COLETA, CONSERVAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS DESTINADAS AO COAGULOGRAMA PONTOS CRÍTICOS PRÉ-ANALÍTICOS NO DIAGNÓSTICO DE DISTÚRBIOS DE COAGULAÇÃO

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1 COLETA, CONSERVAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS DESTINADAS AO COAGULOGRAMA PONTOS CRÍTICOS PRÉ-ANALÍTICOS NO DIAGNÓSTICO DE DISTÚRBIOS DE COAGULAÇÃO 1. INTRODUÇÃO Os exames de coagulação são amplamente utilizados na prática médica veterinária. Sua solicitação está indicada para a avaliação da hemostasia por meio dos exames convencionais incluídos no coagulograma e na investigação de doenças hemorrágicas e trombóticas. Em associação com outros exames complementares laboratoriais, o coagulograma é também um exame de triagem muito realizado na rotina de pré-operatórios. 2. COAGULOGRAMA No perfil coagulograma estão inclusos os seguintes testes: tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), tempo de protrombina (TP) e dosagem de fibrinogênio. É um eficiente método de análise do sistema de coagulação como um todo, o TP avalia a deficiência de fatores envolvidos na via extrínseca ou comum da cascata de coagulação, enquanto o TTPA avalia o sistema intrínseco e comum da cascata de coagulação. Portanto, como ambos avaliam indiretamente a via comum, devem ser utilizados em conjunto para se chegar a uma melhor interpretação de resultados, da seguinte forma: TTPA aumentado e TP normal indicam alteração da via intrínseca; TTPA normal e TP aumentado indicam alteração na via extrínseca; e, ambos os tempos aumentados indicam alteração da via comum ou de vários fatores concomitantemente (por exemplo, insuficiência hepática). O fibrinogênio é uma proteína de fase aguda positiva, consumido durante a coagulação à medida que é convertido em fibrina pela trombina, avaliando, portanto, a via comum da cascata de coagulação. Figura 1: Representação esquemática da cascata de coagulação conforme avaliada pelos testes de triagem da coagulação in vitro do perfil coagulograma. A formação de fibrina é o ponto final de cada teste. Fonte: STOCKHAM e SCOTT, 2011.

2 3. FATORES PRÉ-ANALÍTICOS DETERMINANTES É muito importante conhecer os fatores que afetam a qualidade da amostra antes do início dos testes de coagulação para obtenção de resultados confiáveis e de qualidade, mesmo que todo o processo de controle de qualidade esteja satisfatório. As decisões e conclusões que seguem os resultados de exames só serão válidas se os fatores pré-analíticos forem confiáveis. Sendo assim, é indispensável o conhecimento sobre o preparo do paciente, a coleta, o transporte e a manipulação das amostras, sempre seguindo procedimentos determinados e que foram validados pelo laboratório COLETA E CONSERVAÇÃO DAS AMOSTRAS Para a coleta desses exames, é fundamental que o médico veterinário esteja devidamente treinado e capacitado para a função, pois são exames sensíveis, e qualquer falha na técnica pode afetar diretamente seus resultados, além de ter um papel importante na qualidade do processo. O citrato de sódio é um quelante de cálcio que reage com o cálcio livre do sangue formando sais insolúveis. A ausência de cálcio livre impede a efetivação do mecanismo de coagulação sanguínea. É o anticoagulante mais utilizado para conservação dos exames que avaliam a coagulação e que necessitam do uso do plasma do paciente. As amostras para os testes de coagulação devem ser coletadas em tubos contendo citrato de sódio a 3,2%, respeitando a proporção de 9 partes de sangue total para 1 parte de anticoagulante e o preenchimento estabelecido no próprio tubo. Se a proporção não for respeitada (preenchimento abaixo ou acima do nível do tubo), pode haver resultados inadequados para testes dependentes de cálcio. Amostras citratadas em excesso podem apresentar atividade de coagulação reduzida (tempos prolongados) ao passo que amostras subcitratadas, podem ser hipercoaguláveis (tempos reduzidos). Mesmo com volume correto de sangue, o hematócrito (Ht) pode afetar o resultado de TP e TTPA. Na vigência de anemia (Ht<25%), o plasma pode ser subcitradado porque há excesso plasma para a mesma qualidade de citrato, podendo resultar em tempos de coagulação falsamente mais curtos. Já na presença de eritrocitose (Ht > 55%), o plasma pode ser citratado em excesso, porque há menos plasma com a mesma concentração de citrato, o que pode prolongar o tempo de coagulação. Nestes casos é recomendado recalcular a concentração de citrato de sódio necessária para anticoagular volumes de sangue com hematócritos alterados. O mais indicado para coleta, são materiais que contenham vácuo, diminuindo a manipulação das amostras, uma vez que a agitação mecânica excessiva pode contribuir para a ativação da coagulação. Após a coleta, as amostras devem ser homogeneizadas, gentilmente, por inversão de 5 a 10 vezes, para garantir o contato de toda a amostra com o anticoagulante. Amostras coaguladas ou com formação de agregados de fibrina são inadequadas para realização dos testes. Amostras hemolisadas, por fatores in vitro, também não devem ser testadas, pois existe a possibilidade da cascata de coagulação e das plaquetas terem sido ativadas pelos mesmos fatores responsáveis pela hemólise.

