OTIMIZAÇÃO EXPERIMENTAL PARA DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS ELETROANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO FÓLICO EM ALIMENTOS
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- Sophia Botelho Nunes
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1 OTIMIZAÇÃO EXPERIMENTAL PARA DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS ELETROANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO FÓLICO EM ALIMENTOS Uarlei Douglas dos Santos, 2 Djenaine De Souza Bolsista de iniciação Científica PIVIC/CNPq/UFU, discente do curso de Engenharia de Alimentos 2 Professora do Instituto de Química da UFU/MG),2 (Universidade Federal de Uberlândia, Campus de Patos de Minas, Av. Getúlio Vargas, nº 2, Patos de Minas - MG, CEP ) djenaine@iqufu.ufu.br RESUMO - O ácido fólico é uma vitamina fundamental ao organismo humano. Ele participa da síntese de glóbulos vermelhos, formação de DNA e RNA e, ainda, é componente importante no desenvolvimento de tecidos do cérebro. No entanto, ele se degrada facilmente no meio ambiente, pela luz solar ou pelo oxigênio, ou na preparação dos alimentos que o possuem naturalmente. Com isso, tornou-se crescente o enriquecimento industrial de alguns alimentos, como farinhas, com o ácido fólico. Este trabalho propõe o desenvolvimento de metodologias eletroanalíticas com o emprego de eletrodos sólidos de amálgama de prata (AgSAE) e a técnica de Voltametria de Onda Quadrada (VOQ) para identificação e quantificação de ácido fólico em alimentos industrializados e in natura. Palavras-Chave: ácido fólico, eletrodos sólidos, determinação eletroanalítica, oxirredução, voltametria de onda quadrada. INTRODUÇÃO O ácido fólico (AF), ácido (2S)-2-[(4-{[(2- amino-4-hidroxipteridin-6-il)metil]amino}fenil)formamido]pentadióico, é um composto pertencente ao grupo de vitaminas hidrossolúveis do complexo B, denotado por vitamina B9 ou vitamina M. No organismo humano, através de reações de metilação e replicação celular, o ácido fólico sintetiza diversos compostos que, por sua vez, podem desempenhar funções variadas. Isto o faz nutricional e funcionalmente essencial. Ele é precursor, por exemplo, de uma grande variedade de derivados que atuam como coenzimas nas reações de transferência de carbono (Lima-Pllone et al, 08 & Davis, 986), tendo papel importante na síntese de glóbulos vermelhos do sangue, na formação de DNA e RNA e, ainda, participa do desenvolvimento de tecidos do cérebro. Na natureza, o AF é encontrado na forma de folatos, sendo abundante em vegetais, principalmente nos de coloração verde-escura, em cereais, legumes, frutas secas, grãos e, ainda, em vísceras de animais. No entanto, ele é sensível à radiação UV, podendo sofrer foto degradação (Martin et al, 09), e sensível também ao oxigênio, podendo facilmente ser oxidado. Com isso, ele se degrada facilmente no ambiente ou mesmo no processo de preparação dos alimentos. Devido à diversidade de funções que o AF desempenha no organismo, nos últimos tempos ele tem despertado grande interesse nutricional. Além disto, devido à facilidade com que pode se degradar nos alimentos ocorre a necessidade de uma implementação alimentar adicionada. A hipovitaminose de AF pode desencadear problemas na síntese de ácidos nucléicos e, com isso, ocorrência de doenças degenerativas, como o mal de Alzheimer, ou má formação de fetal, como a Mielomeningocele, que é caracterizada pela má formação da coluna vertebral. Além disso, a deficiência de AF no organismo pode causar doenças cardiovasculares, hipertensão, anemia e até derrame cerebral (Bandzuchova et al ). Para suprir as necessidades diárias de AF para a população em geral, é crescente o emprego do enriquecimento do AF em alimentos industrializados (ANVISA, 3). Dentre estes alimentos, podemos citar farinhas, leite e alguns cereais que recebem doses adequadas de maneira que a dose mínima diária de ingestão para seres humanos seja atingida. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA determinou o comprometimento das indústrias alimentícias em enriquecer farinhas de trigo e de milho, bem como as de uso industrial em panificação, com 50 µg de AF para cada 00 g de farinha.
