ALESSANDRO DIOGO DE CARLI

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1 ALESSANDRO DIOGO DE CARLI AÇÃO DA PRÓPOLIS DE APIS MELLIFERA ASSOCIADA AO FLUORETO DE SÓDIO NO PROCESSO DE REMINERALIZAÇÃO DE MANCHAS BRANCAS E SOBRE A MICROBIOTA CARIOGÊNICA: ESTUDO IN SITU CAMPO GRANDE 2010

2 1 ALESSANDRO DIOGO DE CARLI AÇÃO DA PRÓPOLIS DE APIS MELLIFERA ASSOCIADA AO FLUORETO DE SÓDIO NO PROCESSO DE REMINERALIZAÇÃO DE MANCHAS BRANCAS E SOBRE A MICROBIOTA CARIOGÊNICA: ESTUDO IN SITU Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-oeste da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, para obtenção de título de Doutor. Orientador: Prof. Dr. Paulo Zárate CAMPO GRANDE 2010

3 2 FOLHA DE APROVAÇÃO ALESSANDRO DIOGO DE CARLI AÇÃO DA PRÓPOLIS DE APIS MELLIFERA ASSOCIADA AO FLUORETO DE SÓDIO NO PROCESSO DE REMINERALIZAÇÃO DE MANCHAS BRANCAS E SOBRE A MICROBIOTA CARIOGÊNICA: ESTUDO IN SITU Resultado Campo Grande (MS), 13 de agosto de Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Saúde e Desenvolvimento na Região Centrooeste da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, para obtenção de título de Doutor. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Instituição: Prof. Dr. Instituição: Prof. Dr. Instituição: Prof. Dr. Instituição: Prof. Dr. Instituição:

4 3 DEDICATÓRIA Para dedicar uma conquista desse valor, vou me apoiar em ombros de gigantes. Escolhi gigantes da música e da literatura. Dedico esse trabalho, primeiramente, a minha esposa Melina: acompanhaste a edificação desse momento. Estiveste e vivenciaste junto a mim todas as etapas desse processo. Acho que estou entendendo o sentido do casamento e, posso dizer, do amor:...se você pensa em mim, se você me abraça, a vida é gratia plena, a vida é cheia de graça... (George Israel e Paula Toller, 2005). Dias atrás, li esse verso de Vinícius de Moraes: Eu, muitas noites, me debrucei sobre o teu berço e verti sobre o teu pequenino corpo adormecido as minhas mais indefesas lágrimas de amor, e pedi a todas as divindades que cravassem na minha carne as farpas feitas para a tua. Logo, lembrei dos meus pais: Waldemar e Therezinha, que há 49 anos se dedicam à construção (e reconstrução) de uma união plena, acreditando indubitavelmente no valor da família. Qualquer palavra que eu escreva não será suficiente para expressar a gratidão e a admiração que tenho por vocês. Obrigado por todo amor, atenção, proteção e confiança que sempre dedicaram a mim. As farpas vieram, e, sem dúvida, virão. Aprendi com vocês o valor da verdade e de nunca esquecer de quem realmente eu sou e de onde eu vim. Por me ensinarem (e por terem me proporcionado) viver com dignidade e liberdade, dedico-lhes esse trabalho e todo meu amor. À minha irmã, meu cunhado e meus lindos sobrinhos, por acreditarem em mim, e por configurarem parte essencial da minha felicidade.

5 4 AGRADECIMENTOS À Melina, amada esposa e grande incentivadora de todas as minhas conquistas. A minha prima Profª. Ms. Grasiela De Carli, colega de profissão e de sonhos, pelas opiniões sensatas, críticas e pontuais, essenciais para a realização desse trabalho. À Cirurgiã-dentista Vanessa Hoffmann, pela colaboração com a confecção dos dispositivos palatinos. Aos voluntários que participaram do experimento, pela seriedade e comprometimento com a realização do estudo. Aos professores Cibele Bonfim de Rezende Zárate, Valéria Rodrigues de Lacerda e Edílson José Zafalon, colegas da disciplina de Odontologia em Saúde Coletiva da FAODO / UFMS, pelo excelente convívio e espírito colaborativo. Somos uma equipe (de amigos!). Aos amigos Prof. Dr. Key Fabiano de Souza Pereira, e Prof. Dr. Danilo Matias Guerisoli, pelas contribuições para a realização desse trabalho. À Profª. Drª. Rosana Mara Giordano de Barros, Diretora da FAODO-UFMS, pela excelente receptividade que dispensou a mim quando iniciei minhas atividades docentes na FAODO e por tudo que fizestes para a materialização de uma grande conquista da minha vida. Serei eternamente grato. À Fundect, pelo fomento à pesquisa. Finalmente, faço um agradecimento especial ao meu amigo Prof. Dr. Paulo Zárate Pereira, por ter resgatado em mim o sentimento de confiança nas verdadeiras amizades. Como professor e orientador (desde o Mestrado), foste sempre preocupado em fazer o melhor, o que, na minha prática docente, implicou uma criticidade objetiva e construtiva e isso, é parte essencial da consolidação do meu caminho na docência, também pela inspiração em seu legado. És como um irmão para mim, tu sabes! Gratidão imensa, sempre.

6 5 Sim. A vida é muito oriental. Só algumas pessoas escolhidas pela fatalidade do acaso provaram da liberdade esquiva e delicada da vida. (Clarice Lispector, Água Viva)

7 6 RESUMO De Carli AD. Ação da própolis de Apis mellifera associada ao fluoreto de sódio no processo de remineralização de manchas brancas e sobre a microbiota cariogênica: estudo in situ. Campo Grande; [Tese Universidade Federal de Mato Grosso do Sul]. A associação da própolis ao fluoreto tem apresentado resultados promissores nos ensaios in vitro e in vivo para o controle da cárie. O objetivo desse estudo foi verificar o efeito de um extrato etanólico de própolis 5% (EEP 5%) associado ou não ao fluoreto de sódio (NaF 0,05%) sobre o biofilme cariogênico e os processos de desmineralização-remineralização do esmalte. Realizou-se estudo in situ de duas fases de 14 dias cada; na Fase 1, os voluntários utilizaram dispositivos palatinos contendo 6 blocos de esmalte, que foram submetidos ao desafio cariogênico (DC) com sacarose 20%/8 vezes ao dia. Na segunda fase, os voluntários foram divididos em grupos experimentias: (1)DC+Controle; (2) DC+NaF 0,05%; (3)DC+EEP 5%; (4)DC+EEP 5%+NaF 0,05% ; e (5)DC+Flúor Fosfato Acidulado. Ao final de cada fase, foram realizadas as análises microbiológica do biofilme e da microdureza do esmalte em corte transversal. No grupo 4 houve diferenças estatisticamente significativas em relação a todos os grupos e entre as fases, tanto para as variáveis ganho mineral e recuperação da microdureza, quanto na supressão das contagens bacterianas. Concluiu-se que a associação EEP 5%+NaF 0,05% foi o tratamento mais efetivo para o controle do biofilme cariogênico e reequilíbrio mineral. Palavras-chave: Streptococcus mutans, placa dentária, cárie dentária.

