INOCULAÇÃO ARTIFICIAL DE SEMENTES DE SOJA POR FUNGOS, UTILIZANDO SOLUÇÃO DE MANITOL 1

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1 95 INOCULAÇÃO ARTIFICIAL DE SEMENTES DE SOJA POR FUNGOS, UTILIZANDO SOLUÇÃO DE MANITOL 1 JOSÉ CRUZ MACHADO 1, JOÃO ALMIR OLIVEIRA 3, MARIA GRAÇAS G.C. VIEIRA 4 E MARCELO C. ALVES 5 RESUMO - O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia de inoculação de sementes de soja com os fungos Colletotrichum truncatum, Phomopsis sojae e Sclerotinia sclerotiorum por meio da técnica de restrição hídrica de modo a obter sementes infectadas por estes patógenos. O trabalho consistiu na exposição das sementes às colônias fúngicas em desenvolvimento em meio BDA (extrato de batata + dextrose e agar), em potenciais hídricos 0,0; -0,4; -0,6; -0,8 e -1,0MPa, obtidos por meio do uso de manitol em diferentes concentrações. Após o período de incubação para cada potencial osmótico, a 25 o C, estabelecido com base no início do processo de germinação, as sementes eram removidas das placas de Petri e submetidas aos testes de germinação, emergência e sanidade. A inoculação das sementes nos potenciais hídricos mais elevados proporcionou os maiores índices de plantas doentes sem afetar negativamente a germinação das sementes. Durante o período de incubação, a protrusão radicular foi eficazmente impedida pela restrição hídrica nos potenciais mais elevados. Termos para indexação: restrição hídrica, inoculação de sementes, Glycine max. ARTIFICIAL INOCULATION OF FUNGI IN SOYBEAN SEEDS USING MANITOL SOLUTION ABSTRACT - The objective of this work was to develop a method to inoculate seeds of soybean with Colletotrichum truncatum, Phomopsis sojae and Sclerotinia sclerotiorum, so as to obtain infected seeds using water restriction technology. The work consisted of exposing seeds to growing colonies of the fungi on PDA medium amended with mannitol at concentrations producing osmotic potentials of 0.0; -0.4; -0.6; -0.8 and -1.0MPa. Seeds were placed on developing fungal colonies on PDA medium for different periods of incubation at 25 o C. After each incubation period seeds were removed from the Petri dishes and submitted to germination, emergency and seed health testings. Inoculation of seeds at higher osmotic potentials presented the highest levels of diseased seedlings without affecting adversely the germination of seeds. During the exposition of seeds to the fungi, radicle protrusion from seeds was impeded by water restriction at the highest potentials. Index terms: water restriction, inoculation of seeds, Glycine max. INTRODUÇÃO 1 Aceito para publicação em ; trabalho desenvolvido com apoio de CNPq/FAPEMIG. 2 Eng o Agr o, Ph.D., Prof. do Depto. de Fitopatologia/UFLA; bolsista do CNPq; machado@ufla.br 3 Biólogo, Dr. Pesquisador/UFLA; prof. bolsista do CNPq. 4 Eng a Agr a, Dra., Prof. do Depto. de Agricultura/UFLA; bolsista do CNPq; mariagvc@ufla.br 5 Graduando em Agronomia; bolsista do CNPq. As sementes são importantes veículos de agentes fitopatogênicos, que podem ser levados ao campo e provocarem redução na germinação e vigor, originando focos primários de doença. A maioria das doenças de importância econômica que ocorre na cultura da soja é causada por patógenos que são transmitidos pelas sementes, dentre eles merecem destaque: Phomopsis sp. (causador do cancro da haste da soja, seca da haste e da vagem da soja e da deterioração de sementes), Colletotrichum truncatum (causador da antracnose) e Sclerotinia sclerotiorum (causador da podridão branca da haste e da vagem) (Goulart, 1997). Os prejuízos causados por estes fungos, à cultura da soja, têm exigido estudos mais pormenorizados das relações entre patógenos e hospedeiro. No entanto, pelas dificuldades de obter sementes com diferentes níveis de infecção por estes patógenos, a inoculação artificial das sementes torna-se ne-

