USO DA RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INOCULAÇÃO DE

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1 Curso de Agronomia Artigo Original USO DA RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INOCULAÇÃO DE Alternaria radicina EM SEMENTES DE CENOURA (Daucus carota) USE OF WATER RESTRICTION ON INOCULATION OF Alternaria radicina IN SEEDS of CARROT (Daucus carota) Tiago Bezerra Torres 1, Thiago Vinicius Pereira Leite 2 1 Aluno do Curso de Agronomia 2 Professor Doutor do Curso de Agronomia Resumo Os estudos sobre patologia de sementes requerem, em geral, a disponibilidade de lotes de sementes altamente infectadas por fitopatógenos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o uso de restrição hídrica para infecção de sementes de cenoura pelo fungo Alternaria radicina. Para os ensaios utilizou-se os seguintes tratamentos: manitol nos potenciais hídricos de 0 MPa (sem restrição T1), -0,6 MPa (T2), -0,8 MPa (T3), -1,0 MPa (T4) e -1,2 MPa (T5) em meio de cultura BDA. Após verter os meios nas placas, um disco de micélio do fungo foi depositado no centro das placas, que foram mantidas em incubadora BOD por 7 dias, a 25 C e fotoperíodo de 12 horas. Durante este período, foi avaliado diariamente o diâmetro das colônias. Em seguida, 200 sementes de cenoura, após desinfestação prévia com hipoclorito, foram depositadas sobre as colônias do fungo de cada uma das placas para a infecção. Estas foram mantidas nas mesmas condições de incubação. Os tempos de retirada das sementes foram de 48 horas para T1 e de 72, 96, 120 e 144 horas para T2; T3; T4 e T5 respectivamente. Posteriormente, as sementes foram submetidas aos testes de germinação, sanidade e emergência em bandejas. Os experimentos foram realizados em delineamento de blocos casualizados com quatro repetições e parcelas de 50 sementes. Os potenciais hídricos avaliados não interferiram no crescimento micelial do patógeno. O tratamento que promoveu maiores porcentagens de infecção sem comprometer significativamente a germinação das sementes foi o T4 (-1,0 MPa), embora o T5 (-1,2 MPa) apresentou menor porcentagem de emergência de plântulas aos 21 dias após a semeadura. Assim, conclui-se que a utilização de manitol no potencial hídrico de -1,0 MPa, nas condições avaliadas, se mostra viável para a infecção de sementes de cenoura com Alternaria radicina. Palavras-Chave: restrição hídrica; manitol; Alternaria radicina; infecção; sementes. Abstract Studies on seed pathology generally require the availability of highly batches of seeds infected with plant pathogens. Thus, the aim of this study was to evaluate the use of fluid restriction to infection of carrot seeds by the fungus Alternaria radicina. For the tests used the following treatments: mannitol in water potential of 0 MPa (without limitation T1) 0.6MPa (T2) -0.8 MPa (T3) -1.0 MPa (T4) and -1.2 (T5) in PDA culture medium. After pouring the plates means a fungal mycelium disk was placed in the center of the plates, which were maintained in BOD incubator for 7 days at 25 C and 12-hour photoperiod. During this period, it was assessed daily diameter of the colonies. Then 200 carrot seeds, after previous disinfection with hypochlorite were deposited on the fungus colonies of each plate for infection. These were kept under the same conditions of incubation. Withdrawal time s seeds were 48 hours for T1 and 72, 96, 120 and 144 hours to T2; T3; T4 and T5 respectively. Later, the seeds were submitted to germination, health and emergency trays. The experiments were conducted in a randomized block design with four replications and 50 seeds. Potential assessed water did not affect the mycelial growth of the pathogen. The treatment showed higher percentages of infection without significantly affect the germination of seeds was T4 (-1.0 MPa), while the T5 (-1.2) showed a lower percentage of seedling emergence at 21 days after sowing. Thus, it is concluded that the use of mannitol in water potential -1.0 MPa, measured in conditions shown feasible for the infection of carrot seeds with Alternaria radicina. Keywords: water restriction ; mannitol; Alternaria radicina ; infection; seeds. Contato: nip@unicesp.edu.br INTRODUÇÃO A cultura da cenoura (Daucus carota L.) é acometida por diferentes doenças responsáveis por perdas significativas, dentre estas, a queima das folhas ou podridão negra causada pelo fungo Alternaria radicina Meier, Drechsler& E.D. Eddy.

