TÉCNICAS DE COAGULAÇÃO

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1 S DE COAGULAÇÃO INTRODUÇÃO As provas de coagulação exigem cuidados de ordem técnica para que os resultados obtidos sejam os mais exatos e reprodutíveis possíveis: a) a lesão tecidual decorrente da punção venosa deve ser mínima; b) as seringas e os frascos de acondicionamento de sangue e plasma devem ser plásticos ou siliconizados; c) os coagulantes de escolha são o CITRATO DE SÓDIO usado na proporção de uma parte de anticoagulante para nove partes de sangue; d) o plasma deve ser separado em até 30 minutos após a coleta e, dependendo da prova a ser executada, pode ser congelado por 4 horas, no máximo; e) realizar os testes em duplicata e em paralelo, com um controle normal de plasma. 1. PROVA DO LAÇO (Fragilidade Capilar) PRINCÍPIO A Prova do Laço ou Prova de Fragilidade Capilar, é um teste que procura avaliar a capacidade dos vasos de resistirem a uma pressão. Em última análise, a prova avalia uma das funções pertinentes à parte vascular da hemostasia. a) delimitar uma área de aproximadamente 5 cm 2 no antebraço do paciente, marcando-se os sinais e manchas existentes (pintas, petéquias existentes, etc.); b) determinar a pressão arterial do paciente (máxima e mínima) e manter o manguito do aparelho no valor médio entre as pressões máxima e mínima, desde que esse valor não ultrapasse a 100 mm de Hg. Caso isso ocorra, a pressão deve ser mantida em 100 mm de Hg; c) o manguito do aparelho deve ser mantido na pressão obtida em b), por 5 minutos; d) retirar o aparelho e contar as petéquias (apresentam-se em forma de pontos vermelhos-rutilante); e) a prova é considerada POSITIVA quando forem contadas mais de 4 petéquias na área delimitada

2 2. TEMPO DE SANGRAMENTO (Método de Duke) PRINCÍPIO O Tempo de Sangramento (T.S.) avalia a capacidade de se processar a hemostasia após o vaso ter sido lesado. O T.S. depende da função plaquetária e da integridade funcional do vaso. O método mais comumente utilizado é o de Duke, em que é feita uma incisão, de tamanho padronizado, medindo-se a seguir o tempo decorrido até que cessar o sangramento, intervindo apenas os fatores plaquetário e vascular. a) realizar assepsia do lóbulo da orelha (pode-se usar também a polpa digital) com algodão embebido em álcool e deixar evaporar; b) com auxílio de uma lanceta específica e de um só golpe, fazer uma incisão local, com cerca de 2 mm de profundidade; disparar o cronômetro; c) a cada 30 segundos recolher a gota de sangue em papel de filtro (tendo o cuidado de que o mesmo não toque o lóbulo ou a polpa), até que a última gota deixe apenas um sinal puntiforme no papel; d) anotar o tempo decorrido entre a primeira e a última gota recolhidas. Valor Normal: de 1 a 3 minutos. INTERPRETAÇÃO O Tempo de Sangramento é um teste indicativo de distúrbios plaquetários ( em relação ao número à funcionalidade das mesmas) e de alterações da integridade vascular. As alterações mais evidentes do Tempo de Sangramento são encontradas nas púrpuras trombocitopênicas e trombopáticas.

3 3. TEMPO DE COAGULAÇÃO DO SANGUE TOTAL (Método de Lee-White) PRINCÍPIO O Tempo de Coagulação (T.C.) mede o tempo necessário para que o sangue coagule in vitro. a) proceder à punção venosa, procurando lesar os tecidos, o mínimo possível ; b) disparar o cronômetro, assim que o sangue entrar na seringa; c) separar 3 tubos de ensaio (10 x 120 mm), colocar 1 ml de sangue em cada um e levá-los imediatamente em banho à 37ºC; d) 3 minutos após a coleta, iniciar a observação do tubo 1, inclinando-o suavemente; repetir essa observação a cada 30 segundos até que o sangue coagule. Marcar o tempo transcorrido desde a coleta até a formação do coágulo; e) proceder do mesmo modo com os tubos 2 e 3; f) o Tempo de Coagulação será o obtido pela média dos tempos encontrados nos 3 tubos, Valor Normal: de 4 a 9 minutos. INTERPRETAÇÃO O Tempo de Coagulação é uma prova pouco sensível para detectarem-se alterações no sistema global da coagulação. Um prolongamento do Tempo de Coagulação pode ser causado por Hipofibrinogenemia, por deficiência de alguns dos fatores do sistema intrínseco e pela presença de anticoagulantes circulantes. O T.C. é largamente empregado como método de controle de terapia com anticoagulantes, especialmente no caso da heparina. 4. RETRAÇÃO DO COÁGULO (Método de Mac-Farlane)

