MICROSCÓPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO

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1 Psicologia e Saúde Unidade curricular: Biologia Humana I 4ª aula PL MICROSCÓPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO O microscópio é um instrumento utilizado para observar pormenores de objectos ou objectos muito pequenos, colocados a uma distância inferior à distância mínima de visão distinta, permitindo a observação de estruturas com dimensões inferiores às do limite de resolução do olho humano. O microscópio óptico é um microscópio composto, por ser constituído por dois sistemas de lentes, objectivas e oculares, que, em conjunto, permitem obter uma imagem ampliada do objecto. Para a observação microscópica ser possível, um feixe de luz emitido por uma lâmpada situada na base do microscópio tem de atravessar o objecto (iluminação transmitida) e chegar aos nossos olhos, depois de passar pelas lentes do microscópio. Os objectos destinados à observação microscópica são preparados a fim de se tornarem transparentes, se não o forem naturalmente. A luz que atravessa o objecto é chamada luz transmitida. A capacidade para ver o objecto designa-se por visibilidade e depende do contraste que o objecto apresenta. Entende-se por contraste a diferença relativa de intensidade luminosa ou de cor entre o objecto e o meio que o rodeia. Por outro lado, os objectos são visíveis quando: - São naturalmente corados (cloroplastos, por ex.) - São corados artificialmente - São incolores, mas têm índices de refracção significativamente diferentes dos do meio no qual estão montados. Para poderem ser observados, os objectos têm de ser montados entre uma lâmina e uma lamela, existindo entre estas um meio de montagem (água ou outro) que elimina diferenças de índice de refracção entre o objecto e os vidros da lâmina e da lamela. O conjunto formado pela lâmina, objecto e lamela constitui a preparação microscópica. Para manusear a preparação microscópica pega-se pelas arestas, entre os dedos polegar e indicador, evitando colocar os dedos sobre as superfícies da lâmina. Componentes do microscópio óptico (Fig. 1): Sistema mecânico (suporte ou estativo) a) Pé ou base - Placa rectangular e pesada que assenta sobre a mesa de trabalho, dando estabilidade ao conjunto. Inclui também um encaixe para o suporte da lâmpada. 1

2 b) Braço - Haste em parte vertical e em parte oblíqua fixada à base, que suporta as restantes partes do microscópio através de dois sistemas cremalheira-parafuso, os quais permitem o movimento vertical da platina. Fig. 1 - Constituição do microscópio óptico de fundo claro. c) Tubo ou canhão - Serve de suporte ao sistema de amplificação. Compreende duas partes: uma vertical e outra inclinada. A parte superior, inclinada, é um tubo binocular, tendo dois tubos portaoculares reguláveis lateralmente, dos quais o da esquerda é regulável também em altura. Este último 2

3 dispositivo de correcção permite compensar as desigualdades do poder visual dos dois olhos (anisometropia). A regulação lateral permite ajustar a distância entre as oculares à distância interpupilar do observador, que pode variar entre 55 e 75 mm. O tubo binocular pode ainda ser rodado e fixado na posição desejada por meio de um parafuso. d) Suporte do condensador, do diafragma e do porta-filtros - Está fixo à base inferior do suporte da platina. e) Botões de comando dos movimentos: parafusos macrométrico e micrométrico e parafuso de deslocação vertical do condensador. São botões bilaterais que controlam as deslocações verticais da platina e do condensador. Os que comandam os movimentos da platina são de dois tipos: - Botões de comando do parafuso de focagem rápida (parafuso macrométrico ou de grandes deslocações) - permitem movimentos verticais de grande amplitude. - Botões de comando do parafuso de focagem lenta (parafuso micrométrico) - permitem movimentos verticais de pequena amplitude, apenas para correcção da focagem. f) Botões de controlo da sobreplatina- Servem para deslocar a preparação sobre a platina e colocar o objecto no centro do campo visual. g) Revólver - Peça que suporta as objectivas e que roda de modo a colocar a objectiva desejada no prolongamento do tubo do microscópio. h) Platina - Placa onde se coloca a preparação, com a lamela voltada para cima, tendo no centro uma abertura para deixar passar a luz. i) Pinça da sobreplatina - Serve para imobilizar a preparação. j) Interruptor - Botão onde se liga e desliga o microscópio. Sistema óptico A - Sistema de iluminação Fornece, orienta e regula a quantidade de luz que atravessa o objecto (luz transmitida) e que, através do sistema de ampliação, chega ao observador. 3