2 O patógena causa podridão das raízes e podem causar também o tombamento de plântulas (Fancelli, 1997). Uma das principais formas de disseminação do patógeno, principalmente para áreas mais distantes, se dá por meio de sementes contaminadas, na qual A. radicina pode permanecer viável por um período de até 6 anos (Soteros,1979;Pryor et al., 1997; Halfed-Vieira et al., 2000; Souza et al., 2001). Os estudos sobre controle de patógenos transmitidos por sementes requerem, em geral, a disponibilidade de sementes infectadas. Nesse sentido, é necessário o desenvolvimento de métodos eficazes que possibilitem elevadas taxas infecção das sementes. Tradicionalmente, a infecção de sementes com fungos tem sido realizada por meio dos métodos de embebição em suspensão de conídios (Pedroso et al., 2010) e pelo contato da semente com estruturas fúngicas (micélio) desenvolvidas em meios de culturas convencionais. Entretanto, segundo Tanaka & Menten (1991) e Machado et al. (2001), tais métodos não garantem a infecção da semente, visto que, o patógeno poderá estar somente aderido ao tegumento, o que seria apenas uma contaminação superficial, e não presente dentro dos tecidos da semente, o que seria a infecção. Diante o exposto, a utilização do método da restrição hídrica com manitol surge como uma alternativa para infeção de sementes, uma vez que esta inibe temporariamente a germinação da semente por períodos de incubação mais prolongados, até que o processo de infecção se estabeleça (Costa et al., 2003; Carvalho et al., 2004). Alguns trabalhos têm demostrado a eficácia desta técnica. Machado et al. (2004), utilizando meio de cultura BDA (extrato de 200g de batata, 20g de dextrose e 20g de ágar) + manitol, obtiveram maior índice de infecção de sementes de algodão com os fungos Colletotrichum gossypii, C. gossypii var. cephalosporioides, Botryodiplodia theobromae e Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum com o potencial na faixa de -0,8 a -1,0 MPa. Machado et al. (2001), usando a metodologia anterior, a infecção foi realizada a partir dos fungos Diplodia maydis, Cephalosporium acremonium e Fusarium moniliforme em sementes de Milho, foi obtido os maiores índices de infecção para os potenciais hídricos -0,8 a -1,2Mpa. Em hortaliças, embora exista indícios do método de restrição hídrica para infecção em sementes ainda é pouco estudado. Ordoñez (2016), avaliando a eficiência da restrição hídrica do manitol em meio BDA para infecção sementes de cebola com Colletotrichum gloeosporioides f. sp. cepae, as maiores taxas foram obtidas sobre os potencias -1,0 e -1,2Mpa. Pedroso et al. (2010) realizaram inoculação de sementes de salsa com Alternaria alternata e A. dauci sob dois métodos, suspensão de conídios e restrição hídrica, o último apresentou maior índice de infecção de sementes. Diante das dificuldades de se dispor de sementes de cenoura infectadas para a realização de estudos tanto na área epidemiológica como de controle, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de manitol em meio de cultura em diferentes potências hídricos, visando a maior taxa de infecção de sementes de cenouras com Alternaria radicina. MATERIAIS E MÉTODOS O trabalho foi realizado no Laboratório de Fitopatologia e na casa de vegetação, na Embrapa Hortaliças, Brasília, DF, no período de 06/11/2015 a 02/01/2016. Utilizou o fungo A. radicina isolado a partir de plantas sintomáticas de cenoura do campo experimental da Embrapa Hortaliças e cultivado em meio de cultura básico BDA (extrato de 250g de batata, 20g de dextrose e 16g de ágar). E também foram utilizadas as sementes de cenoura da cultivar Kuronan disponibilizada pelo CNPH (Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças). Avaliação do crescimento micelial da Alternaria radicina sobre a Restrição hídrica Para a avaliação do crescimento micelial foi utilizado o meio de cultura básico o BDA, ao qual foi adicionado o soluto manitol (PM 182,172 g.ml-1) e autoclavado, para obtenção dos tratamentos (BDA + manitol). As concentrações para o preparo dos meios, em cada potencial hídrico foi obtida por meio da equação proposta por Van thoff (Salisbury e Ross, 1991): em que: Po = Potencial osmótico (MPa) R = Constante geral dos gases (0,00831 kg MPa mol -1 o K -1 ) T = Temperatura absoluta ( C + 273) C = Concentração (moles / Kg de água) Para determinar as concentrações de manitol foi utilizada a temperatura de 25ºC e os potenciais: -0,6MPa, -0,8MPa, -1,0MPa e 1,2MPa. Os resultados desta operação geraram a quantidade de manitol para cada tratamento, conforme a Tabela 1.