8 7 ABSTRACT De Carli AD. Action of Apis mellifera propolis associated to sodium fluoride in the remineralization process of white spots and on the cariogenic microbiota: in situ study. Campo Grande; [Thesis Federal University of Mato Grosso do Sul]. The association of propolis to fluoride has presented promising results on in vitro and in vivo essays for caries control. The objective of the present study was to verify the effect of a 5% propolis ethanol extract (EEP 5%) associated to 0.05% sodium fluoride (NaF 0.05%) on the cariogenic dental biofilm and the demineralizationremineralization processes of the enamel. A 2-phase, 14 days each, in situ study was performed; on Phase 1, the volunteers wore palatal devices containing 6 enamel blocks, which were submitted to cariogenic challenge (CC) with 20% sucrose 8 times a day. During Phase 2, volunteers were divided in 5 experimental groups treated as follows: (1) CC+control; (2) CC+NaF 0.05%; (3) CC+EEP 5%; (4) CC+EEP 5% + NaF 0.05% and (5) CC + acidulated phosphate fluoride. At the end of each phase, the microbiologic analysis of biofilm and microhardness of transversal sections of the enamel were performed. Group 4 presented statistically significant differences when compared to the other studied groups and among the phases, regarding mineral gain and microhardness recover, as well as bacteria supression. It could be concluded that the association of EEP 5%+NaF 0.05% was effective in controlling cariogenic biofilm and mineral reequilibrium. Key-words: Streptococcus mutans, dental plaque, dental caries

9 8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Média (± DP) de UFC dos diferentes microrganismos conforme o grupo e fase experimentais Tabela 2- Média (± DP) da microdureza do esmalte em corte transversal conforme a profundidade, grupo e fases experimentais...31 Tabela 3- Média (± DP) do ganho mineral (GM) e recuperação da microdureza do esmalte (RM) conforme a profundidade e grupos experimentais 32

10 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Critérios de inclusão e exclusão...23 Figura 2 Dispositivo palatino...24 Figura 3 Desenho do estudo...25 Figura 4 Blocos de esmalte preparados para o ensaio de microdureza...28 Figura 5 - Shimadzu Micro Hardness Tester HMV Figura 6 Correlação linear entre a microdureza do esmalte (50µm de profundidade) e microrganismos testados (Teste de Correlação Linear depearson)...33

11 10 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS % porcentagem µg micrograma µm micrômetro ATF aplicação tópica de flúor BMECT valor baseline da microdureza do esmalte em corte transversal C controle CBM concentração bactericida mínima CEP comitê de ética em pesquisa DC desafio cariogênico DES desmineralização DF dentifrício fluoretado DNF dentifrício não-fluoretado DP desvio padrão EEP extrato etanólico de própolis F-ATPase flúor ATPase FFA flúor-fosfato-acidulado g grama GM ganho mineral GTF glicosiltransferase HB higiene bucal M1 análise microbiológica na Fase 1 M2 análise microbiológica na Fase 2 MECT microdureza do esmalte em corte transversal MECT 1 microdureza do esmalte em corte transversal na Fase 1 MECT 2 microdureza do esmalte em corte transversal na Fase 2 mg miligrama ml mililitro mm mili Mol MSB mitis salivarius bacitracina NaF fluoreto de sódio ºC graus Celsius ph potencial hidrogeniônico

12 11 ppm parte por milhão RE remineralização RM recuperação da microdureza tt trans-trans UFC Unidades formadoras de colônia

13 12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODO Tipo de Estudo Desenho experimental Obtenção do EEP Análise microbiológica do biofilme cariogênico Análise da microdureza do esmalte em corte transversal Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO...38 REFERÊNCIAS...39

14 13 1 INTRODUÇÃO A cárie dentária permanece sendo, no campo da saúde bucal, um dos principais problemas de saúde pública, apesar do declínio nas últimas décadas, pois ainda é prevalente para alguns grupos, o que pode ser devido ao fato de que, em escala global, somente uma parcela da população se beneficia dos métodos de prevenção e controle (NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH, 2001; MARSH, 2003; MARTHALER, 2004; FEATHERSTONE, 2009). Desde a década de 60, a cárie é considerada uma doença induzida pela presença de biofilme, fator crítico para o seu desenvolvimento em humanos (LÖE, 1969). Estudos iniciais indicaram especificidade bacteriana envolvida nesse processo, relacionando os Streptococcus mutans a sua etiopatogenia (IKEDA et al., 1973; LOESCHE et al., 1976; MINA; LOESCHE, 1977; DUCHIN; VAN HOUTE, 1978; LOESCHE; STRAFON, 1979; VAN HOUTE, 1980) e os Lactobacilos à sua progressão (LOESCHE, 1986). A evolução dos experimentos evidenciou que o desenvolvimento da cárie é relacionado a uma multiplicidade de fatores que são capazes de modificar o ecossistema oral, concedendo aos microrganismos odontopatógenos a oportunidade de dominar a microbiota nos sítios que favoreçam tal situação. Por esse parâmetro, a cárie dentária poderia ser entendida não somente como uma doença infecciosa e multifatorial, mas como um evento essencialmente oportunista (LANG et al., 1987; BUISCHI et al., 1989). Nesse sentido, nos anos 90, destacaram-se estudos que propuseram a evidência de que eventos ecológicos referentes ao biofilme dental implicariam maior ou menor cariogenicidade deste, o que ficou conhecido como Hipótese da Placa Ecológica (MARSH, 1991; MARSH, 1994). Assim, o excesso de açúcar oriundo da dieta poderia levar à produção de ácidos causando uma mudança no ambiente bucal (de um ph neutro para um ph ácido), situação que incita trocas ecológica na microbiota residente dominada por Streptococcus sanguis e Streptococcus oralis (relacionados ao processo de remineralização-re), por outra em que predominam os estreptococos do grupo mutans e lactobacilos, que são acidúricos e acidogênicos e, portanto, cariogênicos (os quais favorecem o processo de desmineralização-des), levando aos estágios iniciais e de desenvolvimento da doença cárie, respectivamente, se não controlados.