4 PRINCÍPIO Após a coagulação do sangue, o coágulo formado retrai-se ou mais precisamente, retrai-se a rede de fibrina, retendo os elementos figurados do sangue e liberando a parte líquida, o soro. A retração do coágulo é devida à liberação de substâncias, pelas plaquetas localizadas nos pontos de intersecção das malhas da rede de fibrina, O volume de soro liberado, é expresso percentualmente em relação ao volume inicial do sangue que se deixou coagular. A retração de coágulo está relacionada diretamente ao número e à funcionalidade das plaquetas e inversamente proporcional ao grau de anemia. a) transferir cerca de 5 ml de sangue, sem anticoagulantes para um tubo cônico graduado, cujas paredes foram previamente umedecidas com solução fisiológica; b) fechar o tubo com uma rolha provida de um fio de arame com a ponta retorcida em anzol ; c) após a coagulação do sangue, colocar o tubo em banho à 37ºC por 1 hora; d) ler, a seguir, o volume total ( coágulo e soro). Com o auxílio do fio de arame, retirar cuidadosamente o coágulo retraído; ler o volume final do soro. CÁLCULO: % de retração = Vol. soro x Hematócrito do paciente Vol. total x Hematócrito normal (*) (*) Consultar tabela. Valor Normal: de 45 a 55%

5 5. TEMPO DE PROTROMBINA (Tempo de Quick de um estágio) O teste do Tempo de Protrombina avalia a atividade coagulante do sistema extrínseco, incluindo a protrombina (ou seja, todo o complexo da protrombina ) e o fibrinogênio. a) a um tubo de 12 x 75 mm, previamente mantido a 37ºC, pipetar 0,1 ml de tromboplastina e 0,1 ml de plasma (a tromboplastina é ativada, mantendo-se à 37ºC por 5 minutos); b) homogeneizar delicadamente, deixando por cerca de 20 segundos no banho a 37ºC; c) adicionar 0,1 ml de CaCl 2 M/40, disparando simultaneamente o cronômetro; d) deixar em repouso cerca de 8 segundos e a seguir iniciar a observação do desenvolvimento da rede de fibrina (indica o ponto final da retração). Valor Normal: de 10 a 14 segundos ( 70 a 100% de atividade). OBSERVAÇÃO Pode-se usar, alternativamente, tromboplastina a que foi adicionado previamente cálcio e, nesse caso, colocam-se 0,2 ml de tromboplastina-cálcica e 0,1 ml do plasma. Os reagentes (Tromboplastina, CaCl 2 ) e tubos, devem estar à 37ºC. INTERPRETAÇÃO O reagente tromboplástico tissular utilizado no teste não contém os fatores V, VII e X, que devem ser fornecidos pelo plasma do paciente, juntamente com a protrombina e o fibrinogênio. Assim, a deficiência ou ausência de qualquer um desses fatores, resulta em um prolongamento do Tempo de Protrombina. Admitindo-se que o fibrinogênio esteja em concentração normal, o prolongamento do Tempo de Protrombina deve-se à deficiência de alguns dos fatores do complexo da Protrombina, O Tempo de Protrombina pode encontrar-se alongado nos seguintes casos: presença de anticoagulantes circulantes, na deficiência de vitamina K e nas hepatopatias de um modo geral.