4 k) Fonte luminosa - Lâmpada de incandescência de baixa voltagem situada na base do microscópio, que fornece o feixe de raios luminosos. Em alguns modelos de microscópios, a abertura deste feixe pode ser regulada por um diafragma de campo, colocado sobre a fonte luminosa. m) Filtro de luz - A qualidade da imagem pode ser melhorada com o uso de filtros corados, que determinam a composição espectral da luz usada. Os filtros absorvem certas radiações, conforme a sua cor e espessura. Nos microscópios de luz artificial é usado um filtro azul que absorve o excesso de radiação amarela emitida pela lâmpada, o que nos permite obter luz branca. Além disso, o filtro absorve o excesso de calor e de brilho e, por absorver as radiações visíveis de maior comprimento de onda (vermelho e amarelo), contribui para aumentar o poder de resolução do microscópio. n) Diafragma do condensador (diafragma-íris) - Regula a abertura do feixe luminoso que, vindo do condensador, atinge a objectiva. o) Condensador - Sistema constituído por duas lentes, que fornece à objectiva um cone de luz uniforme, cuja abertura é regulada pelo diafragma de abertura. O condensador diz-se aplanático por estar corrigido em relação à aberração esférica (ver adiante). Esta correcção é importante para que o condensador possa fornecer à objectiva um cone de luz uniforme. Concentra os raios luminosos na preparação, fornecendo raios oblíquos e raios directos, aumentando, assim, o poder de resolução da objectiva. B - Sistema de ampliação É constituído por lentes objectivas e oculares, integradas num sistema óptico centrado, isto é, com um eixo óptico comum a todas as lentes (e comum também ao eixo óptico do condensador). p) Objectivas (lente frontal + lentes correctoras) q) Oculares (lente ocular + lente de campo) OBJECTIVAS Uma objectiva (Fig. 2) é uma associação de lentes, situada na extremidade do tubo mais próxima do objecto. Recebe a luz vinda do objecto e fornece uma imagem (imagem intermediária) ampliada, invertida e real desse objecto. Esta imagem será ainda ampliada pelas oculares. 4

5 Nas objectivas existem diferentes tipos de lentes. A que se encontra mais próxima do objecto é chamada lente frontal. Desta depende a ampliação dada pela objectiva. As restantes lentes são chamadas lentes correctoras, destinadas a melhorar a qualidade da imagem. Em geral, o diâmetro da lente frontal das objectivas varia na razão inversa do respectivo poder de ampliação. Fig. 2 - Objectivas. Poder de ampliação É a capacidade de fornecer uma imagem ampliada do objecto. Geralmente, toma-se esta faculdade na acepção da sua expressão numérica, a ampliação. Ampliação Corresponde ao número de vezes que a imagem aparece maior do que o objecto. Varia na razão directa do comprimento da objectiva e na razão inversa do diâmetro da lente frontal. Normalmente, as objectivas têm ampliações de 4x, 10x, 40x e 100x, podendo também ter uma ampliação de 25x. Focar Operação de regulação da distância entre o objecto e a objectiva, de modo a ser obtida uma imagem nítida. Para focar são utilizados os parafusos macrométrico e micrométrico. Ângulo de abertura Ângulo formado pelos raios luminosos marginais que delimitam o cone de luz que atinge a lente frontal da objectiva (Fig. 3). O ângulo de abertura não é uma constante da objectiva, pois varia com 5

6 o índice de refracção do meio existente entre o objecto e a lente da objectiva. Este ângulo aumenta com o grau de ampliação da objectiva porque, quanto maior a ampliação, mais largo tem de ser o cone de luz que penetra na lente frontal, uma vez que a luminosidade das objectivas varia inversamente à sua ampliação. Este cone de luz é regulado pela abertura do diafragma do condensador. Por outro lado, quanto mais pequena for a abertura do condensador, maior será o contraste entre os elementos que compõem a imagem, pelo que será necessário chegar a um compromisso de equilíbrio entre a luminosidade e o contraste. Fig. 3 - Ângulo de abertura. Abertura numérica Notação característica da objectiva, que relaciona o ângulo de abertura com o índice de refracção do meio situado entre o objecto e a lente frontal da objectiva. É igual ao produto do índice de refracção (n) do meio entre o objecto e a lente frontal da objectiva pelo seno do semi-ângulo de abertura (senμ): AN = n. senμ Atribui-se, por convenção, o valor 1 para o índice de refracção do ar. Os outros meios são opticamente mais densos, apresentando maior resistência à transmissão da luz. 6