15 14 Quando o controle mecânico do biofilme é falho, favorecendo o acúmulo deste em sítios de estagnação, a formação de um biofilme potencialmente cariogênico é favorecida, e as espécies microbianas como os Streptococcus mutans e Lactobacilos são ecologicamente selecionadas, passando a dominar o microambiente bucal (MARSH,1991), fato que expõe o indivíduo a uma situação de risco de cárie exacerbado (desafio cariogênico), implicando o surgimento de manchas brancas ativas na superfície do esmalte, as quais são o primeiro sinal clínico da doença, cujos controle e inativação são exequíveis (BACKER-DIRKS, 1966; MALTZ et al., 2003). Nessa situação, indica-se o controle químico (adjuvante) do biofilme dental, a fim de auxiliar o paciente na realização de uma higienização bucal compatível com níveis clínicos salutares (ADDY, 1986). Classicamente, os fluoretos e a clorexidina foram utilizados como antimicrobianos para o controle químico do biofilme dental. Entretanto, com o crescente interesse por produtos naturais desde a década de 90, a própolis passou a ser objeto de estudos, principalmente devido a sua capacidade antimicrobiana (BRUMFITT et al., 1990; WOISKY et al., 1994). A utilização de Extratos Etanólicos de Própolis (EEPs) no campo da Cariologia tornou-se factível quando estudos iniciais abordaram sua atividade sobre a inibição de microrganismos relacionados à cárie dentária (IKENO; MIYASAWA, 1991; GEBARA et al., 1996; STEINBERG et al.,1996; OTA et al., 1998; KOO et al., 2000ab; KOO et al., 2003; KOO et al., 2005; ALMEIDA et al. 2006) e sobre o processo de formação do biofilme cariogênico / fatores de virulência bacteriana que influenciam na cariogenicidade deste (PARK et al., 1998 ; KOO et al., 2000abc; KOO et al., 2002ab; ALMEIDA et al.,2006). Evidências indicam que o fluoreto de sódio (NaF) é eficaz no processo de remineralização de lesões de cárie incipiente (FEATHERSTONE, 1999; CURY; TENUTA, 2009; FEATHERSTONE, 2009). Diante disso, pensou-se na hipótese de combinar os EEPs ao NaF para verificação da possibilidade da utilização dessa associação na dinâmica do processo de desmineralização-remineralização do esmalte (processo DES-RE). As terapias de associação (combinatórias) verificaram o efeito de EEPs isoladamente ou associados ao fluoreto de sódio sobre a recuperação da microdureza superficial do esmalte (GIAMALIA et al., 1999; ZÁRATE-PEREIRA,

16 ) e na remineralização de manchas brancas (ZÁRATE-PEREIRA, 2003; DE- CARLI, 2007 ), tendo em vista a sinergia entre um comprovado agente remineralizador (NaF) e um potente composto antibacteriano de origem natural e sem relato de toxicidade (EEP). Todos esses resultados direcionam para a possibilidade do uso dos EEPs no tratamento de cárie. Porém, frente ao alto desafio cariogênico, o NaF pode não ser suficiente para controlar a doença cárie; daí a necessidade de desenvolvimento de agentes químicos de controle do biofilme dental que sejam seguros para o uso e cuja ação seja sinérgica ou complementar à do fluoreto (OGAARD et al., 1994; FEATHERSTONE, 2009; ten CATE, 2009). Embora a associação NaF+EEPs tenha sido avaliada, mais estudos são necessários para confirmar os resultados, especialmente com a própolis sul-matogrossense, ainda não avaliada sob esse aspecto, comparando-a ao NaF e também ao flúor fosfato acidulado (FFA), o que justifica a realização deste ensaio. O objetivo desse trabalho foi verificar, in situ, o efeito do EEP 5% isolado e associado ao NaF 0,05%, sobre o processo de desmineralização-remineralização do esmalte (processo DES-RE) e sobre a microbiota cariogênica. A hipótese testada é a de que a associação EEP+NaF seja capaz de controlar a cárie dentária em situações de risco à doença.

17 16 2 REVISÃO DE LITERATURA Um estudo clássico da década de 90 demonstrou a eficácia da própolis no processo inibitório do crescimento da microbiota cariogênica e da atividade das enzimas glicosiltransferases (GTF), especificamente nos estreptococos do grupo mutans, os quais são fortemente associados ao início do processo da doença cárie, sugerindo a atividade anticariogênica da própolis (IKENO; MIYASAWA, 1991). Em experimento realizado in vitro, avaliou-se a ação antimicrobiana de substâncias naturais sobre Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus, dentre elas a própolis, comprovando sua ação antibacteriana, e também a capacidade de inibir a adesão bacteriana desses microrganismos, o que sugeriu a possibilidade do uso desta substância no controle do biofilme bacteriano bucal (GEBARA et al., 1996). Os efeitos antibacterianos da própolis e do mel foram investigados in vitro. Em baixas concentrações de mel, houve o aumento do crescimento bacteriano, e em concentrações acima de 4,16%, observou-se a redução deste; em concentrações baixas de própolis, não houve alterações significativas no crescimento bacteriano, mas, à medida que se aumentou a concentração, o padrão de crescimento foi alterado, obtendo-se a inibição completa na concentração de 0,4% de própolis. No estudo in vivo, os voluntários bochecharam 5mL de mel durante 4 minutos, quando se observou uma redução de 60% e 40% na contagem de bactérias totais viáveis, e de 58% e 54% na contagem de Streptococcus mutans, respectivamente, dez minutos e uma hora após os bochechos. Em relação à própolis, a solução bochechada pelos voluntários foi de 0,2%, durante 1,5 minutos, observando-se redução de 38% na contagem de totais viáveis e 42% na contagem de Streptococcus mutans, após 10 minutos da realização do bochecho (STEINBERG et al.,1996). A GTF é a responsável pela síntese de glucanos a partir da sacarose, que são essenciais para o metabolismo das bactérias componentes do biofilme cariogênico. Em um estudo que comparou amostras de própolis de vários estados brasileiros em relação a sua capacidade antibacteriana e de inibir a enzima GTF, concluiu-se que todas as amostras testadas inibiram o volume da produção de GTF por Streptococcus mutans, merecendo destaque as amostras do Rio Grande do Sul (inibição=30,5%) e do Mato Grosso do Sul (inibição= 19,4%), cujos halos de inibição

18 17 para Streptococcus mutans foram de 3,0mm e 1,5mm, respectivamente (PARK et al, 1998). Ao abordarem a atividade antimicrobiana da própolis (nas concentrações de 1 a 10mg/mL) sobre bactérias recém-isoladas da cavidade bucal, observou-se evidente atividade antibacteriana dessa substância sobre todas as cepas testadas, na seguinte ordem de sensibilidade: Streptococcus mutans > Lactobacillus sp. > Staphylococcus aureus > Staphylococcus epidermidis, indicando a possibilidade de utilizá-la frente a infecções oportunistas causadas por esses microrganismos e também na clínica odontológica, com a finalidade de controlar a atividade de cárie (OTA et al., 1998). A associação de própolis 5% acrescida de NaF 0,05% e deste isolado, foram avaliados sobre a redução de estreptococos do grupo mutans em pacientes com atividade de cárie. Foram realizados bochechos durante 15 dias; no final desse período, observou-se que a solução de própolis acrescida ao fluoreto reduziu os níveis salivares desses microrganismos em cerca de 66,93%, o que não foi observado no grupo de voluntários que bochecharam apenas o fluoreto de sódio 0,05% (controle). Decorridos 15 dias após o último bochecho, os níveis salivares desses microrganismos tenderam aos valores iniciais (ZÁRATE-PEREIRA, 1999). No mesmo ano, estudou-se a microdureza do esmalte submetido à própolis. No estudo in vitro, os blocos de esmalte foram imersos, durante uma hora, em soluções de própolis a 0,4%, 1,0% e 2,0%. Verificou-se que houve aumento na microdureza (remineralização) dos espécimes na ordem de 8,24%; 26,9% e 53,65%, quando submetidos soluções de 0,4%; 1,0% e 2,0%, respectivamente (GIAMALIA et al., 1999). Os EEP oriundos dos Estados de Minas Gerais e Rio Grande do Sul foram averiguados quanto a sua capacidade de inibir a GTF-B (responsável pela síntese de glucanos insolúveis); GTF-C (sintetiza glucanos solúveis e insolúveis) e a GTF-D (que sintetiza glucanos solúveis) obtidas em duas versões: GTF purificada em solução e GTF adsorvida à superfície de blocos de esmalte dentário cobertos por saliva. Os EEP das duas regiões apresentaram atividade inibitória a todas as GTFs em solução (75-95%) e adsorvidas ao esmalte (45-95%), quando concentradas entre 0,75% e 3,0 mg/ml (KOO et al., 2000a). Em estudo in vitro que comparou o efeito de uma nova variedade de própolis oriunda da Bahia (na concentração de 50µg/mL) em relação à própolis de Minas

