Unidade II: Métodos de Estudo em Biologia Celular

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1 Unidade II: Métodos de Estudo em Biologia Celular Disciplina: Biologia Celular e Molecular Centro de Ciências da Saúde Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini marilanda.bellini@usc.br Pró Reitoria de Pesquisa e de Pós Graduação Bloco L : Midelburg, Holanda Hans e Zacharias Janssen; Lentes Convexas; Aumento de 9 vezes; 25 cm 5 cm Conteúdo II. Limite e poder de resolução 1612, Itália: Galileu Galilei III. Planos de Corte 20 cm IV. Microscopia a) de luz b) eletrônica a.c.: 1ª. Lente Sir Austin Henry Layard (1847) Escavações em Ninive (antiga Mesopotâmia) Lente de cristal plano-convexa, entalhada em pedra bruta. 1665: Inglaterra; Robert Hooke Pedaços de Cortiça(tecido vegetal morto) Compartimentos vazios. Célula, do latim cella cavidade

2 Court Collection, Science Museum Livro: Microphagia Orchidae 1833 Robert Brown Em cada célula da epiderme... uma única aréola, geralmente mais opaca que a membrana da célula, é observável... Essa aréola, ou núcleo da célula como talvez possa ser cunhado,não está confinada à epiderme(brown, 1833, p. 710) pt.wikipedia.org/wiki/robert_brown 1674, Holanda: Anton van Leeuwenhoek Descreveu protozoários, bactérias, espermatozóides e células sanguíneas Células Vivas Apenas 1 lente convexa Pequeno (cabia na mão) Aumento de 275 vezes 1877, Alemanha: Karl Abbe e Carl Zeiss: Desenho otimizado; Óleo de Imersão; Microscópio de Luz: 0,2µm limite teórico : Marcelo Malpighi Introdução da microscopia à medicina; Estudo anatômico dos capilares; Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena, interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso a nenhum médico 1882 Walther Fleming Anilina (corante básico) Estruturas Altamente Basófilas Cromatina Cromossomos Fases da Divisão Celular 2

3 07/03/2012 II. Poder de Resolução X Limite de Resolução Bom microscópio: 1) Poder de Resolução (PR): Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com detalhes mínimos IV. Microscópio Do Grego: micron= Pequeno skopein = Observar 2) Limite de Resolução (LR): Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser individualizados na imagem final > PR < LR II. Poder de Resolução X Limite de Resolução Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio IV. Microscópio Fundamento: Sistema combinado de lentes, que são colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto. ou Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos distintos do objeto (< LR) maior será a definição da imagem formada no aparelho ( > PR). III. Planos de Cortes Interação da Luz com o espécime Absorção Refração Produção de imagens aumentadas de objetos não visualizados à olho nú; IV. Microscópio de Luz Planos de cortes Fonte luminosa luz branca (tungstênio) Óptica lentes ampliação condensação Mecânica Imagem microscópio = bidimensional Sistema de iluminação Objeto de estudo = tridimensional 3

4 IV. Microscópio de Luz Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho IV. Microscópio de Luz Princípios da formação da imagem ao ML Imagem II objeto Imagem I F F F C C C Fonte de luz condensadora objetiva ocular Fonte de luz Lente condensadora Lentes objetivas Lente ocular O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida 4

5 07/03/2012 IV. Microscópios de Luz IV. Microscópios de Luz Trajetória da Luz Centralização do feixe de luz Iluminação de Köhler (aula Prática) Aumento Final Iluminação perfeita Menos ocorrência de aberrações e irregularidades no trajeto luminoso IV. Microscópios de Luz IV. Microscópios de Luz Objetiva (s) = próxima ao objeto Corrige aberrações = qualidade da imagem Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática Projeta imagem real e invertida Objetivas 4x = Vermelha 10x = Amarela 40x = Azul claro Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão) IV. Microscópios de Luz Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva 100x = Preta / branca IV. Microscópios de Luz Abertura Numérica 4X Aumentos: 10x, 12x 10X 40X AN = n.senα AN = Abertura numérica n = Índice de refração do meio de montagem sen = Fornecido pelo fabricante da lente A = Ângulo de abertura da objetiva 100X AN = 0,12 (4x) AN = 0,34 (10x) AN = 0,60 (40x) AN = acima de 1 (100x) α = Ângulo correspondente à metade de A 5