2 96 J.C. MACHADO et al. cessário. Os métodos existentes de inoculação não apresentam eficácia no sentido de se obter níveis desejáveis de infecção. Consistem em inocular esporos dos fungos diretamente nas plantas já adultas, ou em sementes secas. A inoculação de fungos em plantas, já em desenvolvimento, apresenta alguns inconvenientes não só em termos de período de tempo que este método requer como pelos riscos determinados por fatores não controlados durante o desenvolvimento das plantas. Machado & Carvalho (1975) observaram que inoculação de Colletotrichum truncatum, em plantas de soja, de diferentes cultivares, realizada aos 30 e 35 dias após a floração levou a ocorrência de índices de 18 a 40% desse fungo, nas sementes colhidas ao final do ciclo da cultura. No método da inoculação de fungos diretamente em sementes, por meio da imersão destas em suspensão de esporos, os fungos ficam apenas aderidos ao tegumento das sementes, não se caracterizando o processo de infecção e sim contaminação. Vieira (1988) comenta que embebição de sementes de soja em suspensão de ascosporos de Sclerotinia sclerotiorum, visando avaliar resistência varietal gerou reações influenciadas pela causa e do nível de deterioração das sementes inoculadas. A inoculação de sementes por contato direto com os fungos em meio agarizado (BDA), pode determinar níveis insatisfatórios de infecção, pelo fato de limitar o tempo de permanência das sementes junto ao meio, visto que as sementes podem iniciar o processo de germinação em curto período de tempo. Neste sentido, Peres (1996) verificou que a inoculação de sementes de soja, pelo contato destas com colônias de Sclerotinia sclerotiorum, em meio BDA por 30 horas de exposição, apresentou uma contaminação entre 35 a 100%. O crescente interesse em tratamentos que envolvem o início das atividades pré-germinativas, levou ao desenvolvimento de vários estudos envolvendo técnicas que permitem controlar a hidratação e a germinação das sementes. Entre estes estudos, destaca-se a técnica do condicionamento osmótico, relatada para sementes de diferentes espécies (Eira, 1988; Guimarães, 1991 e Braccini, 1996), também referida como priming (Heydeckeret et al., 1975), condicionamento fisiológico (Doni-Filho, 1992 e Vazquez, 1995), entre outras denominações. A técnica do condicionamento osmótico consiste em colocar as sementes em contato com um substrato, com o potencial hídrico ajustado para que a semente absorva água até um nível, em que todos os processos preparatórios à germinação ocorram, sem contudo, atingir a fase de elongamento celular e, conseqüentemente, a emissão da radícula (Heydecker et al., 1975 e Bradford, 1986). Vários produtos já foram utilizados para o ajuste do potencial hídrico de substratos em estudos envolvendo o condicionamento osmótico de sementes de diferentes espécies. Entre estes citase sais como MgSO 4, NaCl, MgCl 2, K 3 PO 4 m KH 2 PO 4, glicerol, manitol e polietileno glicol (Pill, 1994). Carvalho (1999) mostrou que o uso da restrição hídrica em meio BDA com manitol foi eficaz na inoculação de Colletotrichum lindemuthianum em sementes de feijão, já que o período de exposição das sementes ao inóculo do fungo pôde ser aumentado, havendo também neste caso estímulo ao crescimento radial das colônias fúngicas até a restrição hídrica de -0,8MPa. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade do uso da técnica de restrição hídrica na inoculação de sementes de soja pelos fungos Colletotrichum truncatum, Phomopsis sojae e Sclerotinia sclerotiorum visando à obtenção de sementes infectadas por estes patógenos. