizador e do tempo da pré - irradiação, ou seja, o tempo que o corante fica em contato com o microrganismo sem exposição à luz. A eficiência desta terapia dependente de três fatores: biológico (seletividade e retenção do fotossensibilizador); físico (intensidade da radiação eletromagnética que chega à região de tratamento; propriedades ópticas do tecido; eficiência da absorção dos fótons ativadores; eficiência da transferência de energia de excitação da molécula fotossensibilizadora) e químico (efeito oxidante na molécula). O corante azul de orto-toluidina 75 µg/ml associado ao laser de diodo de baixa intensidade com 665 nm de comprimento de onda e energia de fluência de 30J/cm² acarretou em redução microbiana de 83,2% das bactérias Enterococcus Faecalis dos condutos radiculares de dentes permanentes. O mesmo laser, porém com energia de 222 J/cm², associado ao corante azul de metileno 25 µg/ml foi capaz de eliminar 97% das bactérias no interior dos condutos radiculares de dentes permanentes. 84,9% de redução de Streptococcus Mitis e 98,9% de redução de Streptococcus Sanguis foram obtidas das fissuras de dentes permanentes foram obtidos com a irradiação com

2 laser de baixa intensidade de AsGaAl com densidade de energia de 6 J/cm² associado a um corante de orto toluidina 75 µg/ml. O corante azul de toluidina 200 µl/l associado ao laser de diodo de baixa intensidade com 663 nm de comprimento de onda e 4.8 J/cm² de densidade de energia acarretou em redução superior a 99% de Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Prevotella intermédia e Streptococcus intermedius nos canais radiculares de dentes permanentes. Pinheiro et al. [1] avaliaram a terapia fotodinâmica em dentes decíduos com polpa necrosada através da quantificação do total de bactérias viáveis antes, após instrumentação e após a utilização da terapia fotodinâmica e observaram que a instrumentação acarretou em redução de 82.59% do total de bactérias viáveis e após a terapia fotodinâmica a diminuição microbiana foi de 98.37% (p=0,0126). Pinheiro et al. [2] avaliaram a capacidade de redução microbiana da terapia fotodinâmica em bolsas periodontais e observaram redução de 81.24% do total de bactérias viáveis após a raspagem e 95.90% depois da terapia fotodinâmica (p<0.01). O objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade de redução microbiana da terapia fotodinâmica no tratamento das lesões de cárie utilizando como fotossensibilizante o azul de toluidina e como fonte de luz o laser. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Procedimentos metodológicos Considerações Éticas: este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Pontíficia Universidade Católica de Campinas, Campinas - São Paulo - Brasil (Protocolo 783/09). 2.2 Local de realização do estudo Os pacientes foram selecionados na Clínica O- dontológica da Pontifícia Universidade Católica de Campinas (PUC Campinas). Foi realizado exame clínico para observar a existência ou não de lesões de cárie dentinárias. Os pacientes que apresentavam as lesões foram radiografados com filme adulto ou infantil (Kodak Ltda, São Paulo, Brasil) pela técnica da bissetriz ou do paralelismo (General Eletronic Company, Milwaukel, EUA). O tempo de exposição foi de 0.8 segundos, processamento manual médio de revelação de 30 segundos e fixação por no mínimo 60 segundos. As radiografias foram secadas e armazenadas junto à documentação do paciente. Os pacientes não incluídos foram encaminhados para o tratamento odontológico na Faculdade de Odontologia da PUC Campinas. 2.3 Tipo de estudo Estudo clínico, com a finalidade de avaliar a capacidade da redução microbiana da terapia fotodinâmica utilizando o fotossensibilizante azul de toluidina e o laser de baixa intensidade em lesões de cáries dentinárias. 2.4 Caracterização da amostra A amostra foi composta de 20 lesões de cárie em dentina de 18 pacientes com idade variando de 3 à 35 anos. 2.5 Critérios de inclusão Pacientes sem comprometimento sistêmico e que não faziam uso de medicamentos; Os dentes incluídos nesse estudo apresentavam lesões de cárie dentinárias ativas, sem envolvimento pulpar, caracterizadas pelo amolecimento dentinário, evidenciado pela penetração do explorador na lesão de cárie dentinária com perda fácil de fragmentos e tecidos desmineralizados [3]; Dentes com inflamação pulpar reversível ou transitória; Os pacientes selecionados não apresentavam dor espontânea ou estimulada pelo calor; Tecido gengival com características de normalidade com ausência de edema ou fístula; Radiograficamente, as áreas de furca e periapical apresentavam características de normalidade, ou seja, ausência de áreas radiolúcidas; Para participar dessa pesquisa, foram selecionados pacientes que concordaram com a realização desse trabalho através do Termo de Consentimento. Vale ressaltar que todos os procedimentos clínicos executados foram devidamente explicados e esclarecidos. 