19 18 Gerais (400µg/mL) sobre os estreptococos do grupo mutans (EGM), verificou-se que ambas demonstraram atividade contra esses microrganismos, porém, a amostra baiana apresentou melhores resultados no que se referiu à inibição do crescimento dessas bactérias, aderência celular e síntese de glucanos insolúveis (KOO et al., 2000b). A comparação in vitro da atividade antimicrobiana da própolis 10% e da Arnica Montana na mesma concentração, contra patógenos orais, demonstrou que a própolis teve capacidade inibitória significativa para todos os microrganismos testados, com ação similar em relação à aderência bacteriana e à síntese de glucanos insolúveis, comportamento não observado nas amostras de arnica (KOO et al., 2000c). Koo et al. (2002a) avaliaram o efeito de um colutório à base de própolis 20% no acúmulo de placa e na formação de polissacarídeos insolúveis. Os voluntários que fizeram o uso do colutório sob desafio cariogênico (obtido através de bochechos de sacarose 20%, durante 5 vezes ao dia) obtiveram significativos menores índice de placa e concentração de polissacarídeos insolúveis presentes no biofilme quando comparados ao grupo placebo. Os efeitos dos componentes encontrados na própolis (flavonóides e derivados do ácido cinâmico) oriunda do Rio Grande do Sul, foram testados sobre o crescimento de Streptococcus mutans e na atividade da GTF em solução e em superfície de hidroxiapatita coberta por saliva. Dentre esses compostos, os flavonóides (apigenina 135µg/mL e tt-farnesol µg/ml), se comportaram como potentes inibidores da GTF e do crescimento bacteriano, respectivamente (KOO et al., 2002b). Ao analisarem a ação de dois componentes da própolis (apigenin e ttfarnesol), sobre o desenvolvimento de cáries em ratos, observou-se que a associação desses componentes obteve efeito cariostático. O apigenin demonstrou ser o primeiro agente cariostático natural, devido a sua habilidade em inibir a GTF, diminuindo a síntese de glucanos em níveis até então não observados. Esses compostos agem nos fatores de virulência das bactérias e/ou em seu metabolismo cariogênico, e quando associados ao uso de fluoretos, podem aumentar o efeito destes no equilíbrio do processo de desmineralização/remineralização do esmalte dental (KOO et al., 2003).

20 19 Um estudo in situ que avaliou a ação da própolis de Apis mellifera 5% associada ao NaF 0,05% no desenvolvimento da cárie dentária e na formação do biofilme dental, evidenciou que houve significativa redução das contagens microbianas na ordem de 75,5%; 50,0%; 46,5% e 36,6%, para a população de estreptococos totais, estreptococos do grupo mutans, lactobacilos e total de bactérias viáveis, respectivamente, quando expostos a esse composto. Além disso, verificou-se a redução da perda mineral nas lesões de cárie que foram submetidas à terapia de associação, sob desafio cariogênico (ZÁRATE-PEREIRA, 2003). A influência de dois importantes componentes da própolis - apigenin e ttfarnesol associados ao fluoreto, sobre o controle do biofilme cariogênico, foi novamente investigada por KOO et al. (2005). O estudo demonstrou que a associação aumentou as propriedades anti-cárie do fluoreto pela ação sinérgica dos componentes. Em geral, os biofilmes expostos a essa combinação desenvolveram menores biomassa e quantidade de glucanos insolúveis e polissacarídeos intracelulares em relação aos biofilmes tratados com essas substâncias isoladamente. Para os autores, a combinação desses agentes com o flúor pode representar uma utilidade potencial e um enfoque alternativo para as atuais estratégias quimioterápicas, com vistas à prevenção da doença cárie, pela redução da expressão de virulência dos Streptococcus mutans, sem necessariamente suprimir a flora bacteriana oral residente. O apigenin é considerado um potente inibidor da atividade das GTF, afeta o acúmulo de Streptococcus mutans pela redução da formação de glucanos insolúveis e pelo aumento do conteúdo de glucanos solúveis da matriz de polissacarídeos nos biofilmes in vitro. Evidenciou-se a influência do apigenin na expressão dos genes gtf B, C e D de Streptococcus mutans, a qual pode ser induzida pela sacarose, revelando que, na presença desse composto, a expressão de gtf B e C diminuiu mais que 50% e quando houve a adição de sacarose, nenhum efeito foi observado no perfil de expressão desses genes. Em contraste, a expressão do gtf D foi aumentada. Nesse estudo, ficou claro o efeito do apigenin na expressão dos genes envolvidos na síntese de polissacarídeos extra-celulares (PECs), indicando que esse flavonóide possui características terapêuticas únicas, pois afeta a atividade e a expressão das enzimas GTF, sem desencadear efeitos antibacterianos, característica que pode ser responsável pelas suas propriedades anti-cárie (KOO et al., 2006).