7 Índices de refracção Ar Água Óleo de cedro Vidro Como o valor de μ é sempre inferior a 90º, o valor do seno de μ é sempre inferior a 1. Assim, quando o meio entre o objecto e a lente frontal da objectiva é o ar (n = 1), o que acontece nas objectivas a seco (4x, 10x e 40x), a abertura numérica é sempre inferior a 1, sendo igual a senμ. Quando se utiliza óleo de cedro (n = 1.51) entre a preparação e a objectiva, o que é necessário para a observação com a objectiva de imersão (100x), a abertura numérica é superior a 1. Abertura numérica das objectivas Objectiva de 4x Objectiva de 10x Objectiva de 40x Objectiva de 100x Da abertura numérica de uma objectiva dependem a sua luminosidade e a sua resolução e, deste modo, a qualidade da imagem. Luminosidade Faculdade de deixar passar mais ou menos luz. A luminosidade de uma objectiva varia na razão inversa da sua ampliação. Por este motivo, é necessário fornecer maior quantidade de luz quando se utilizam objectivas de maior ampliação. Poder de resolução Faculdade de formar imagens distintas de dois pontos adjacentes. Geralmente, esta faculdade é expressa pelo seu valor numérico, o limite de resolução. 7

8 Limite de resolução Distância linear mínima entre dois pontos adjacentes, dos quais o microscópio dá imagens distintas. É o diâmetro aparente da mais pequena partícula visível. O microscópio óptico permite distinguir dois pontos que estejam afastados um do outro por uma distância igual a μm. Para distâncias inferiores, não é possível definir esses dois pontos, sendo, então, observados como um ponto único. Assim, o limite de resolução do microscópio óptico está entre 0.2 e 0.3 μm. O limite de resolução do olho humano, à distância de 25 cm, é de 100 a 300 μm (0.1 a 0.3 mm). podemos, por isso, dizer que o microscópio óptico tem um poder de resolução 500 vezes superior ao da visão humana. O limite de resolução (LR), depende do comprimento de onda da luz (λ) e da abertura numérica (AN) da lente objectiva utilizada, de acordo com a seguinte expressão: LR = 0.61 λ / AN Se o valor deste quociente for muito baixo, podemos distinguir dois pontos que estejam muito próximos um do outro. Assim, quanto menor for o limite de resolução, maior é o poder de resolução. O limite de resolução de uma objectiva varia na razão inversa da sua abertura numérica. Para que o condensador tenha uma abertura numérica superior a 1, é necessário colocar uma gota de óleo de cedro (óleo de imersão) entre a sua lente frontal e a preparação. Para se obter um valor mínimo da expressão anterior, utiliza-se luz de baixo comprimento de onda (luz azul) e uma abertura numérica elevada (com a objectiva de imersão). Deste modo, obtém-se o máximo poder de resolução. Para o cálculo genérico deste valor, considera-se o comprimento de onda da luz verde (0.55 μm) e a abertura numérica do condensador igual à da objectiva utilizada. Limite de resolução das objectivas Objectiva de 4x Objectiva de 10x Objectiva de 40x Objectiva de 100x

9 Poder penetrador Permite obter imagens bem focadas de pontos situados em diferentes planos da preparação. Esta capacidade diminui com o aumento da ampliação. Objectivas a seco São as que utilizam ar como meio óptico entre a lente frontal e a preparação (objectivas de 4x, 10x e 40x). A objectiva de 40x possui um dispositivo com uma mola (montagem telescópica), que protege a lente contra possíveis choques. Esta objectiva está calibrada para a observação de preparações com lamela de espessura de 0.17 mm. As restantes objectivas não são sensíveis à presença de lamela. Objectiva de imersão (objectiva de 100x) Necessita de óleo de cedro entre a lente e a preparação. A imersão diz-se homogénea se for utilizado óleo de cedro, por esta substância ter um índice de refracção igual ao do vidro. Daí a notação HI (imersão homogénea) presente na objectiva. A imersão aumenta a abertura numérica e o poder de resolução. Com a imersão homogénea são eliminadas as perdas de luz que ocorrem quando os raios luminosos passam de um meio opticamente mais denso (n vidro = 1.51) para um meio opticamente menos denso (n ar = 1). Deste modo, a objectiva recebe mais raios de luz do que receberia sem imersão. Esta objectiva tem um dispositivo de protecção igual ao da objectiva de 40x. Por necessitar de uma imersão homogénea, a lente de 100x não é sensível à presença de lamela. Objectivas para-focais Aquelas em que, estando a imagem visível para uma certa objectiva, permanece visível para a seguinte, bastando um pequeno movimento do parafuso micrométrico para que esta fique correctamente focada. 9