3 Tabela 1. Tratamentos, potencial hídrico e respectivas concentrações de manitol utilizadas para o preparo do meio de cultura BDA. Tratamento Potencial hídrico (MPa) g de manitol. 250 ml BDA -1 T1 0,0 - T2-0,6 11,02 T3-0,8 14,70 T4-1,0 18,34 T5-1,2 22,04 Após a formulação dos meios dos tratamentos (BDA+ manitol), foi realizada a avaliação do crescimento micelial do fungo. Para este teste os meios modificados foram vertidos 20ml para placas de Petri de 9cm de diâmetro. Discos de agar de 7mm de diâmetro foram retirados da periferia da colônia do fungo e transferidos para o centro de cada placa, sendo utilizadas sete placas por concentração de manitol. As placas foram vedadas com rolopac e distribuídas ao acaso em câmara de incubação, com fotoperíodo de 12 horas e temperatura de 25 ºC. Foram realizadas as avaliações diariamente, medindo na base de cada placa o diâmetro da colônia do fungo até a ocupação completa da placa. O índice de crescimento micelial (ICM) foi determinado pela fórmula proposta por Oliveira, 1991: Em que: IVCM= índice de velocidade de Crescimento micelial; D= diâmetro médio atual da colônia; Da= diâmetro médio da colônia do dia anterior; N= número de dias após a inoculação; Inoculação de sementes Para esta etapa foram necessárias 800 sementes (1,928g) para cada tratamento, sendo: 200 sementes para teste de germinação, 400 sementes para teste de sanidade e 200 sementes para teste de emergência. As sementes foram desinfestadas com solução de hipoclorito de sódio a 1% por 1 minuto e lavadas com água destilada corrente e secadas à sombra. Posteriormente dividiu-se em cinco sublotes com 160 sementes (0,3856g) para cada tratamento (BDA; -0,6 MPa; - 0,8 MPa; -1,0 MPa; -1,2 MPa) armazenando-os em saquinhos plásticos. A inoculação das sementes realizou-se após a avaliação do IVCM, deste foram escolhidas cinco placas de cada tratamento. Sobre a colônia de cada um dos tratamentos, foram distribuídas 0,3856g de sementes (160 sementes) dos saquinhos plásticos e prensadas levemente sobre o meio e o fungo. Os tempos de retirada das sementes foram 48 horas para o T1 e de 72, 96, 120 e 144 horas para os respectivos T2; T3; T4 e T5. No momento em que qualquer das sementes apresentava início de protrusão radicular as sementes eram removidas do meio e colocadas para secar sobre papel-de-filtro em condições de laboratório. As sementes após a secagem foram submetidas aos testes de: germinação, emergência em solo e sanidade. Teste de germinação Foi conduzido com quatro repetições de 50 sementes que foram colocadas em caixas plásticas tipo gerbox, contendo duas folhas de papel de germinação germibox, previamente umedecidas com água destilada, em quantidade equivalente a 2,5 vezes o peso do papel. Após as montagens das caixas, estes foram levados para um germinador, à temperatura de 25ºC, onde permaneceram por sete dias. Na avaliação, foram computadas porcentagens de plântulas normais, anormais e sementes mortas. Segundo Brasil (1992) uma plântula deve ser considerada normal quando apresentar suas estruturas essenciais intactas, com defeitos em menos de 50% do tecido e com infecção, desde que a semente não seja a fonte da mesma. Uma plântula deve ser considerada anormal quando apresentar suas estruturas essenciais danificadas, deformadas, deterioradas por fungos ou com albinismo. Além disso, devem ser consideradas sementes mortas aquelas que se apresentam, ao final do teste de germinação, amolecidas e com presença de patógenos. Teste de emergência em solo Foi realizado em bandejas plásticas