21 20 No mesmo ano, foram averiguadas a influência do EEP 5% sobre biofilmes de Streptococcus mutans e no desenvolvimento de cárie em ratos expostos ao alto desafio cariogênico pela ingestão de dieta cariogênica e água acrescida de sacarose 5%. Os dados do estudo indicaram hipóteses pelas quais o EEP utilizado possa ter exercido efeito cariostático: a redução da acidogênese pelo biofilme estreptocócico; a inativação do sistema F-ATPase de translocação de prótons e a inibição da síntese de glucanos insolúveis pelas enzimas GTF. A perturbação desses fatores de virulência, que são críticos aos Streptococcus mutans, particularizou a utilização da própolis na concentração empregada a fim da obtenção de efeito cariostático, sem que a viabilidade da microflora residente fosse afetada (DUARTE et al., 2006). Com o objetivo de se avaliar a ação de uma solução antisséptica de EEP a 6,25% e de clorexidina 0,12% (controle positivo) sobre o Índice de Higiene Oral Simplificado (IHO-S), Índice de Sangramento Gengival (ISG) e na contagem de Streptococcus mutans, verificou-se uma redução de 72,3% e 75,3% nos níveis salivares de Streptococcus mutans, utilizando-se o EEP e o controle positivo, respectivamente, após 24 horas do término da realização dos bochechos. Após 21 dias, as contagens de Streptococcus mutans estavam próximas aos valores iniciais para ambas as soluções. Em todas as contagens bacterianas realizadas não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na atuação das duas soluções. A análise do ISG revelou uma redução significativa no incremento da doença pela utilização do EEP; comparando-se os valores do IHO-S prévio e posterior aos bochechos, notou-se que a solução de própolis não promoveu redução significativa nesse índice, quando comparada com a solução de clorexidina. Concluiu-se que a solução empregada reduziu significativamente os níveis salivares de Streptococcus mutans e atuou sobre as condições gengivais, podendo ser indicada como agente de controle químico terapêutico do biofilme dental (ALMEIDA et al., 2006). Em um ensaio clínico duplo cego randomizado, a efetividade da associação de um EEP 5% ao NaF 0,05% foi testada sobre a contagem dos níveis salivares de Streptococcus mutans, o acúmulo de biofilme dental e a quantificação das manchas brancas ativas. Os voluntários (n=97) foram divididos em dois grupos que receberam aplicações tópicas consecutivas dos géis experimentais (uma vez por semana, durante 4 semanas). Após 24h e 15 dias do término das aplicações, novas contagems de Streptococcus mutans foram realizadas. Decorridas 48h após a última aplicação tópica, mensurou-se o acúmulo do biofilme dental. Revelou-se o teor dos

22 21 géis experimentais, verificando-se que o Gel A constituía-se de EEP 5% associada ao NaF 0,05%, e o Gel B possuía somente o EEP 5%. Os resultados obtidos demonstraram a superioridade do Gel A em relação ao Gel B, com diferenças estatisticamente significativas entre os géis testados, principalmente no que se referia à diminuição dos níveis salivares de Streptococcus mutans e à inativação de manchas brancas. Concluiu-se que a associação foi eficaz na redução dos níveis salivares de Streptococcus mutans, eficiente na remineralização de manchas brancas e reduziu significativamente o acúmulo de biofilme (DE CARLI, 2007). A utilização de flavonóides específicos encontrados na própolis foi mencionada como estratégia para aumentar os efeitos biológicos dos fluoretos sobre o biofilme dental, constituindo uma terapia alternativa contra o biofilme cariogênico (KOO, 2008; KOO; JEON, 2009). Nesses dois estudos, os autores evidenciaram que em concentrações baixas, a associação do apigenin (1mM), tt-farnesol (5mM) e do fluoreto (250 ppm) foi capaz de afetar a patogenicidade de Streptococcus mutans em biofilmes, através da inibição da síntese de glucanos insolúveis pela redução da atividade das glicosiltransferases B e C; pela modulação da expressão de gene gtf B e C em nível transcricional; por perturbar a variação do ph através da membrana celular e pela inibição da síntese e acúmulo de polissacarídeos intracelulares. Desse modo, essa terapia combinatória atuou sobre fatores de virulência críticos dos Streptococcus mutans e, claramente, aumentaram as propriedades cariostáticas do fluoreto, sem alterar a microbiota residente.

23 22 3 OBJETIVO Verificar o efeito de um Extrato Etanólico de Própolis isolado e associado ao fluoreto de sódio, sobre a microbiota cariogênica e nos processos de remineralização e desmineralização do esmalte dentário, sob desafio cariogênico.

24 23 4 MATERIAL E MÉTODO 4.1Tipo de estudo Esse estudo foi do tipo experimental, cego (na análise microbiológica e da microdureza em corte transversal) e randomizado. 4.2 Desenho experimental Após a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UFMS (protocolo nº 1393; ANEXO A) e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (APÊNDICE A), 30 voluntários (cujos critérios de inclusão/exclusão estão listados na Figura 1) integraram esse estudo. Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão 1) Idade entre 18 e 40 anos. 2) Presença de, no mínimo, 28 dentes. 3) Ausência de atividade das doenças cárie e periodontal. 4) Realização de higiene bucal ao menos 2 vezes ao dia. 5) Concordância dos voluntários em não utilizarem outros produtos para o controle químico do biofilme dental durante o período experimental. 6) Fluxo salivar estimulado >0,7mL/min. 7) Ausência de patologia sistêmica. 8) Ter acesso à água fluoretada. 1) Estar em tratamento odontológico. 2) Ser alérgico a algum produto/medicamento utilizado na pesquisa. 3) Alterações anátomo-patológicas da mucosa oral ou presença de agravos sistêmicos com manifestações orais. 4) Utilização de bochechos ou géis fluoretados / antimicrobianos até 14 dias prévios ao início da utilização dos aparelhos palatinos, e entre as fases do estudo. 5) Gestantes/ Lactantes. 6) Utilização de antibióticos até 3 meses prévios ao início do experimento. 7) Desordens alimentares. Figura 1 Critérios de inclusão e exclusão Os blocos de esmalte (n=540) foram obtidos a partir de terceiros molares humanos totalmente inclusos e extraídos por indicação clínica. Após a exodontia, os dentes foram estocados em solução de formaldeído 2% (ph 7,0) pelo período mínimo de um mês (WHITE, 1987). Secções foram realizadas nas faces vestibular e lingual dos molares, utilizando-se discos diamantados dupla face (KG). No final, os espécimes obtidos apresentaram dimensões de 3x3x3 mm (CURY et al., 2000),

25 24 aferidos com paquímetro (Starret, modelo 727). Até o momento de sua utilização, os mesmos foram mantidos em água deionizada. Destes, foram sorteadas 180 unidades para a obtenção dos valores baseline da microdureza e os restantes foram randomicamente destinados aos dispositivos palatinos. Para a confecção dos dispositivos intrabucais, os voluntários foram moldados com alginato (Jeltrate Plus TM ) e os modelos vazados em gesso pedra (Herodent). Sobre os modelos, os dispositivos foram confeccionados em resina acrílica quimicamente ativada (OrtoClas, artigos odontológicos clássicos Ltda, Brasil). A fixação dos blocos de esmalte nos dispositivos foi realizada com cera utilidade (Epoxiglass Ind. Com. de Produtos Químicos, Brasil). Em seguida, os mesmos foram cobertos com uma tela plástica, a qual foi posicionada a 1mm destes, a fim de propiciar o acúmulo do biofilme (BENELLI et al., 1993; CURY et al., 1997). Os voluntários utilizaram aparelhos palatinos contendo 6 blocos de esmalte dental humano durante 24 h diárias (Figura 2 A, B e C). Figura 2 Dispositivo palatino (A Blocos de esmalte inseridos e fixados com cera; B Blocos recobertos com tela plástica; C Posicionamento do dispositivo palatino in situ). Esse estudo in situ foi constituído de duas fases de 14 dias cada, conforme estudo de Paes Leme et al. (2004). Os blocos de esmalte foram submetidos ao