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido no Laboratório de Patologia de Sementes do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras - MG, no ano de As sementes utilizadas foram da cultivar Doko safra 98/99, previamente esterilizadas superficialmente com hipoclorito de sódio a 1% por um minuto seguidas de lavagem rápida em água esterilizada e secadas à sombra. Em seguida, as mesmas foram submetidas aos testes de germinação e sanidade, para checagem de sua qualidade. Os fungos C. truncatum, P. sojae e S. sclerotiorum, foram isolados de sementes de soja em análises de rotina do teste de sanidade, no Laboratório de Patologia de Sementes da UFLA. O meio de cultura básico utilizado neste trabalho foi o BDA (extrato de 200g de batata, 20g de dextrose e 20g de ágar), ao qual foi adicionado o soluto manitol nos potenciais hídricos 0,0; -0,4; -0,6; -0,8 e -1,0MPa. As concentrações dos solutos para o preparo dos meios, em cada potencial hídrico, foram obtidas por meio da fórmula de Van t Hoff (Salisbury & Ross, 1991): Po = -CiRT, onde: Po = Potencial osmótico (MPa); I = Constante de ionização; R = Constante geral dos gases (0,00831 x Kg x MPa x mol -1 x K -1 ); T = Temperatura absoluta (ºC + 273); C = Concentração (moles/kg de água). Após a adição de manitol em cada concentração ao meio BDA procedeu-se à autoclavagem e a distribuição do mesmo em placa de Petri de 15cm de diâmetro na proporção de 50ml por placa. Três discos repicados da colônia pura de cada fungo foram transferidos em separado para cada placa, sendo

3 97 utilizadas cinco placas para cada fungo, por potencial hídrico. As placas foram vedadas com rolopac e distribuídas ao acaso em câmara com fotoperíodo de 12 horas, e temperatura de 25ºC, por cinco dias, quando as colônias de cada fungo já haviam tomado toda a placa. Em seguida, 40g de sementes foram distribuídas sobre a colônia de cada fungo, em camada única e levemente prensadas sobre o meio, permanecendo aí por diferentes períodos de exposição, em função do potencial hídrico. Assim que pelo menos uma semente iniciava o processo de germinação, as restantes foram retiradas do meio e secadas sobre papel filtro em condições de laboratório. Os tempos de retirada das sementes foram de 48 horas para os potenciais hídricos de 0,0 e -0,4MPa e 72, 96 e 120 horas para os potenciais -0,6; -0,8 e -1,0 MPa, respectivamente. Os parâmetros avaliados foram teste de germinação, emergência de plântulas, teste de sanidade e crescimento micelial dos fungos in vitro: teste de germinação - foram utilizadas quatro repetições de 50 sementes por tratamento, acondicionadas em rolos de papel toalha, umedecidos com água destilada 2,5 vezes o peso do papel. Os rolos foram levados para um germinador regulado a 25ºC por sete dias. Na avaliação, foram computadas as porcentagens de plântulas normais, anormais e sementes mortas, segundo Brasil (1992); emergência das plântulas - foi realizada em bandejas plásticas de 47x27x08cm, contendo areia e solo misturados na proporção de 2:1, utilizando quatro repetições de 50 sementes por tratamento, semeadas na profundidade aproximada de 1,5cm. As bandejas foram distribuídas ao acaso numa sala de crescimento vegetal, à temperatura de 25ºC e fotoperíodo alternado de 12 horas. As avaliações foram realizadas aos sete e vinte e um dias após a semeadura, computando-se o número de plântulas emergidas. Aos 21 dias as plântulas foram arrancadas e analisadas quanto à presença de sintomas da doença causada por cada patógeno estudado; teste de sanidade - foram utilizadas oito repetições de 25 sementes por placa de plástico de 15cm de diâmetro, com e sem desinfestação com solução de hipoclorito de sódio 1% por um minuto. As placas foram mantidas em câmara de crescimento à 22 o C, em regime alternado de 12 horas de luz branca. A presença de cada patógeno nas sementes foi avaliada aos sete dias após a