6 5.1 ATIVIDADE PROTROMBÍNICA A atividade protrombínica do material é avaliada através do tempo (em segundos) e de uma curva de atividade (previamente preparada para cada lote da tromboplastina utilizada). PREPARO DA CURVA DE ATIVIDADE Faz-se uma mistura (pool) de pelo menos 3 plasmas normais obtidos do mesmo modo; distribui-se em 10 tubos da seguinte maneira: Tubos = Pool plasma (ml) = 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Sol. Fisiológica (ml) = 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Atividade (%) = Com a mesma tromboplastina determina-se o Tempo de Protrombina de cada um dos tubos; o tempo do tubo l corresponde à 100% de atividade (*). Valor Normal: 70 a 100% de atividade. Obs.: O sangue não deve ter mais do que 4 horas de coleta (fatores, como o V, degradam-se, mesmo mantendo-se o sangue em congelador). (*) Uma preparação de tromboplastina é considerada de boa qualidade, quando o seu 100% de atividade, frente a um pool de plasmas normais, corresponder a um Tempo de Protrombina entre 12 e 14 segundos.

7 6. TEMPO DE RECALCIFICAÇÃO DO PLASMA (T.R.P.) PRINCÍPIO A adição de íons cálcio ao plasma (ou sangue) citratado, desencadeia o processo da coagulação, visto que, com exceção dos íons cálcio (complexados pelo citrato), o plasma deve conter todos os fatores plasmáticos da coagulação. O teste avalia todo o sistema de coagulação, principalmente o sistema intrínseco. a) a um tubo mantido previamente a 37 C adicionar 0,2 ml de plasma e 0,2 ml de CaCl 2 M/40. Disparar o cronômetro, homogenizar; b) deixar em repouso em banho à 37 C, por 30 segundos e a seguir iniciar a observação da formação de fibrina, inclinando-se levemente o tubo; c) marcar o tempo decorrido até a formação da fibrina. Valor Normal: 80 a 120 segundos. INTERPRETAÇÃO O TRP encontra-se alterado nos casos de deficiência de um ou mais dos fatores V, VIII, IX, X, XI e XII, avaliando ainda a Protrombina (II), o Fibrinogênio (I) e a presença de anticoagulantes. O resultado é altamente influenciável pelo número de plaquetas existentes no plasma

8 7. TEMPO DE CEFALINA OU TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL (T.T.P.) Trata-se de uma prova de recalcificação na qual, a fim de eliminar-se a influências das plaquetas (visto que o número das mesmas interfere no TRP), adiciona-se uma quantidade ótima de fosfolipídeos ( cefalina ou tromboplastina, por ex.). Técnica a. pipetar para um tubo de ensaio, 0,l ml de plasma (pobre em plaquetas) e 0,l ml de cefalina. Homogenizar; b. incubar por l20 segundos em banho à 37 C, agitando a mistura a cada l0 segundos; c. adicionar 0,l ml de CaCl 2 M / 40 ; disparar o cronômetro: d. marcar o tempo de coagulação ( tempo de formação da fibrina). Valor normal: 40 a 60 segundos. INTERPRETAÇÃO O TTPA é uma prova sensível para avaliar alterações no processo da coagulação. O alongamento do TTPA, é indicativo de alteração dos fatores V, VII, IX, X, II e I, ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.

9 8. TEMPO DE TROMBOPLASTINAPARCIAL ATIVADA (TTPA) OU TEMPO DE KAOLIN-CEFALINA O TTPA também consiste em uma prova de recalcificação em que as variáveis constituídas pelo número de plaquetas e pelo grau de ativação dos fatores XI e XII são eliminadas através da adição de um fosfolípede e de um ativador (celite ou caolin, por exemplo). Com a adição dessas substâncias, conseguem-se resultados mais reprodutíveis e uma sensibilidade maior do que nas determinações do T.R.P. e T.T.P. a) em um tubo de ensaio, previamente aquecido a 37ºC, pipetar 1 ml de cefalina; incubar a 37ºC por 1 minuto; b) a seguir, adicionar 0,1 ml de caolin; após 2 minutos recalcificar com 0,1 ml de CaCl 2 e disparar o cronômetro; c) marcar o tempo de formação de fibrina; d) colocar 0,1 ml de plasma a um tubo mantido previamente a 37º C. Incubar por 1 minuto. e) adicionar 0,2 ml da mistura cefalina-caolin; incubar por 3 minutos; f) adicionar 0,1 ml de CaCl2 M / 40; disparar o cronômetro; g) marcar o tempo de formação da fibrina. INTERPRETAÇÃO O TTPA é uma prova sensível para avaliar alterações no processo de coagulação. O alongamento do TTPA é indicativo de alteração dos fatores V, VII, IX, X, II e I, ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.