26 25 desafio cariogênico (DC) e tratamentos, de acordo com o grupo experimental ao qual pertenciam: (1) DC+Controle (C); (2) DC+NaF 0,05%; (3) DC+EEP 5%; (4) DC+NaF 0,05% + EEP 5%; (5) DC+Flúor-Fosfato-Acidulado 1,23% (FFA ), conforme o desenho do estudo (Figura 3). Baseline da MECT (n=180 blocos) Seleção dos blocos de esmalte (n=540) Confecção dos aparelhos palatinos (n=360 blocos) HB com DNF ANÁLISES M1 MECT1 Seleção dos voluntários Distribuição randômica em 5 grupos FASE 1 (14 DIAS) DC em todos os grupos Wash out (10 dias) HB com DF FASE 2 (14 DIAS) Grupo 1 (n=6) DC+C HB com DNF Grupo 2(n=6) DC +NaF 0,05% Grupo 3 (n=6) DC+EEP 5% Grupo 4 (n=6) DC+ NaF 0,05% + EEP 5% Grupo 5 (n=6) DC+FFA (1,23%) ANÁLISES M2 MECT2 Estatística Figura 3 Desenho do estudo MECT: microdureza do esmalte em corte transversal; MECT1:microdureza do esmalte em corte transversal na Fase 1; MECT2: microdureza do esmalte em corte transversal na Fase 2; M1: análise microbiológica na Fase 1; M2: análise microbiológica na Fase 2; DC:desafio cariogênico; HB: higiene bucal; DNF: dentifrício não fluoretado; DF:dentifrício fluoretado; C: controle; EEP: extrato etanólico de própolis; FFA:flúor fosfato acidulado. Durante o experimento, os voluntários realizaram higiene bucal (HB) com dentifrício não-fluoretado (DNF), exceto os do grupo 1, que utilizaram dentifrício

27 26 fluoretado (DF) durante a Fase 2. O DC consistiu em se gotejar sacarose 20%, 8 vezes ao dia (CURY et al., 2000) sobre os blocos de esmalte fixados nos dispositivos palatinos durante as fases experimentais. Ao final da Fase 1, os blocos de esmalte foram removidos e realizou-se a análise microbiológica do biofilme cariogênico e a mensuração da microdureza em corte transversal. Após o período wash out (10 dias), iniciou-se a Fase 2, em que novos blocos de esmalte foram submetidos ao DC e aos tratamentos de cada grupo experimental. Novamente, realizou-se análise microbiológica e da microdureza em corte transversal. Nos grupos 2, 3 e 4, duas gotas das soluções-teste foram gotejadas sobre os blocos de esmalte após a última higienização bucal diária, e no grupo 5, foi realizada Aplicação tópica de flúor (ATF) com FFA 1,23% após a última higienização bucal do 7 e do 14 dia. 4.3 Obtenção do EEP A Concentração Bactericida Mínima (CBM) do EEP foi obtida pela técnica da diluição. O ensaio demonstrou que o extrato foi bactericida na concentração de 1%, enquanto nos tubos controle não foi verificado efeito antibacteriano. Devido às características inerentes ao meio bucal, optou-se pelo uso do extrato na concentração 5 vezes superior à CBM (ZÁRATE-PEREIRA, 2003). Para a preparação da solução, utilizaram-se 892g de própolis (tipo verde), originada da espécie botânica Baccharis dracunculifolia (alecrim do campo), a qual, até a preparação dos extratos, foi armazenada em sacos plásticos hermeticamente fechados, sob temperatura de 4ºC. Após trituração manual, foi acrescentado etanol PA (CHEMCO, Brasil) e a solução levada ao ultrassom (THORNTON T14, USA) para extração de seus constituintes. Procedeu-se a filtragem em papel absorvente e acrescentou-se etanol PA (CHEMCO, Brasil) de forma a cobrir o precipitado, sendo novamente levado ao ultrassom. Esse processo foi repetido 5 vezes e o precipitado obtido foi levado ao rotaevaporador (FISATOM, USA) para remoção do etanol, obtendo-se o extrato etanólico bruto da própolis (EEBP), com massa de 405g. A este, foi acrescentado hexano para separação da parte apolar da polar, a qual contém os constituintes moleculares de classe antimicrobiana flavonóides e terpenos. Foi preparada uma solução com água destilada e álcool de cereais PA

28 27 (80:20), acrescentando 50g de própolis (somente com a porção polar) em 1000mL dessa solução, obtendo-se o EEP 5 %. 4.4 Análise microbiológica do biofilme cariogênico Ao final de cada fase, doze horas após a última exposição às soluções, a tela que cobria os blocos de esmalte foi removida. O biofilme acumulado foi retirado com bolinhas de algodão autoclavadas e as mesmas transferidas para tubos de ensaio contendo 3mL de meio de transporte VMGA III, após a liquefação deste em estufa (37 C, 30 minutos). Após homogeinização, realizaram-se diluições seriadas em água peptonada até 10 3 de cada uma das 6 amostras de biofilme coletadas de cada voluntário. Alíquotas de 0,1mL de cada diluição foram inoculadas em mitis salivarius agar (Difco; Sparks, Md., USA) para contagem de Streptococcus totais; mitis salivarius agar (Difco; Sparks, Md., USA) acrescido de 0.2 unidades de bacitracina/ml (GOLD et al., 1973) para contagem de Streptococcus mutans; ágar Brucella suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro, hemina (5µg/mL) e vitamina K (2,5µg/mL), para contagem de microrganismos totais viáveis; e ágar SL Rogosa (Difco; Sparks, Md., USA) para determinação das UFC de lactobacilos. Após a incubação (37 C, 48 horas), efetuaram-se as contagens das UFC características (UFC/mg de biofilme), com auxílio de microscópio esteroscópico (INALH, México). 4.5 Análise da microdureza em corte transversal Após a remoção dos blocos dos dispositivos palatinos, estes foram embutidos em suportes plásticos com resina quimicamente ativada, de modo que uma das faces laterais ficasse exposta (Figura 4), possibilitando a realização do ensaio de microdureza em corte transversal. Com esse intuito, os espécimes foram levados à politriz (Struers), onde foram polidos com discos de lixa d água (granulações 120, 240, 600 e 1200), sob refrigeração. Em seguida, o polimento final foi realizado, com a utilização de discos de feltro com 3µm e 1µm de granulação, durante 1 minuto (ZÁRATE-PEREIRA, 2003).