2.6 Critérios de exclusão Pacientes com comprometimento sistêmico e que faziam uso de medicamentos; Os dentes com envolvimento pulpar, caracterizados pela exposição da polpa pela lesão de cárie; Dentes com inflamação pulpar irreversível; Os pacientes com dor espontânea ou estimulada pelo calor;

3 Tecido gengival com características patológicas como a presença de edema ou fístula; Áreas de furca e periapical com áreas radiolúcidas; Pacientes que não concordaram com a realização desse trabalho e não assinaram o Termo de Consentimento. 2.7 Procedimentos clínicos A triagem dos pacientes previamente selecionados foi realizada em quatro dias. Os pacientes foram acomodados em cadeira odontológica, em ambiente iluminado com luz natural e artificial. Foi feita profilaxia utilizando taça de borracha e/ou escova de Robinson (Microdont, Socorro, SP, Brasil) com pasta profilática (Herjos - Vigodent, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Em seguida, foi realizado o exame clínico com espelho, sonda exploradora e pinça clínica. O pesquisador estava paramentado com jaleco, touca, máscara, luvas descartáveis e óculos de proteção. As anotações foram feitas pelo próprio pesquisador mediante o uso de sobreluvas. Os pacientes que apresentavam lesão de cárie dentinária foram submetidos a radiografias periapicais para verificar a inclusão ou não nesse trabalho de acordo com os critérios de inclusão. Posteriormente, os pacientes selecionados foram agendados para a realização dos procedimentos clínicos. O método utilizado para a esterilização de todo o instrumental foi o calor úmido, autoclave (Sercon, Mogi das Cruzes, SP, Brasil) por 07 minutos à uma temperatura de 134ºC e pressão de 2,2 KgF/cm². Os instrumentais necessários para cada atendimento foram colocados em embalagem de papel grau cirúrgico e filme laminado poliéster/polipropileno (Zermatt Ltda., São Paulo, SP, Brasil). Os procedimentos clínicos realizados foram: Bochecho com 25 ml de digluconato de clorexidina 0,12% por 60 segundos (Ao Farmacêutico, Campinas, SP, Brasil); Anestesia tópica com Benzotop por 2 minutos (DFL, Rio de Janeiro, RJ, Brasil); Anestesia lidocaína com vasoconstritor adrenalina (DFL.,Rio de Janeiro, RJ, Brasil); Isolamento absoluto do campo operatório com lençol de borracha (Madeitex Ltda., São José dos Campos, São Paulo, Brasil); Remoção da lesão de cárie no esmalte até a junção amelodentinária com pontas diamantadas de tamanho compatível com a extensão da lesão (KG Sorensen, A- gerskov, Denmark) em alta rotação; Lavagem do dente com soro fisiológico; Coleta da dentina afetada utilizando micropunch (Ritcher, São Paulo, Brasil) com aproximadamente 1 mm de diâmetro e 1 mm de altura; Os grupos avaliados foram: Grupo 1: lesão de cárie; Grupo 2: lesão de cárie + fotossensibilizante; Grupo 3: lesão de cárie + laser; Grupo 5: coletas realizadas antes e após a realização da terapia fotodinâmica; Nos grupos 2 e 4, aplicação ativa do fotossensibilizante azul de toluidina 0,005% mg/500ml (Fórmula & Ação Laboratório Farmacêutico Ltda., São Paulo, Brasil) por 3 minutos utilizando microbrush (KG Sorensen, Agerskov, Denmark); Nos grupos 3 e 4, irradiação com laser de baixa intensidade (Flash Laser III, DMC, São Carlos, Brasil) com 4 J/cm 2 de energia, comprimento de onda de 660 nm e potência de 100 mw. O tempo de espera para irradiação (pré-irradiação) foi de 3 minutos e o laser foi aplicado com movimentos de varredura por 60 segundos com o objetivo de abranger todo o tecido cariado; Todas as amostras foram inseridas no BHI (Acumedia Manufacturers, Michigan, EUA). As amostras das lesões de cárie dentinárias apresentaram aproximadamente 1 mm de diâmetro e 1 mm de altura, com peso variando de 0,86 mg a 0,94 mg; Limpeza da cavidade com digluconaco de clorexidina 2,0% (Ao Farmacêutico, Campinas, SP, Brasil) durante 30 segundos; Condicionamento com ácido fosfórico 37% (Vigodent Ltda., Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil); Aplicação do sistema adesivo Primer & Bond (Dentsply Ltda., Petrópolis, Rio de Janeiro, Brasil) seguindo as instruções do fabricante; Restauração definitiva convencional. 2.8 Procedimentos microbiológicos determinação total de bactérias viáveis O material coletado na Clínica Odontológica que havia sido inserido no meio de transporte BHI foi