10 Notações das objectivas Ampliação... 4x 10x 40x 100x Abertura numérica Correcção para lamela Imersão homogénea... H I Aberrações A nitidez da imagem produzida por meios ópticos é prejudicada pelos defeitos inerentes às lentes, as aberrações. As objectivas têm dois tipos de aberrações: Aberração esférica - A esfericidade da lente determina a existência de vários focos para os raios luminosos que nela incidem. Os que incidem na margem da lente são mais fortemente desviados do que os centrais, o que resulta numa distorção da imagem. Aberração cromática - Resulta da decomposição da luz em virtude da desigual refracção sofrida pelas radiações de diferentes cores. Havendo um foco para cada cor, a imagem fica irisada. Objectivas acromáticas e aplanáticas As aberrações cromática e esférica podem ser corrigidas através da associação de lentes correctoras, dizendo-se, neste caso, que as objectivas são acromáticas e aplanáticas. Curvatura de campo Traduz-se pela falta de nitidez da parte marginal do objecto quando o centro está focado e vice versa. A curvatura de campo provoca um defeito de focagem em relação a todas as partes do objecto fora do eixo óptico. 10

11 OCULARES Uma ocular (Fig. 4) é uma associação de lentes, colocada na extremidade do tubo mais próxima do observador. Tem a função de ampliar a imagem intermediária dada pela objectiva e desta fornecer uma imagem virtual, ampliada e direita. A ampliação final dada pelo microscópio é o produto das ampliações parciais da objectiva e da ocular utilizada. Fig. 4 - Ocular. Oculares de Huyghens São constituídas por duas lentes plano-convexas, ambas com a face plana voltada para o observador. A lente ocular é a que se encontra mais próxima do observador e é a responsável pela ampliação dada pela ocular. A outra é designada por lente colectora ou lente de campo e tem como função conduzir a imagem formada pela objectiva ao plano focal da lente ocular. Entre as duas lentes existe um diafragma que limita o diâmetro do campo óptico. O comprimento das oculares varia na razão inversa da sua ampliação. O facto de se substituir uma ocular por outra de maior ampliação não aumenta o poder de resolução do microscópio, apenas fornece uma maior ampliação da imagem já resolvida pela objectiva. A utilização de oculares de grande ampliação tem como consequência uma diminuição da nitidez. Por outro lado, uma ocular com uma ampliação demasiado baixa não permite distinguir pormenores da imagem dada pela objectiva. Campo óptico ou campo visual Superfície iluminada, na qual está a imagem do objecto. O seu diâmetro pode ser calculado com a ajuda de uma escala graduada. A partir do diâmetro é possível calcular a área do campo óptico. Construção da imagem e suas qualidades As lentes utilizadas no microscópio são convergentes. Quando um feixe de raios luminosos paralelos incide perpendicularmente numa lente convergente, esses raios vão convergir para um ponto chamado foco (F) (Fig. 5). 11

12 Nas lentes existe um ponto chamado centro óptico (CO) (Fig. 5). Qualquer raio luminoso que passe por este ponto não sofre desvio de trajectória. A recta que passa pelos focos e pelo centro óptico é o eixo óptico (EO) (Fig. 5). Todos os pontos situados no eixo óptico têm a sua imagem sobre o próprio eixo. Fig. 5 - Lente convergente. Para determinarmos a imagem de um ponto, basta traçar dois raios luminosos: um, que passa pelo centro óptico e que, por isso, não sofre desvio; outro, paralelo ao eixo óptico, que se refracta, passando pelo foco. No ponto onde os dois raios se cruzam temos a imagem do ponto que utilizámos como objecto. Aplicando estes princípios ao microscópio, obtemos o esquema da Fig. 6. Fig. 6 - Construção da imagem. 12