semeadura com auxílio de microscópio estereoscópico; crescimento micelial em meio de cultura osmoticamente modificado - foi utilizado meio BDA (extrato de batata-dextroseágar), no qual foi adicionado o soluto manitol nos potenciais hídricos 0,0; -0,4; -0,6; -0,8 e -1,0MPa. Após a adição de manitol em cada concentração ao meio BDA, este foi autoclavado e vertido na proporção de 20ml por placa de Petri de 9cm de diâmetro. Um disco retirado da margem da colônia pura de cada fungo foi transferido para o centro de cada placa, sendo utilizadas cinco placas para cada fungo em cada concentração. As placas foram vedadas com rolopac e distribuídas ao acaso em câmara com fotoperíodo de 12 horas, e a temperatura de 15ºC. As avaliações foram realizadas diariamente, medindo-se no verso de cada placa o crescimento micelial de cada fungo, até que a colônia ocupasse toda placa. O índice de crescimento micelial (ICM), foi determinado seguindo-se a fórmula proposta por Oliveira (1991): ICM = C 1 + C C n N 1 + N N n onde: ICM = índice de crescimento micelial; C 1, C 2, C n = crescimento micelial das colônias na primeira, segunda e última avaliação; N 1, N 2, N n = número de dias. A análise estatística foi realizada com o auxílio do procedimento ANAVA do SAS (SAS Institute Inc., 1992). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade, analisando cada potencial como uma metodologia isolada, não considerando se as análises dos valores nos intervalos. RESULTADOS E DISCUSSÃO Observa-se pela Figura 1A que a percentagem de germinação das sementes inoculadas com o fungo Colletotricum truncatum foi drasticamente reduzida em função do aumento da restrição hídrica. Provavelmente, este fato se deveu ao maior tempo de exposição das sementes ao inóculo, propiciando maior nível de infecção. No potencial -1,0MPa a germinação foi menor que 10%. A maior percentagem de plântulas com lesões ocorreu quando as sementes foram inoculadas no potencial hídrico de -0,4MPa, pois nos potenciais hídricos mais negativos, a infecção por este fungo afetou o percentual de germinação, com conseqüente aumento do número de sementes mortas. Nota-se ainda que mais de 60% de plântulas apresentaram lesões características da doença quando da incubação em meio sem restrição hídrica. Verifica-se portanto, que para fungos muito agressivos como C. truncatum, não há necessidade de prolongamento do tempo de exposição das sementes ao inóculo, visto que no menor tempo utilizado (48 horas) obteve-se quase 100% de infecção (Figura 3A). Pelos resultados da Figura 1B, vê-se que o fungo Phomopsis sojae foi também extremamente agressivo, ocasionando uma redução da germinação para menos de 20% em sementes que permaneceram em contato com inóculo no menor tempo (48 horas). Houve uma relação positiva entre

4 98 J.C. MACHADO et al. FIG. 1. Valores médios (%) de germinação ( ), plântulas com lesões ( ) e sementes mortas ( ) do teste de germinação em sementes de soja, inoculadas com Colletotrichum truncatum (A), Phomopsis sojae (B) e Sclerotinia sclerotiorum (C), em diferentes potenciais osmóticos. Médias seguidas pela mesma letra, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5%. potencial hídrico e percentual de sementes mortas, sendo que no potencial hídrico de -0,8 e -1,0MPa esse percentual foi maior que 80%. Comparando estes resultados com aqueles da Figura 1A constata-se que este fungo foi mais agressivo. Estes resultados reforçam os obtidos por Goulart (1997), que relata ser este fungo capaz de se desenvolver rapidamente nas condições em que o teste de germinação é realizado podendo afetar a germinação das sementes. Em relação a Sclerotinia sclerotiorum (Figura 1C), observa-se que houve um comportamento semelhante aos resultados da Figura 1B, ou seja, as sementes que ficaram menos