4 contendo com substrato autoclavado, formado por uma mistura: 85% de solo, 5% de casca de arroz seco e 10% de casca de arroz carbonizada (v:v). O substrato foi enriquecido com 100g de Calcário Dolomítico, 200g de superfosfato simples e de 60g de sulfato de amónio. Foram utilizadas quatro repetições de 50 sementes por tratamento, semeadas na profundidade de 1,5 cm. Após a semeadura, as bandejas foram distribuídas ao acaso em casa de vegetação. A irrigação do substrato foi realizada de dois em dois dias, com volumes iguais de água para cada bandeja. As avaliações foram realizadas, aos 7 (sete) e 21 (vinte e um) dias após a semeadura, computandose o número de Plântulas. Teste de Sanidade Foi realizado pelo método de Incubação em Substrato de Papel, testando sementes, em número de 200 (8 repetições de 25 sementes por placa de 15cm de diâmetro), desinfestadas com solução de hipoclorito de sódio 1% por um minuto e não desinfestadas. As placas foram mantidas em câmara de incubação à 25ºC em regime alternado de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Aos sete dias após a semeadura procedeu-se à avaliação do teste por meio de observação da presença de cada fungo nas sementes com auxílio de um microscópio estereoscópico. Análises estatísticas Para os testes acima citados, os tratamentos foram dispostos em delineamento em blocos casualizados (DBC). Os dados dos testes de germinação, sanidade e emergência foram submetidos à análise de variância, e as médias agrupadas pelo teste de Scott-Knott (p 0,05), utilizando o software estatístico Sisvar (v. 5.6). RESULTADOS E DISCUSSÃO Crescimento micelial em meio de cultura osmoticamente modificado O crescimento micelial da A. radicina, apresentado na Figura 1, não apresentou diferença estatística nos tratamentos testados, ficando claro que a restrição não interferiu no desenvolvimento do fungo. No entanto, avaliando restrição hídrica para infecção sementes de cenoura, Carvalho et. al. (2009) utilizando como solutos manitol, NaCl e manitol + NaCl para o potencial osmótico a -0,4; -0,6; -0,8; -1,0 e 1,2 MPa, notaram que ICM da A. radicina foi comprometido pela redução do potencial osmótico. CV = 10,66% Figura 1. Índice de velocidade de crescimento micelial (IVCM), ao longo de 7 dias, de Alternaria radicina em diferentes potenciais hídricos (Mpa): 0,0 (T1), -0,6 (T2), -0,8 (T3), -1,0 (T4) e -1,2 (T5); (CV) Coeficiente de Variação. Teste de Germinação De acordo com os resultados da germinação, apresentado na Figura 2, para este teste foi observado que os tratamentos alteraram as taxas de plântulas normais, anormais e sementes mortas, isso quando comparado com a testemunha. Entretanto, para os resultados de plântulas normais e sementes mortas não houve diferença estatística. Foram observados os maiores percentuais de plântulas normais em T1, T2 que apresentaram ambos 6% e T3 que foi de 11%.