13 A imagem dada pela objectiva (imagem intermediária) é uma imagem real (pode ser projectada num alvo), ampliada e invertida em relação ao objecto. Como esta imagem se projecta entre o foco e o centro óptico da lente ocular, ao traçarmos a imagem dada pela lente ocular, verificamos que os raios luminosos não se cruzam. Neste caso, para encontrarmos a imagem dada pela ocular traçamos o prolongamento dos raios no sentido contrário (a tracejado na Fig. 6). A imagem final assim obtida é virtual, isto é, não pode ser projectada num alvo, formando-se apenas na retina, quando os olhos se aproximam das oculares. É também uma imagem ampliada e invertida em relação ao objecto. A imagem final dada pelo microscópio é virtual, ampliada e direita em relação à imagem intermediária (Fig. 6). Regras para a observação microscópica Posição do microscópio - Em frente do observador. Posição do observador - Sentado de forma a manter uma posição confortável para a observação ao microscópio. Os olhos devem estar colocados próximos das oculares. Uma mão comanda os parafusos macrométrico e micrométrico e a outra comanda os parafusos de deslocação da sobreplatina. Quando se atinge a posição desejada, uma das mãos pode ficar livre para desenhar ou escrever, com o caderno encostado à base do microscópio. Posição da preparação microscópica - Apoiada sobre a platina e imobilizada pela pinça da sobreplatina, sempre com a lamela voltada para cima. O objecto deverá estar no centro da abertura da platina, posição que se obtém movendo os parafusos de deslocação da sobreplatina. Modo de focar o microscópio - Respeitando as regras anteriores, o observador deve executar os seguintes passos: - Ajustar o condensador para a posição mais elevada. - Abrir o diafragma. - Colocar inicialmente sempre a objectiva de menor ampliação, certificando-se de que está correctamente alinhada no prolongamento do tubo (ouve-se um estalido). - Regular a distância interpupilar. - Fazer subir a platina com a ajuda do parafuso macrométrico, observando pelas oculares até que surja uma imagem visível. 13

14 - Focar com o parafuso micrométrico, observando pela ocular direita um pormenor da preparação, mantendo o olho esquerdo fechado. - Fechar agora o olho direito e observar pela ocular esquerda. - Sem mexer na platina, rodar o anel de regulação do tubo porta-ocular esquerdo até obter uma imagem focada, tão nítida como a observada pela ocular direita. Ao abrir os dois olhos simultaneamente, a imagem estará focada. Modo de explorar uma preparação - A exploração poderá ser feita de um modo ordenado, tal como exemplificado na Fig. 7. Fig. 7 - Modo de explorar uma preparação. Modo de registar a localização de um objecto na preparação - A sobreplatina é constituída por duas escalas perpendiculares e respectivos nónios, que permitem indicar a posição do objecto colocado no centro do campo óptico, através do registo do ponto de encontro das leituras das duas escalas. Mudança de objectiva - Rodar o revólver até colocar a objectiva seguinte em posição de observação, exactamente no prolongamento do tubo. Note-se que as objectivas são para-focais: pode-se mudar de uma objectiva para a seguinte sem necessidade de mover o parafuso macrométrico, bastando ajustar a focagem com o parafuso micrométrico. É necessário ainda ajustar a posição do diafragma à objectiva utilizada: uma objectiva de maior ampliação obriga a maior abertura do diafragma. Utilização da objectiva de imersão - Depois de utilizar a objectiva a seco de maior ampliação, executar os seguintes passos: - Rodar o revólver, deixando-o numa posição intermédia entre a objectiva de imersão e a anterior. 14

15 - Colocar uma gota de óleo de cedro sobre a lamela, sem retirar a preparação da platina. - Rodar o revólver de modo a colocar a objectiva de imersão no prolongamento do tubo. - Observar pelas oculares e ajustar a focagem. - Terminada a observação, colocar a objectiva de menor ampliação. - Descer a platina, se for necessário. - Limpar a objectiva de imersão e a preparação com um pano macio e humedecido numa mistura de éter e álcool. Cuidados a ter com o microscópio - Não tocar com os dedos nas lentes frontais nem oculares. - Evitar que as objectivas toquem nas preparações. - Não utilizar a objectiva de imersão sem adicionar óleo de cedro. - Limpar as lentes com um pano ou um papel macio, em delicados movimentos circulares. - Não desmontar as objectivas nem as oculares. - Não retirar as objectivas dos seus encaixes no revólver. - Não forçar os parafusos de deslocamento. Recomendações a seguir depois da sua utilização - Colocar a objectiva de menor ampliação. - Descer a platina, se for necessário. - Limpar a objectiva de imersão e a preparação, retirando o óleo de cedro com um pano macio e um pouco de éter e álcool, tendo o cuidado de não deixar vestígios deste, uma vez que pode descolar as lentes. Fotomicrografia É possível captar a imagem intermediária do microscópio (imagem real), introduzindo no seu eixo óptico uma câmara fotográfica ou de vídeo. As fotografias tiradas têm uma ampliação igual à ampliação da objectiva utilizada, uma vez que a ocular não interfere. 15