29 28 Figura 4 Blocos de esmalte preparados para o ensaio de microdureza Para a obtenção dos valores baseline e após cada fase experimental, a microdureza de cada bloco dos 5 grupos foi mensurada a 50, 100 e 150µm da superfície, com um penetrador de diamante para dureza Knoop, em microdurômetro (Shimadzu Micro Hardness Tester HMV-2, Shimadzu Corporation Figura 5). Em cada profundidade, foram realizadas 3 edentações (9 por bloco), com o penetrador paralelo à superfície externa do esmalte e carga de 25g/5 segundos (CURY et al., 2000). Figura 5 - Shimadzu Micro Hardness Tester HMV-2 (Fonte: Shimadzu Corporation)

30 Análise estatística A comparação entre as fases 1 e 2, em relação à análise microbiológica e à microdureza foi realizada por meio do teste t-student pareado. O teste ANOVA de uma via e o pós-teste de Tukey foram utilizados para a comparação entre os grupos experimentais em relação às variáveis dependentes, ganho mineral e recuperação da microdureza. A correlação linear entre os microrganismos pesquisados e a microdureza do esmalte foi verificada pelo teste de Correlação Linear de Pearson. A análise estatística foi realizada utilizando o software SigmaStat (versão 2.0), considerando, na comparação entre fases e grupos experimentais, nível de significância de 5%. Para o cálculo do Ganho Mineral (GM) e da Recuperação da Microdureza (RM) foram utilizadas as seguintes fórmulas, respectivamente: GM = (100[MECT2 MECT1 ]) MECT1 Onde: RM= (100[MECT2 MECT1 ]) (BMECT- MECT1) MECT1 = valor da microdureza do esmalte em corte transversal na Fase 1. MECT2 = valor da microdureza do esmalte em corte transversal na Fase 2. BMECT = valor baseline da microdureza do esmalte em corte transversal, por profundidade.

31 MTV LB ST SM 30 5 RESULTADOS A Tabela 1 demonstra a análise microbiológica do biofilme bacteriano dental nas diferentes fases experimentais do estudo. Tabela 1- Média (± DP) de UFC dos diferentes microrganismos conforme o grupo e fase experimentais Variável Grupos Fase 1 2 P (1) (entre fases) Controle 66,14±3,96b 53,36±2,57a 0,003 NaF 0,05% 72,50±2,01a 54,44±1,16a <0,001 EEP 5% 71,47±1,78a 39,89±0,36b <0,001 NaF 0,05% + EEP 5% 70,25±0,67ab 23,67±1,28c <0,001 FFA 71,00±4,00a 44,00±1,12b <0,001 p (2) (entre grupos) 0,006 <0,001 Controle 82,58±3,87a 71,08±1,41a 0,001 NaF 0,05% 86,33±8,54a 53,78±2,12b <0,001 EEP 5% 85,64±2,51a 41,55±1,78c <0,001 NaF 0,05% + EEP 5% 85,70±4,22a 18,59±0,76d <0,001 FFA 83,84±3,08a 19,20±1,33d <0,001 p (2) (entre grupos) 0,667 <0,001 Controle 40,25±0,62a 35,22±0,96a <0,001 NaF 0,05% 39,83±0,65a 34,06±0,83a <0,001 EEP 5% 39,56±0,85a 24,89±0,58c <0,001 NaF 0,05% + EEP 5% 40,56±1,62a 15,14±1,01d <0,001 FFA 39,75±0,74a 27,03±1,35b <0,001 p (2) (entre grupos) 0,398 <0,001 Controle 120,78±1,38a 113,03±1,92a <0,001 NaF 0,05% 120,08±1,26a 104,58±0,83b <0,001 EEP 5% 120,78±1,10a 89,89±0,34c <0,001 NaF 0,05% + EEP 5% 120,20±1,24a 66,64±2,94d <0,001 FFA 120,28±0,87a 90,25±1,43c <0,001 p (2) (entre grupos) 0,754 <0,001 (1) Valor descritivo para o teste t de student pareado; (2 ) Valor descritivo para o teste ANOVA (Uma Via) e Pós-Teste de Tukey; abcd= letras diferentes (diferença significativa) e letras iguais (ausência de diferença significativa); UFC: unidades formadoras de colônias; SM: Streptococcus mutans; ET: estreptococos totais; LB: lactobacilos; MTV: microrganismos totais viáveis.

32 31 Os dados apresentados na Tabela 1 revelam o melhor desempenho da terapia de associação na supressão das contagens bacterianas de SM, LB e MTV (p< 0,001). Para a diminuição dos níveis de ST, a terapia de associação foi efetiva e semelhante à do FFA (p< 0,001). Os valores da microdureza do esmalte em corte transversal nas diferentes profundidades estão representados na Tabela 2. Tabela 2- Média (± DP) da microdureza do esmalte em corte transversal conforme a profundidade, grupo e fases experimentais Profundidade Grupos Fase 1 2 p(1) (entre fases) Baseline 376,19±2,52a Controle 198,08±0,23b 208,58±2,41f <0, m NaF 0,05% 197,00±1,25b 295,31±1,76e <0,001 EEP 5% 197,39±2,15b 309,81±0,40d <0,001 NaF 0,05%+EEP 5% 196,53±4,00b 364,86±1,26a <0,001 FFA 196,31±3,81b 324,83±3,37c <0,001 p (2) (entre grupos) <0,001 <0,001 Baseline 354,12±14,26a Controle 240,78±1,12b 233,31±0,64c <0, m NaF 0,05% 241,64±0,76b 301,20±0,98b <0,001 EEP 5% 240,72±1,54b 300,39±0,47c <0,001 NaF 0,05%+EEP 5% 240,55±1,64b 339,22±1,44a <0,001 FFA 240,92±1,63b 303,81±5,46b <0,001 p (2) (entre grupos) <0,001 <0,001 Baseline 341,72±1,90a Controle 262,25±1,68bc 252,45±1,88d <0, m NaF 0,05% 262,64±1,84b 250,36±2,42d <0,001 EEP 5% 262,95±3,42b 260,89±0,95b 0,291 NaF 0,05%+EEP 5% 261,22±5,38bc 294,64±4,74b <0,001 FFA 258,70±4,68c 261,89±1,88c 0,207 p (2) (entre grupos) <0,001 <0,001 (1) Valor descritivo para o teste t de student pareado; (2) Valor descritivo para o teste ANOVA (Uma Via) e Pós-Teste de Tukey; abcd= letras diferentes (diferença significativa) e letras iguais (ausência de diferença significativa).