6 IV. Tipos de Microscópios Microscopia de Luz Microscopia convencional Microscopia de contraste de fase Microscopia de contraste interferencial Microscopia de campo escuro Microscopia de polarização Microscopia de fluorescência Microscopia confocal a laser Microscopia eletrônica Microscopia eletrônica de transmissão Microscopia eletrônica de alta voltagem Microscopia eletrônica de varredura IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase Aplicação: Análise do material biológico sem coloração prévia: 1. Culturas de células 2. Exames parasitológicos Diferenças de índices 3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios) de refração 4. Sangue 5. Protozoários de ambientes aquáticos 6. Algas 7. Bactérias Outros tipos de microscópio Microscopia de tunelamento quântico Microscopia de força atômica Sem coloração Bactérias Cultura de células: neurônios IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase Análise do material com coloração prévia Princípios da Difração da Luz Anéis metálicos colocados no caminho da luz (Zerniké, 1950) Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase) Retardo óptico e Refração da luz Esfregaço de Sangue Divisão Celular em Raiz de Cebola IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial 2º Anel 1º Anel Prismas ópticos posicionados no caminho da luz 6

7 IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial Os prismas modificam a fase da onda luminosa Contraste com o meio em que se encontra o material a ser analisado Cultura Celular: macrófago Ácaro IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial IV. Microscopia de Luz: Polarização Microscopia de Normarski Princípio Defasagem dos comprimentos de onda Gera uma deformação na imagem Permite contraste interferencial Aumentando o relevo das superfícies do material analisado 2 Filtros ou Prismas: 1º Polarizador Entre a fonte de luz e o condensador 2º Analisador Entre a objetiva e a ocular Filtros: Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das ondas luminosas Plano da luz polarizada (PLP) Observação: Microscopia de luz comum feixe de ondas luminosas direção de vibração em todos os planos IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial IV. Microscopia de Luz: Polarização Aplicações: Observação de materiais biológicos sem coloração: 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos parasitos (taxonomia) 2. Análise de massa seca celular organização e compactação de material biológico 3. Monitoramento de culturas celulares 2 Filtros ou Prismas: Algas Escamas 7

8 07/03/2012 IV. Microscopia de Luz: Polarização IV. Microscopia de Luz: Polarização Exemplos: Colágeno - Xylidine Ponceau - Picro-sirius Birrefringência pode ser intensificada por corantes 2º Cromatina / Matriz Extracelular - Azul de toluidina (ordem e agregação molecular ) PLP 1º Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras de colágeno: intensa birrefringência / brilhante / amarelo) IV. Microscopia de Luz: Polarização Aplicações da Microscopia de Polarização IV. Microscopia de Luz: Polarização Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada 1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina 2. Análise de células que apresentem organização interna de suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética, espermatozóides (ordem molecular) 3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente 4. Análise de componentes cristalinos dos minerais 5. Outros: parede celular; amido. Tecido ósseo : sistema de Havers ou ósteon / fibras colágenas IV. Microscopia de Luz: Polarização Tecido ósseo Tecido ósseo: osso esponjoso / fibras colágenas IV. Microscopia de Luz: Campo Escuro Condensador - inclina a luz de tal modo que ela não atravessa o objeto A luz se dispersa Apenas os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema (objetivas e oculares) Grãos de Amido 8

9 IV. Microscopia de Luz: Campo Escuro É empregada para estudos de pequenos materiais: Plâncton Bactérias Cristais Estruturas subcelulares (fimbrias e flagelos) Grãos de pólen Outros componentes: Se ligam a substâncias fluorescentes fluorocromos emitem brilho contra fundo escuro DNA - verde Alaranjado de acridina (fluorocromo) RNA - vermelho Microscopia de campo escuro da bactéria Leptospira spp Divisão celular Células do testículo de triatomíneos 1. Sistema óptico interage com pouca luz: Propriedade física de algumas substâncias absorverem a luz, em um determinado comprimento de onda, e emitirem luz com comprimentos de onda maiores e níveis energéticos mais baixos Microscopia de fluorescência mostrando uma célula embrionária de Caenorhabditis elegans em divisão Luz de mercúrio de alta pressão 2. Sistemas de filtros requeridos para detectar o brilho do material contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem) Fonte de luz Fótons Filtro de excitação (seleciona os fótons de determinado comprimento) Objeto Emite luz fluorescente Filtro de barragem (luz de excitação é bloqueada) Imagem observada (formada pela luz que atravessa o filtro de barragem) Ocular Objetiva b. Filtro de barragem Fonte de luz a. Filtro de excitação Fluorescência natural: Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente fluorescentes Clorofila Lignina de parede vegetal Elastina Colágeno A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma e as algas vermelhas no seu intestino Algas (clorofila) 9

10 Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência Sem coloração IV. Microscópios Princípios da formação da imagem ao Microscópio Diferenças de índices de refração Fluorocromos: Alaranjado de acridina Eosina DAPI Rodamina Fluoresceina Emitem brilho contra fundo escuro Com coloração Com coloração fluorescente Cores de interferência Campo escuro IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser Identificação de compostos naturalmente fluorescentes Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que permite identificação de moléculas específicas Imunocitoquímica Hibridação in situ (FISH) Disponível mundialmente; Utiliza laser como fonte de luz; Visualização: materiais espessos; corpos inteiros sem coloração prévia (vivos ou pré-fixados); Reconstrução do objeto 3D Vários planos focais ou cortes ópticos (programas computacionais). IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser Aplicações: 1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência convencional; 2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos; 3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos finos da matriz extracelular 10