4 levado para o Laboratório de Microbiologia da Pontifícia Universidade Católica de Campinas. Foi feita a homogeneização durante 3 minutos em um agitador de tubos (Phoenix, Araraquara, SP, Brasil). Imediatamente após a homogeneização, foram feitas 5 diluições decimais em água peptonada (Hi- Media Laboratories, Mumbai, Índia) e a semeadura de 3 alíquotas de 25 µl na superfície do meio de cultura Ágar-Sangue (Biotério Boa Vista, Campinas, SP, Brasil) [4]. As placas foram incubadas em jarras de anaerobiose (Oxoid Ltda., Basingstoke, Hampshire, England) a 37 C durante 5 dias em atmosfera de 85% de N 2, 10% de CO 2 e 5% de H 2, obtida pelo uso de envelopes geradores de anaerobiose e indicadores de anaerobiose (Anaerogen TM, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England) [1, 2, 5, 6, 7, 8]. A contagem do total de bactérias viáveis foi feita através de uma lupa (Phoenix, Araraquara, SP, Brasil). 2.9 Análise estatística Os resultados foram analisados no programa Biostat 4.0. Os cálculos das médias aritméticas e desvios padrão foram feitos por meio da análise descritiva e as comparações antes e após a terapia fotodinâmica foram feitas através do teste estatístico de Wilcoxon. 3. RESULTADOS Houve redução de 59.02% do total de bactérias viáveis da lesão de cárie dentinária após a realização da terapia fotodinâmica (p=0.0051). O fotossensibilizante sozinho, assim como a irradiação da dentina afetada somente com laser não acarretou diminuição significativa do total de bactérias viáveis (Tabelas 1, 2 e 3). Tabela 1: Unidades formadoras de colônias antes e depois da realização da terapia fotodinâmica (PDT) (ufcx10 3 ). Porcentagem de redução microbiana PACIEN -TES ANTES DA PDT APÓS A PDT REDU- ÇÃO % % % % % % % % % % Média da porcentagem de redução: 59.02% Tabela 2: Médias aritméticas, desvios padrão e análise estatística de Wilcoxon antes e após a terapia fotodinâmica (log 10) Antes da PDT Após da PDT 4.46 (0.56) a 3.91 (0.55) b Letras diferentes: p= Tabela 3: Médias aritméticas, desvios padrão e análise estatística de Wilcoxon do total de bactérias da lesão de cárie, tratadas com o fotossensibilizante ou irradiadas (log 10) Lesão de cárie Tratamento da lesão somente com o fotossensibilizante Tratamento da lesão somente com o laser 1.91 (1.10) a 2.00 (0.83) a 1.93 (0.78) a Letras iguais: ausência de diferenças estatisticamente significantes, p= DISCUSSÃO A cárie e a doença periodontal são causadas pela placa bacteriana [9]. De acordo com Westergren e Krasse [4], Burns, Wilson, Pearson [10] e Featherstone [11], os Streptococcus mutans e Lactobacillus produzem ácidos orgânicos durante o metabolismo dos carboidratos. Esses ácidos dissolvem estruturas do esmalte e dentina iniciando o processo da lesão de cárie. A lesão de cárie pode ser dividiva em duas camadas: a mais externa que é chamada de dentina infectada, que contém tecido amolecido e com maior concentração de bactérias. A camada interna denominada de dentina afetada, apresenta maior resistencia a remoção, menor concentração de bactérias e apresenta capacidade de remineralização [2, 9, 12, 13, 14]. Por esse motivo, nesse trabalho realizamos a terapia fotodinâmica na dentina afetada, contendo um número menor de bactérias e uma alta capacidade de remineralização. A terapia fotodinâmica é um tratamento baseado na associação entre o oxigênio, fotossensibilizante e luz com o objetivo de produzir oxigênio singleto e radicais livres que serão responsáveis por danificar os componentes da membrana bacteriana gerando a- poptose celular [2, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]. Konopka e Goslinski [18] e Bonsor et al. [21] relataram que a terapia fotodinâmica é eficaz contra microrganismos e células tumorais, incluindo vírus e fungos. O azul de toluidina, fotossensibilizante derivado das fenotiazinas, tem a capacidade de ligação na membrana externa das gram-positivas e ao lipopolissacarídeo das gram-negativas [1, 6, 18, 22]. Garcez et al.