tempo em contato com o inóculo do fungo apresentaram germinação abaixo de 20% e nos potenciais de -0,6; -0,8 e -1,0MPa praticamente não houve germinação, com mais de 90% de sementes mortas. Pelos resultados do teste de sanidade, nota-se que o fungo estava internamente presente nas sementes, uma vez que em mais que 90% das sementes que foram desinfectadas com hipoclorito a presença do fungo foi detectada (Figura 3C). A emergência das plântulas aos sete dias (Figura 2A) foi gradativamente reduzida com o aumento da restrição hídrica do meio em que as sementes foram inoculadas com o fungo C. truncatum, sendo que no potencial de -1,0MPa a percentagem de plântulas normais emergidas aos sete dias foi de 22%. No entanto aos 21 dias, o percentual de plântulas estabelecidas neste mesmo potencial foi praticamente nulo, nota-se também que mesmo no meio sem restritor hídrico (potencial 0), este percentual foi próximo de 30% o que sugere a alta agressividade desse fungo. Com relação ao percentual de plântulas com lesões este foi mais baixo no potencial de -1,0MPa, provavelmente em função do grande número de sementes mortas, bem como pela morte das plântulas entre a emergência e seu estabelecimento. Pelos resultados do teste de emergência de sementes de soja inoculadas com C. truncatum (Figura 2B), observa-se que o percentual de plântulas, emergidas aos sete dias, foi gradativamente reduzido à medida que o potencial hídrico do meio foi mais negativo. O estande aos 21 dias após a semeadura foi acentuadamente reduzido em relação ao das sementes não inoculadas. Esse baixo estande também ocorreu nos tratamentos em que as sementes permaneceram menor tempo em contato com o fungo (potencial 0), sendo o percentual de plântulas estabelecidas próximo de 35%. No potencial de -1,0MPa, mais de 95% das plântulas estavam com lesões do fungo. Com relação às plântulas com lesões, nota-se que à

5 99 FIG. 2. Valores médios (%) de plântulas normais aos sete ( ) e 21 ( ) dias e plântulas com lesões ( ) do teste de emergência em sementes de soja, inoculadas com Colletotrichum truncatum (A), Phomopsis sojae (B) e Sclerotinia sclerotiorum (C), em diferentes potenciais osmóticos. Médias seguidas pela mesma letra, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5%. FIG. 3. Porcentagens de Colletotrichum truncatum (A), Phomopsis sojae (B) e Sclerotinia sclerotiorum (C) detectadas pelo teste de sanidade incubação em papel de filtro, em sementes de soja, com e sem inoculação em diferentes potenciais osmóticos e desinfestadas ( ) e não desinfestadas ( ) com hipoclorito de sódio a 1%.

6 100 J.C. MACHADO et al. medida em que aumentou o potencial hídrico do meio houve redução do percentual, isto pode ser explicado pelo fato de que com o prolongamento do período de exposição das sementes ao inóculo houve um incremento no número de sementes mortas. Segundo Goulart (1997), C. truncatum é um patógeno altamente agressivo à cultura da soja, principalmente durante a fase de emergência causando tombamento das plântulas ou morte das sementes. Pelos resultados do teste de emergência em solo, nota-se que Phomopsis sojae (Figura 2B), foi mais agressivo do que o C. truncatum, posto que mesmo no meio sem restrição hídrica, somente 40% das sementes germinaram. Essa redução na emergência de plântulas foi mais evidente com a elevação do potencial hídrico do meio de inoculação. De acordo com a literatura (Goulart, 1997), esse fungo em contato com as sementes pode causar a morte da mesma ou provocar tombamento das plântulas recém-germinadas. Por sua vez, sementes inoculadas com S. sclerotiorum (Figura 2C), apresentaram um comportamento semelhante àquelas inoculadas com Phomopsis (Figura 2B), ou seja, com o aumento do tempo de exposição das sementes houve menor percentagem de