3 Figura 2: Tubos para coleta de sangue à vácuo contendo citrato de sódio a 3,2%. Fonte: google imagens. A comunicação com a área técnica laboratorial, caso haja alguma intercorrência no momento da coleta, é importante para uma adequada análise crítica dos resultados e para avaliar se as alterações foram decorrentes de problemas pré-analíticos. Nesse caso, é fundamental que seja feita uma nova coleta. Após a coleta do sangue, as amostras devem ser armazenadas em local adequado ou devem ser imediatamente encaminhadas para processamento, de acordo com o fluxo já definido pelo responsável do setor de coleta. Uma boa recomendação caso a amostra não seja imediatamente encaminhada para processamento, é, na primeira hora após a coleta, centrifugar a amostra de sangue total para separar somente o plasma e estocá-lo. A centrifugação deve ser feita em alta rotação e por tempo aproximado de 10 a 15 minutos, para evitar o excesso de plaquetas remanescentes no plasma. Na centrifugação inadequada, com presença de plaqueta acima de /mm³, ocorre liberação de fator plaquetário 4 (PF4), levando à possíveis alterações de resultados ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DAS AMOSTRAS Com relação a estabilidade e ao armazenamento de amostras para exames de coagulação, é importante seguir algumas orientações básicas e obrigatórias. Em geral, as amostras para teste de TTPA são menos estáveis do que para a realização do TP. Para TP, o sangue total é estável à temperatura ambiente por quatro horas, e o plasma, à temperatura ambiente (24 C) por 24 horas, sob refrigeração (4 C) até 48horas, podendo ocasionalmente quando necessário, ser congelado (-70 C) por duas semanas. Em contrapartida, o teste TTPA deve ser priorizado, uma vez que amostras armazenadas em condições não padronizadas podem degradar-se rapidamente, levando a um resultado falsamente alterado. As amostras de sangue total destinadas ao teste de TTPA, devem ser encaminhadas para processamento em até 4horas, ao mesmo tempo que, o plasma, à temperatura ambiente (24 C), é estável por 12 horas e, sob refrigeração (4 C), por até 24horas. Em diversos estudos consultados, as amostras congeladas designadas para TTPA, apresentaram diferenças significativas nos resultados normais e prolongados, quando processadas em 6 e 12 horas após a coleta. Sendo o congelamento, portanto, um meio inadequado para armazenar amostras de plasma destinadas a testes de TTPA. Em contraste com o TP e TTPA, as variações induzidas pelo armazenamento e congelação nos níveis de fibrinogênio se apresentaram mínimas e irrelevantes para a interpretação clínica. As alterações relevantes na concentração do fibrinogênio ocorreram apenas em amostras armazenadas por mais de 18 meses.

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS Em síntese, para uma avaliação eficiente da cascata de coagulação como um todo, o coagulograma (TP, TTPA e Fibrinogênio) deve ser realizado em conjunto, preferecialmente no plasma citratado fresco, podendo ser adequadamente armazenado sob refrigeração (4 C) por até 24horas. Estes cuidados são fundamentais para garantir acurácia no resultado de todos os exames. Resultados deturpados em decorrência de condições pré-analíticas inadequadas, alterariam a interpretação clínica, comprometendo gravemente o diagnóstico de distúrbios de coagulação. Exames disponibilizados pelo TECSA para diagnóstico de distúrbios hemostáticos CÓD. EXAME AMOSTRA PRAZO 591 Perfil coagulograma Sangue total colhido em tubo com citrato de 1 dia 346 Tempo de protrombina (TP) Sangue total colhido em tubo com citrato de 1 dia 347 Tempo de tromboplastina Sangue total colhido em tubo com citrato de 1 dia parcial ativada (TTPA) 186 Fibrinogênio Sangue total colhido em tubo com citrato de 1 dia 43 Contagem de plaquetas Sangue total colhido em tubo com EDTA 1 dia (tampa roxa) 39 Hemograma completo Sangue total colhido em tubo com EDTA 0 dia (tampa roxa) 333 Perfil hepático Soro 1 dia REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALESCI, S.; BORGGREFE, M. C.; DEMPFLE, E. Effect of freezing method and storage at 20 C and 70 C on prothrombin time, aptt and plasmafibrinogen levels. Thrombosis Research, 124, Elsevier Ltd, 2009, p PAES, P.R.O.; LEME, F.O.P.; CARNEIRO, R. A. Hematologia dos Animais Domésticos. Belo Horizonte: FEPMVZ, p. STOCKHAM, L. S.; SCOTT, M. A. Fundamentos de Patologia Clínica Veterinária. 2.Ed. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan, p RAO, L.V.; et al. Stability of prothrombin time and activated partial thromboplastin time tests under different storage conditions. Clinica Chimica Acta, 300, 2000 p RIZZO, F.; et al. Measurement of prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) on canine citrated plasma samples following different storage conditions. Research in Veterinary Science, 85, 2008, p

5 EQUIPE DE VETERINÁRIOS - TECSA Laboratórios Primeiro Lab. Veterinário certificado ISO9001 da América Latina. Credenciado no MAPA. PABX: (31) sac@tecsa.com.br RT - Dr. Luiz Eduardo Ristow CRMV MG 3708 Facebook: Tecsa Laboratorios INDIQUE ESTA DICA TECSA PARA UM AMIGO Você recebeu este Informativo Técnico, pois acreditamos ser de seu interesse. Caso queira cancelar o envio de futuros s das DICAS TECSA (Boletim de Informações e Dicas), por favor responda a esta mensagem com a palavra CANCELAMENTO no campo ASSUNTO do .