5 [7], Williams et al. [13] e Araujo et al. [14] afirmaram que o azul de toluidina é um fotossensibilizador que deixa a membrana celular mais susceptível a absorção da luz do laser vermelho, que segundo Konopka e Goslinski [18], Vlacic et al. [19], Bonsor et al. [21], Giusti et al. [23] e Pinheiro et al. [24] tem um comprimento de onda de aproximadamente 660 nm. Diwu e Lown [25] relatam que as vantagens do uso dos fotossensibilizantes derivados das fenotiazinas são a capacidade de gerar oxigênio singleto, baixo custo e intensa absorção. Uma desvantagem dos fotossensibilizantes derivados das fenotiazinas é a possível coloração da estrutura dental [13]. Por esse motivo, o azul de toluidina utilizado neste trabalho foi de baixa concentração concordando com Pinheiro et al. [1], Pinheiro et al. [2] e Bonsor et al. [21]. Williams et al. [13] e Araújo et al. [14] observaram que o fotossensibilizante penetra na dentina desmineralizada e no colágeno, resultando na redução microbiana na lesão de cárie dentinária. Esses pesquisadores observaram que a aplicação ativa do fotossensibilizante azul de toluidina na dentina infectada por 30 segundos acarretou penetração de 300 µm e após 60 segundos 400 µm. Nesse trabalho, o tempo de pré-irradiação foi de 3 minutos, discordando de Williams et al. [13] e Bonsor et al. [21]. Isto porque o substrato avaliado nessa pesquisa foi à dentina afetada que apresenta degradação parcial das fibras colágenas com possibilidade de reorganização [2,12, 13, 14]. Por esse motivo, nesse trabalho o tempo de pré-irradiação utilizado foi de 3 minutos concordando com Pinheiro et al. [1] e Pinheiro et al. [2]. De acordo com Wood et al. [26], as lâmpadas halógenas, o LED e os aparelhos laser são utilizados na terapia fotodinâmica na odontologia. O laser de baixa potência tem capacidade de regeneração óssea, aceleração no processo de cura, apresenta efeito antiinflamatório e analgésico, além de atuar na prevenção e no tratamento da lesão de cárie, justificando seu uso no presente trabalho. Bonsor et al. [21] observaram redução de 97% das bactérias da dentina infectada utilizando o azul de toluidina. Concordando com Willians et al. [13], Bonsor et al. [21] observaram redução bacteriana na matriz de colágeno da dentina infectada utilizando o fotossensibilizante associado ao laser de baixa intensidade. Williams et al. [13] e Burns, Wilson, Pearson [10] relataram que o fotossensibilizante ou a irradiação quando utilizadas isoladamente não apresentam efeitos antimicrobianos concordando com os resultados deste trabalho. 5. CONCLUSÃO A terapia fotodinâmica utilizando como fotossensibilizante o azul de toluidina e como fonte de luz o laser pode ser um recurso terapêutico para redução microbiana das lesões de cárie em dentina. AGRADECIMENTOS A bolsa de iniciação científica PIBIC/CNPq. REFERÊNCIAS [1] Pinheiro, SL., et.al. (2009), Photodynamic therapy in endodontic treatment of deciduous teeth, Lasers Med Sci, vol. 24, n. 4, p [2] Pinheiro, SL., et.al. (2010), Capacity of photodynamic therapy for microbial reduction in periodontal pockets, Lasers Med Sci, vol. 25, n. 1, p [3] Pinheiro, SL., et.al. (2005) Antibacterial activity of glass-ionomer cement containing antibiotics on caries lesion microorganisms, Am J Dent, vol. 18, n. 4, p [4] Westergren, G., et.al. (1978), Evaluation of a micromethod for determination of Streptococos muatns and Lactobacillus infection, J. Clin. Microbiol, vol. 7, n. 1, p [5] Krespi, YP., et.al. (2005), Lethal photosensitization of oral pathogens via red-filtered