emergência, sendo que no potencial -1,0MPa todas as sementes estavam mortas e no meio sem restrição hídrica apenas 20% das sementes emergiram. O teste de sanidade (Figuras 3A, 3B e 3C) das sementes de soja inoculadas com os fungos C. truncatum, P. sojae e S. sclerotiorum, revelou que, de um modo geral, houve um comportamento semelhante entre esses fungos. Mais de 90% das sementes foram infectadas mesmo quando a desinfecção superficial com hipoclorito de sódio foi realizada. Nestes casos os fungos estavam presentes nas sementes, o que foi também confirmado pelos resultados dos testes de germinação e emergência em solo onde houve um elevado percentual de plântulas com lesões e de sementes mortas. Desta forma, pode-se afirmar que a técnica de restrição hídrica do meio de inoculação é viável para infectar sementes com alguns fungos de importância econômica, uma vez que as sementes podem ficar em contato com o fungo por um maior período de tempo, sem contudo, iniciar o processo de germinação e ainda com a vantagem destas poderem posteriormente ser secadas e armazenadas por algum período de tempo. Pelo ensaio in vitro, a restrição hídrica promovida pelo manitol não inibiu o crescimento micelial dos fungos C. truncatum, P. sojae e C. sclerotiorum, em meio BDA tendo apresentado ao contrário, efeito estimulante ao crescimento micelial desses organismos quando comparado com meio sem restrição hídrica (0,0MPa). CONCLUSÕES! A restrição hídrica, até o nível de -1,0MPa determinada pelo uso de manitol em meio agar, propicia condições para um maior tempo de exposição das sementes aos patógenos e permite a obtenção de maior infecção das plântulas pelos fungos C. truncatum, S. sclerotiorum e P. sojae;! as sementes de soja inoculadas com os fungos C. truncatum, S. sclerotiorum e P. sojae em qualquer potencial hídrico utilizado são severamente afetadas. REFERÊNCIAS BRACCINI, A.L. Relação entre potencial hídrico, condicionamento osmótico e qualidade fisiológica de sementes de soja (Glycine max (L.) Merril). Viçosa: UFV, p. (Tese Doutorado). BRADFORD, K.J. Manipulation of seed water relations via osmotic priming to improve germination under stress conditions. Hortscience, Alexandria, v.21, n.5, p , BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para análise de sementes. Brasília: SNDA/DNDV/CLAV, p. CARVALHO, J.C.B. Uso da restrição hídrica na inoculação de Colletotrichum lindemuthianum em sementes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). Lavras: UFLA, p. (Dissertação Mestrado). DONI-FILHO, L. Efeito do condicionamento fisiológico no comportamento de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.). Piracicaba: ESALQ/USP, p. (Tese Doutorado). EIRA, M.T.S. Condicionamento osmótico de sementes de alface (Latuca sativa L.): efeitos sobre a germinação e desempenho sobre estresses hídrico, salino e térmico. Piracicaba: ESALQ/ USP, p. (Dissertação Mestrado). GOULART, A.C.P. Fungos em sementes de soja: detecção e importância. Dourados: EMBRAPA-CPAO, p. GUIMARÃES, R.M. Efeito do condicionamento osmótico sobre a germinação e desempenho de sementes de algodão (Gossypium hirsutum L.) sob condições ideais e de estresse térmico, hídrico e salino. Lavras: ESAL/UFLA, p. (Dissertação Mestrado). HEYDECKER, W.; HIGGINS, J. & TURNER, Y.J. Invigoration of seeds? Seed Science and Technology, Zürich, v.3, n.3, p , MACHADO, J.C. & CARVALHO, M.G. Comportamento de cultivares comerciais de soja diante de isolamentos de Colletotrichum truncatum e transmissão do patógeno pelas sementes em função da época de infecção da planta. Experientiae, Viçosa, v.19, n.7, p , NELDER, J.A. & WEDDERBURN, W.M. Generalized linear models. Journal of the Royal Statistical Society, London, v.135, n.3, p , 1972.

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