11 IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser IV. Microscopia Eletrônica Início: Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons Primeiros experimentos: Década de 1920 Busch (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas) Semelhantes a fótons num sistema de vácuo Células em prófase Células em apoptose: condrócitos 1931 Ruska Primeiro M.E. Poder de resolução: 0,5 nm 25 mil vezes a capacidade do olho humano Ernst August Friedrich Ruska IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser IV. Microscopia Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica Protozoário Macrófago Questões importantes: Ampliação e Resolução IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser Principais diferenças Divisão celular / Fuso mitótico Grãos de Pólen Fonte Luz (porção inferior) Elétrons (porção superior) Lentes Vidro Eletromagnéticas Lentes de aumento (principal) Suporte para amostra Limite de resolução Formação da imagem Microscópio de luz (ML) Objetivas e oculares Lâmina de vidro Eletromagnéticas Grade de metal (telinha)cobre ou níquel 0,2 µ 0,0002 µ Transparência e coloração Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Variações de densidade e contrastação 11

12 IV. Microscopia Eletrônica IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão (MET) O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que os elétrons tinham comportamento ondulatório semelhante aos fótons de luz. Imagem final ao MET Eletrodensa (escura) os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro Eletrolúcida (clara) os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão (MET) Coloração negativa: vírus Tecido muscular Cílio Células epiteliais Hepátócito: Complexo de Golgi IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão (MET) Fixação (glutaraldeído / tetróxido) Desidratação Inclusão (resinas) Cortes Principais etapas da preparação das amostras para MET IV. Microscopia Eletrônica: Varredura (MEV) Scanning Electron Microscopy (SEM) Revela feições topográficas da superfície (detalhes) Imagens tridimensionais: - Vermes - Insetos - Células livres (animais/vegetais) - Embriões - Fragmentos geológicos Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra Contrastação com metais pesados Guelras de um peixe 12

13 07/03/2012 IV. Microscopia Eletrônica: Varredura (MEV) Scanning Electron Microscopy (SEM) Preparação das Amostras: Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio;) Desidratação; Secagem ( ponto crítico ); IV. Microscopia Eletrônica: de Alta Voltagem ou Alta Aceleração Descrição de estruturas subcelulares (µ) Ex.: Citoesqueleto Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares - Alta aceleração eletrônica (500 a KV) - Permite estudos de corte grossos - Reconstrução tridimensional Evaporação com ouro na superfície a ser analisada; Não necessita de contrastação. IV. Microscopia Eletrônica: Varredura (MEV) Scanning Electron Microscopy (SEM) IV. Microscopia Eletrônica: Tunelamento Quântico Década de 1980 Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física Princípio: todos os corpos: - Características ondulatórias - Emissão de energia Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) IV. Microscopia Eletrônica: Tunelamento Quântico Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å (1 milionésimo de mm) Agulha: percorre a superfície da amostra corrente elétrica (tunelamento) Corrente atrai elétrons do material para a agulha tunel Agulha passa sobre um átomo corrente Agulha percorre os espaços entre os átomos corrente Title: An Army of One" Category: Photo Microscopy Photographer: Freder Medina Esses sinais ( e ) são transmitidos para o computador imagens à superfície de vales e montanhas 13

14 IV. Microscopia Eletrônica: Tunelamento Quântico IV. Microscopia Eletrônica: de Força Atômica Luciano Paulino da Silva, (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia) 2º. lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica. Molécula de miosina Cromossomos 1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET) = ESTRUTURA ATÔMICA Superfície das células vermelhas do sangue depois do tratamento com peptídeos antibióticos, Única imagem não européia premiada dentre as mais de 250 inscritas. O prêmio visa o reconhecimento da importância das imagens de microscopia para os avanços da nanotecnologia em todo o mundo. Reportagem publicada no dia 10/09/2007 IV. Microscopia Eletrônica: de Força Atômica É semelhante ao Microscópio de Tunelamento Quântico Diferença: - Presença de microespelho - Feixe de laser sobre a agulha Menor agressividade à amostra Detecção de detalhes de superfície Aplicações: - Obtenção de imagens em solução - Sequências de reações químicas ou modificações estruturais ao longo do tempo - Estrutura atômica de biomoléculas IV. Microscopia Eletrônica: de Força Atômica Bibliografia Sugerida CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. A célula São Paulo: Manole, Capítulo 2 JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, Capítulo 2 De ROBERTIS, E. M. F.; HIB, J. Bases da biologia celular e molecular. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, Imagem de uma plaqueta obtida por microscopia de força atómica Imagem de eritrócitos obtida por microscopia de força atómica ALBERTS, B. et al. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: Artmed, Material Disponível em: 14