halogen lamp, Oral Dis, vol. 1, n. 1, p [6] Soukos, NS., et.al. (2006), Photodynamic Therapy for Endodontic Disinfection, JOE, vol. 32, n. 10, p [7] Garcez, AS., et.al. (2007), Antimicrobial Photodynamic Therary Combined with Conventional Endodontic Treatment to Eliminate Root Canal Biofilm Infection, Laser Surg Med, vol. 66, n. 1, p [8] Bonstein, T., et.al. (2010), Photoactivated disinfection of Streptococcus intermedius through dentin disc at clinically relevant intervals: An in vitro study. Arch Oral Biol, vol. 55, n. 10, p [9] Komerik, N., MacRobert, AJ., (2006), Photodynamic therapy as an alternative antimicrobial modality for oral infections, J Environ Pathol Toxicol Oncol, vol. 25, n. 1-2, p [10] Burns, T., et.al. (1995), Effect of dentine and collagen on the lethal photosensitisation of Streptococcus mutans, Caries Res, vol. 29, n. 1, p [11] Featherstone, JD., (2008), Dental caries: a dynamic disease process, Aust Dent J, vol. 53, n. 3, p [12] Kidd, EA., et.al. (1996), Criteria for caries removal at the enamel dentine junction: a clinical and microbiological study, Br Dent J, vol. 180, n. 8, p

6 [13] Williams, JA., et.al. (2004), The photo-activated antibacterial action of toluidine blue O in a collagen matrix and in carious dentine, Caries Res, vol. 38, n. 1, p [14] Araújo, PV., et.al. (2009), In vitro lethal photosensitization of S. mutans using methylene blue and toluidine blue O as photosensitizers, Acta Odontol Latinoam, vol. 22, n. 2, p [15] Wilson, M., (1993), Photolysis of oral bacteria and its potential use in the treatment of caries and periodontal disease, J Appl Bacteriol, vol. 75, n. 1, p [16] Williams, JA., et.al. (2003), Antibacterial action of photoactivated disinfection {PAD} used on endodontic bacteria in planktonic suspension and in artificial and human root canals, J Den, vol. 34, n. 1, p [17] Wilson, M., (2004), Lethal photosensitization of oral bacteria and its potential application in the photodynamic therapy of oral infections, Photochem Photobiil Sci, vol. 3, n. 1, p [18] Konopka, K., Goslinski, T., (2007), Photodinamic Therapy in Dentistry, J Dent Res, vol. 86, n. 8, p [19] Vlacic, J., et.al. (2007), Combined CPP-ACP and photoactivated disinfection (PAD) therapy in arresting root surface caries: a case report, Br Dent J, vol. 203, n. 8, p [20] Lima, JP., et.al. (2009), Evaluation of the antimicrobial effect of photodynamic antimicrobial therapy in an in situ model of dentine caries, Eur J Oral Sci, vol. 117, n. 5, p [21] Bonsor, SJ., Pearson, GJ., (2006), Current clinical applications of photo-activated disinfection in restorative dentistry, Dent Update, vol. 33, n. 3, p , ,153. [22] Sahu, K., et.al. (2009), Atomic force microscopic study on morphological alterations induced by photodynamic action of Toluidine Blue O in Staphylococcus aureus and Escherichia coli, J Photochem Photobiol B, vol. 96, n. 1, p [23] Giusti, JS., et.al. (2008) Antimicrobial photodynamic action on dentin using a light-emitting diode light source, Photomed Laser Surg, vol. 26, n. 4, p [24] Pinheiro, SL., et.al. (2008) Study of a morphometric model for histological evaluation of the collagen in dentin carious lesions, Journal Clinical of Pediatric Dentistry vol. 33, n. 2, p [25] Diwu, Z., Lown, WL., (1994), Phototherapeutic potential of alternative photosensitizers to porphyrins, Pharmacological Therapy, vol. 63, n. 1, p [26] Wood, S., et.al. (2006), Erythosine is a potential photosensitizer for the photodynamic therapy of oral plaque biofilms, J Antimicrob Chemother, vol. 57, n. 1, p