33 32 Na Tabela 2, evidenciou-se, em relação aos valores baseline, a diminuição da microdureza do esmalte na Fase 1 e aumento desta na Fase 2 (p<0,001) principalmente aos 50 e 100 m de profundidade, com destaque para o efeito da terapia combinatória inclusive aos 150 m de profundidade (p<0,001). A Tabela 3 apresenta os dados sobre o ganho mineral e recuperação da microdureza dos blocos de esmalte. A Figura 6 representa a relação entre a microdureza do esmalte (50µm superficiais) e os microrganismos avaliados. Tabela 3 Médias e desvios - padrão do ganho mineral (GM) e recuperação da Microdureza do esmalte (RM) conforme a profundidade e grupos experimentais Profundidade Grupos Variável GM (%) RM (%) Controle 5,30±1,21e 5,89±1,34e NaF 0,05% 49,91±1,65d 54,86±1,19d 50 m EEP 5% 56,97±1,86c 62,87±0,60c NaF 0,05%+ EEP 5% 85,72±4,03a 93,69±0,76a FFA 65,51±2,37b 71,46±0,90b p (1) (entre grupos) <0,001 <0,001 Controle -3,10±0,62c -6,60±1,40c NaF 0,05% 24,65±0,60b 52,95±0,96b 100 m EEP 5% 24,79±0,82b 52,61±0,74b NaF 0,05%+EEP 5% 41,02±0,72a 86,89±1,15a FFA 26,12±3,06b 55,50±5,31b p (1) (entre grupos) <0,001 <0,001 Controle -3,74±1,03c -12,39±3,56c NaF 0,05% -4,67±1,04d -15,57±3,72d 150 m EEP 5% -0,77±1,62bc -2,81±5,43bc NaF 0,05%+EEP 5% 12,84±3,38a 41,21±8,04a FFA 1,26±2,11b 3,57±6,31b p (1) (entre grupos) <0,001 <0,001 (1) Valor descritivo para o teste ANOVA (Uma Via) e Pós-Teste de Tukey; abcd= letras diferentes (diferença significativa) e letras iguais (ausência de diferença significativa).

34 33 Na Tabela 3, observou-se que, em todas as profundidades do esmalte testadas, a associação NaF 0,05% + EEP 5% foi a mais efetiva tanto no que se refere ao GM quanto à RM (p<0,001). A verificação da interferência da inibição do biofilme com o reequilíbrio mineral é demonstrada no gráfico de Correlação Linear. Figura 6 Correlação linear entre a microdureza do esmalte (50µm de profundidade) e microrganismos testados

35 34 6 DISCUSSÃO Esse estudo foi capaz de simular a dinâmica do processo DES-RE, o que foi verificado pela redução da microdureza do esmalte em corte transversal nas três profundidades avaliadas (50, 100 e 150µm), quando este foi submetido ao desafio cariogênico (Tabela 2). A análise microbiológica do biofilme cariogênico (Tabela 1) demonstrou que, entre as Fases 1 e 2, houve diminuição significativa nas contagens de todos os microrganismos pesquisados, sendo as diferenças entre os grupos evidenciadas na seguinte ordem: NaF 0,05%+ EEP 5% > EEP 5% > FFA > NaF 0,05% > controle. Essa ordem somente foi invertida para os estreptococos totais, observando-se: NaF 0,05%+ EEP 5% > FFA > EEP 5% >NaF 0,05% > controle. Esses resultados reiteram que os EEP são eficientes antibacterianos (IKENO; MIYASAWA, 1991; GEBARA et al., 1996; STEINBERG et al.,1996; OTA et al., 1998; KOO et al., 2000ab; KOO et al., 2003; KOO et al., 2005; ALMEIDA et al. 2006) e que a sua associação ao NaF 0,05% potencializa essa característica (KOO et al, 2003; KOO et al., 2005; DUARTE et al., 2006; KOO, 2008; KOO; JEON, 2009), tendo em vista que houve diferença significativa entre o grupo das soluções associadas em relação aos grupos que as utilizaram separadamente. É importante destacar que, nos blocos que receberam NaF 1,23% (grupo 5), as contagens bacterianas foram superiores em relação às do grupo 4 (NaF0,05%+EEP5%), provavelmente devido a algum efeito sinérgico oriundo dessa associação, tendo em vista a característica cariostática do primeiro. Pela análise do esmalte (Tabela 2), verificou-se aumento no valor da microdureza na Fase 2 e entre os grupos, em todas as profundidades do esmalte, o que concorda com estudos prévios (GIAMALIA et al., 1999; ZÁRATE-PEREIRA, 2003). Esse aumento foi mais evidente nos 50µm superficiais, profundidade em que houve diferença significativa entre todos os grupos e entre as duas fases, com melhor desempenho da solução de NaF0,05%+EEP5%, seguida do FFA, EEP5%, NaF0,5% e controle. Tanto nos 50 quanto aos 100µm, a exposição à terapia de combinação proporcionou o retorno da microdureza a valores muito próximos aos do baseline dessa variável nas respectivas profundidades, o que demonstra a efetividade relevante dessa associação no que se refere ao reequilíbrio mineral do esmalte. Assim, a presença constante do NaF 0,05% (tendo em vista que, durante o

36 35 experimento, as aplicações dessa solução foram diárias) e em baixos níveis no ambiente bucal, promoveu a precipitação de minerais na superfície externa do esmalte de maneira ininterrupta (FEATHERSTONE, 1999), em adição à ação bactericida do EEP5%, explicaria seu efeito otimizado em relação, principalmente ao FFA e, também, às outras soluções. Em relação ao ganho mineral (GM) e recuperação da microdureza (RM), ambos demonstrados na Tabela 3, observou-se diferença estatisticamente significativa entre todos os grupos experimentais, destacando-se o efeito da terapia de associação (NaF0,05%+EEP5%) em todas as profundidades do esmalte, o que é explicado pelo fato de que os componentes encontrados no EEP têm ação sobre fatores de virulência das bactérias cariogênicas que interferem tanto em seu metabolismo quanto na formação do biofilme dental (KOO et al., 2002; KOO et al., 2003; KOO et al., 2005; KOO, 2008; KOO; JEON, 2009), causando alterações na estrutura e na fase líquida deste, implicando comprovada diminuição no número de UFC/mg placa e, possivelmente, uma maior difusão das soluções antimicrobiana e remineralizante, de modo a reequilibrar o processo DES-RE na interface biofilmeesmalte, favorecendo a remineralização (representada pelo GM e RM). O paradigma do processo de cárie compreende esta como uma doença biofilme-dependente. Há que se considerar que houve correlação linear significativa entre o aumento da microdureza do esmalte e a diminuição da quantidade de todos os microrganismos presentes no biofilme pesquisado (Figura 6), e não somente das bactérias cariogênicas. Nesse caso, a correlação linear foi negativa, evidenciando um perfil inversamente proporcional entre o valor da microdureza obtido após os tratamentos e o número de microrganismos presentes no biofilme. Dessa forma, infere-se que a ação dos agentes de controle químico do biofilme utilizados nesse estudo foi devida à desorganização da biomassa microbiana como um todo, e não como resultado do efeito dos agentes sobre microorganismos cárie específicos. Esses achados sustentam a idéia de que, em situações de alto desafio/risco cariogênico, os fluoretos, quando utilizados isoladamente para o reequilíbrio do processo DES-RE, podem não desempenhar sua função de maneira otimizada (OGAARD et al., 1994; FEATHERSTONE, 2009; ten CATE, 2009), o que é compensado pela utilização da terapia de combinação (KOO et al., 2003; KOO et al., 2005; DUARTE et al., 2006; KOO, 2008; KOO; JEON, 2009). Nesse sentido, a possibilidade de utilizar baixos níveis de fluoreto adicionados a antimicrobianos que