5 Figura 2. Valores médios (%) de Plântulas normais ( ), Plântulas com lesões ( ) e sementes mortas ou não germinadas ( ) do teste de germinação das sementes de cenoura inoculadas com A.radicina, em diferentes potenciais hídricos. Médias seguidas pela mesma letra, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5%;; (CV) Coeficiente de Variação. Porém, em valores percentuais, T4 apresentou 71,5% de ocorrência de plântulas lesionadas e para T5 que foi 42% de sementes mortas. Esses resultados contradizem Machado et al. (2001), que em estudo semelhante utilizando o mesmo tratamento, no entanto com os fungos Diplodia maydis, Cephalosporium acremonium e Fusarium moniliforme para a inoculação de sementes de milho, observaram que nos potenciais hídricos mais negativos, promoveram os maiores porcentuais de plântulas com lesões e sementes mortas, enquanto que nos valores de plântulas normais não houve diferença entre os tratamentos. A Alternaria radicina sobre o teste de germinação da cenoura (figura 2), verificou-se que em T1, no qual foi utilizado o menor tempo de exposição das sementes com o fungo, a mortalidade foi de 55%, e em relação ao T4, a taxa de mortalidade foi de 71,5%. Os resultados confirmam informações de Soteros (1979) que revela em seu estudo a patogenicidade da Alternaria radicina para a cultura da cenoura, que este causou tombamento de plântulas nas 3 primeiras semanas após o plantio. Na germinação, os valores de plântulas normais foram comprometidos nos tratamentos à medida que a restrição hídrica era reduzida. Esse comportamento, de certa forma, foi reproduzido em inoculação de sementes de algodão infectadas por Colletotrichum gossypii, C. gossypii var. cephalosporioides, Botryodiplodia theobromae e Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum, Machado et. al. (2004) verificaram que a índice de plântulas infectadas pelos referidos fungos ocorreu no potencial -0,6 MPa; nos potenciais acima desta concentração, os fungos provocaram a morte das sementes, provavelmente como consequência do maior nível de potencial de inóculo determinado pelo maior tempo de exposição das sementes aos patógenos. As sementes dos tratamentos sem restrição (T1) e T2, apresentaram protrusão radicular antes mesmo do tempo sugerido. Possivelmente, para os potenciais menos negativos, os meios apresentaram disponibilidade hídrica suficiente para que as sementes entrassem no processo de embebição, com consequente aumento de volume interno e rompimento do tegumento, permitindo o crescimento do embrião para o meio exterior. Em estudos de sanidade, Coutinho (2000) verificaram que a restrição hídrica induzida por NaCl, KCl e manitol, nos potenciais osmóticos de 0,6 a 0,9, é eficiente para inibir ou retardar a germinação de sementes de arroz e feijão. Teste de Sanidade Quanto ao resultado do teste de sanidade, representado na Figura 3, para as sementes não desinfestadas, não ocorreu diferença entre os tratamentos, apresentando a incidência do fungo de 100%. Entretanto, sementes desinfestadas com hipoclorito, nos potenciais hídricos de T4 (-1,0 MPa) e T5 (-1,2 MPa), apresentaram maior porcentagem de infecção (100%), enquanto os potenciais de T1 (0,0 MPa), T2 (-0,6 MPa) e T3 (- 0,8 MPa) apresentaram infecções de 69, 60 e 65%. Ordoñez (2016) verificou que a partir potencial osmótico de -1,0 MPa foi eficiente para infecção de 80% das sementes de cebola com Colletotrichum gloeosporioides f. sp. cepae.

6 Figura 3. Incidência de Alternaria radicina detectada pelo teste de sanidade Incubação em Papel-de-Filtro, em sementes de cenoura, com e sem inoculação em diferentes potenciais hídricos e desinfestadas ( ) e não desinfestadas ( ) com hipoclorito de sódio a 1%. Médias seguidas pela mesma letra, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste de Scott-knott a 5%;(CV) Coeficiente de Variação em %. Galli et al. (2005) consideram que a semente está infestada quando o patógeno está ligado à sua superfície, e infectada quando o patógeno é encontrado dentro de seus tecidos. A desinfestação fez com que o inóculo presente no pericarpo das sementes de cenoura se apresentasse em menores valores para T1, T2 e T3, exceto para T4 e T5 onde as sementes permaneceram por 120 e 144 horas. Portanto, pelo fato das sementes desinfestadas superficialmente terem apresentado taxas consideráveis de infecção, entende-se que o fungo colonizou os tecidos do embrião e endosperma das sementes de cenoura. Na incubação em substrato de papel, os tratamentos no qual as sementes permaneceram um tempo maior em contato com o fungo no momento da inoculação apresentaram as maiores incidências, isso é verificado pela persistência da A.radicina após a desinfestação da semente com hipoclorito para os tratamentos T4 e T5. Segundo Machado et. al. (2007) a restrição hídrica, nestas condições, reduz a germinação das sementes torna-se extremamente útil no teste de incubação em substrato de papel, por dificultar a ocorrência de contaminações secundárias entre as sementes durante o período de incubação. Portanto, com a restrição hídrica, facilita-se o exame das sementes, possibilitando maior segurança na detecção dos fungos desenvolvidos sobre as mesmas. Teste de Emergência A porcentagem de emergência de plântulas no solo, ilustrada na Figura 4, reproduziu os resultados do teste de geminação. O primeiro estande, avaliado aos 7 dias após a semeadura, as porcentagens de emergências apresentaram diferenças estatísticas entre os tratamentos. Notou-se um declínio gradual nos resultados das médias de emergência à medida que o potencial hídrico do meio foi mais negativo. Em relação à testemunha, T1 obteve 22% de emergência, a maior média observada nesse tempo, e logo em seguida T2 que foi de 11,2%. Para os de mais tratamentos, de acordo com o teste de Scott-Knott, os estandes de plântulas em T3, T4 e T5 foram iguais à testemunha sem inoculo (T0), apresentando os respectivos valores 4,4%, 0,8%, 6,4% e 5,2%.