10 9. FIBRINOGÊNIO (Método de Ratnoff-Menzie) PRINCÍPIO O fibrinogênio do plasma pode ser separado das demais proteínas plasmáticas pela sua transformação em fibrina: submete-se a fibrina à digestão em meio alcalino, havendo liberação de aminoácidos, entre os quais, a tirosina. Esta pode ser dosada através da medida de intensidade da cor azul que se desenvolve com o reativo de Folin-Ciocalteau. a) colocar em tubo de ensaio de 20 x 200mm; 1-10 ml de solução fisiológica 2-0,5 ml de plasma 3-0,05 ml de trombina (25 U/ml) 4- bastão de vidro; b) girar o bastão mergulhado na solução. Utilizando-se a trombina, a coagulação se processa em 2 ou 3 minutos. Com o decorrer da coagulação, os fios de fibrina aderem ao bastão. Embora a reação possa se desenvolver à temperatura ambiente, a mesma se processa mais eficientemente quando realizada à 37ºC; assim, deve-se manter o tubo da reação em banho à 37ºC, por 30 minutos, girando-se o bastão a cada 5-10 minutos, de tal forma que a fibrina se enovele no bastão. c) desprezar a solução contida no tubo e lavá-lo 3 vezes com solução fisiológica para eliminar qualquer interferente. O bastão deve ser retirado e lavado 3 vezes com jatos de solução fisiológica; o coágulo aderido deve ser comprimido cuidadosamente em papel de filtro, após cada lavagem. d) recolocar o bastão no tubo, com a fibrina aderida ; adicionar ao tubo 1,0 ml de NaOH a 10%. Colocar o tubo em Banho-Maria por 10 minutos, tomando-se o cuidado de cobrí-lo com papel alumínio, para evitar evaporação. e) após o resfriamento do tubo em temperatura ambiente, adicionar sucessivamente e na ordem: 1-7,0 ml de H 2 O destilada 2-3,0 ml de Na 2 CO 3 a 20%. Agitar 3-1,0 ml de reativo de Folin (diluído 1/3 em H 2 O). Agitar; f) deixar em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Ler em espectrofotômetro à 650 nm contra um branco, preparando da seguinte maneira: Branco: - 1,0 ml de NaOH 10% - 7,0 ml de água destilada - 2,0 ml dena2co3 20% - agitar - 1,0 ml de Reativo de Folin Deixar em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos;

11 g) a D.O. da cor desenvolvida no sistema a dosar, é diretamente proporcional à concentração de fibrinogênio ou tirosina, até a quantidade de 0,35 mg de tirosina (caso a intensidade da cor obtida for superior àquela obtida com 0,35 mg, diluir a solução e fazer o cálculo proporcional); h) a quantidade de tirosina correspondente à leitura é determinada em uma curva padrão de tirosina. Para a conversão da quantidade de tirosina em fibrina, multiplica-se o valor obtido, pela constante que é a quantidade de tirosina contida na fibrina, em função do teor de Nitrogênio. Faz-se o cálculo de mg% de fibrinogênio em função da quantidade de plasma usada para a dosagem (ex.: se usarmos 0,5 ml de plasma, multiplicamos por 200). Valor Normal: 165 a 485 mg% Padrão 1- preparar, a partir da solução estoque de tirosina (20 mg% em HCl 0,1N), uma solução de uso ¼ (uma parte de solução padrão e 3 partes de água destilada); 2- pipetar para um tubo: - 1,0 ml da solução de tirosina ¼ - 6,0 ml de água destilada - 1 ml de NaOH 10% - 3,0 ml de Na 2 CO 3 20% - agitar - 1 ml de Folin - agitar.

12 RECOMENDAÇÕES DOS LIMITES TERAPÊUTICOS DA ANTICOAGULAÇÃO ORAL (8) INR INDICAÇÃO VALOR ALVO VALORES LIMITES Profilaxia do tromboelismo 2,5 2-3 venoso (cirurgia de alto risco) Tratamento de trombose venosa profunda prevenção da embolia em pacientes com fibrilação atrial, doença cardíaca valvular ou válvulas biológicas. Profilaxia de tromboelismo venoso (cirurgia de quadril) Embolismo sistêmico recorrente. 3,5 3-4, 5 Prótese valvular cardíaca.