7 CV = 47,56% CV = 32,51% Figura 4. Valores médios (%) de plântulas normais aos sete ( ) e 21 ( ) dias do teste de emergência em sementes de cenoura, inoculadas com A.radicina em diferentes potenciais hídricos. Médias seguidas pela mesma letra, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste de Scott-knott a 5%(CV) Coeficiente de Variação em %. Os resultados de emergência em T1, T2, T3 e T4 avaliados aos 21 dias após o plantio, não diferiram estatisticamente entre si, os quais estes obtiveram respectivamente 12,4%, 15,2% e 18% de plântulas. Em T5 foi observado o menor valor no estande de plântulas em relação aos demais tratamentos. Em geral, a emergência foi comprometida nos tratamentos, visto que a testemunha aos 21 (vinte e um) dias apresentou 58% de plântulas no estande. Pelos resultados do teste de emergência ao 7º dia, foi observado o comportamento semelhante ao teste de germinação (Figura 2), pois os potenciais hídricos inibiram a germinação das sementes provocando uma demora na emergência de plântulas, observados em T2, T3 e T4, exceto T5 proporcionou a morte da semente. No entanto, T1 por não poder inibir a germinação, então isso fez com quem a protrusão ocorresse, isso no momento em que as sementes foram inoculadas com fungo, antes mesmo de serem retiradas para o tempo requerido no experimento. Machado et al. (2001) observaram que a protrusão radicular foi eficazmente impedida nos potenciais hídricos mais elevados, sem que o processo de germinação tenha sido afetado, após o período de incubação. O emprego da restrição hídrica induzida por manitol, nos potenciais -1,0 MPa e -1,2 Mpa, reduziu a germinação de plântulas normais. Em T2, T3 e T4 a germinação foi retardada ocorrendo entre 7 (sete) a 21 (vinte e um) dias, verificado no teste de emergência. O processo de infeção que se utilizou a restrição de -1,2 MPa (T5) ocasionou maior mortalidade das sementes de cenoura. A restrição hídrica no potencial osmótico -1,0 MPa não interferiu no desenvolvimento e detecção do fungo Alternaria radicina em sementes infectadas de cenoura submetidas ao teste de sanidade pelo método de incubação em substrato de papel. CONCLUSÃO: A utilização do manitol como restritor hídrico para infecção de sementes de cenoura com A. radicina é um método alternativo eficaz. As concentrações de manitol utilizadas para os tratamentos não comprometeram o crescimento micelial do fungo. Os potenciais hídricos a partir do nível - 0,8MPa (T3) até -1,0MPa (T4) promoveram maiores índices de infecção pelo fungo, e também inibiu a germinação, sem inviabilizar as sementes de cenoura cv. Kuronan para outros usos posteriores. No entanto, o ultimo potencial (T5) utilizado casou maior mortalidades nas sementes de cenoura. AGRADECIMENTOS: Agradeço a Deus por ter me dado saúde e força para superar as dificuldades. Ao meu orientador Thiago Leite, pelas suas orientações, correções e incentivo. Aos meus pais, pelo amor, incentivo e apoio incondicional.

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