2 Es Ep A avaliação da concentração de substâncias em alimentos é feita, normalmente, com técnicas tradicionais de cromatografia ou espectroscopia. As principais técnicas para a determinação de AF em alimentos são a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high performance liquid chromatography) com detector de UV ou detector eletroquímico, espectrometria, eletroforese capilar ou biosensores como o método ELISA (enzymelinked immunosorbent assays) (Hoegger et al, 07). Apesar desta diversidade de técnicas, todas passam por uma etapa inicial que é o preparo da amostra. Este preparo é relativamente demorado, pois para se obter um resultado satisfatório, sem interferentes, é preciso uma boa quantidade de amostra limpa, pois qualquer contaminação pode comprometer toda uma coluna cromatográfica, por exemplo. Isto além de ser necessária uma grande quantidade de amostra, resultando em muito resíduo experimental, o que é contraditório, pois as concentrações de AF em alimentos são muito baixas, na ordem de µg (,00 x 0-6 g). Outra desvantagem é que estas técnicas não são satisfatoriamente qualitativas para o ácido fólico, necessitando de alguns recursos auxiliares para a identificação precisa do mesmo, além de elevar relativamente os custos. Com o crescente avanço da tecnologia e computação, aliados ao avanço da Química Analítica, surgiram as medidas eletroanalíticas. Estas se baseiam na medida de alguma propriedade elétrica, ou seja, corrente, potencial, carga, resistência ou condutividade (Skoog et al, 09). Em comparação às técnicas clássicas, as técnicas eletroanalíticas são tão precisas e sensíveis quanto os tradicionais métodos cromatográficos. Além disto, elas são relativamente mais baratas e rápidas, podendo ser aplicadas diretamente no alimento em questão. Dentre elas, podemos citar a voltametria cíclica e a voltametria de onda quadrada, que são as mais comuns e populares tanto no meio industrial quanto no meio acadêmico (De Souza et al, & Galli, 06). EXPERIMENTAL Os métodos voltamétricos se baseiam em medidas de corrente em função de um potencial aplicado e em condições que estimulem a polarização de um eletrodo de trabalho. Esta medida é diretamente relacionada à concentração do analito de interesse. Neste trabalho, foram empregadas as técnicas de voltametria cíclica (VC) e voltametria de onda quadrada (VOQ). Na VC o potencial aplicado é variado linearmente até um determinado valor e depois o sinal da varredura é invertido e a varredura retorna até o valor de potencial inicial. Já a VOQ fundamenta-se na aplicação de pulsos de potencial na forma de uma escada, Figura, em que a forma da curva de corrente-potencial é proveniente da aplicação de um potencial de altura E s (incremento de varredura), que varia de acordo com uma escada de potencial com altura a (amplitude de pulso de potencial) e duração t (período). Na curva de potencial-tempo, a frequência de aplicação dos pulsos é dada por /t e é chamada de f. Na VOQ, as correntes são medidas somente no final dos pulsos diretos (no sentido da varredura direta) e reversos (no sentido oposto ao da varredura), e o sinal obtido, após derivação, é dado como a intensidade da corrente resultante. Com isso obtém-se elevada sensibilidade em um pico característico do sistema redox avaliado (De Souza, D.; Machado, S. A., 06). E - E inic. t i t 2 Tempo Figura : modo de aplicação de pulsos de potencial na VOQ. A instrumentação é composta por uma célula eletroquímica contendo os condutores elétricos (eletrodo de trabalho, eletrodo de referência e eletrodo auxiliar) e um condutor iônico (eletrólito de suporte). A célula eletroquímica é ligada a um potenciostato que aplica uma variação de potencial que tem energia suficiente para promover o surgimento de correntes elétricas, provenientes da redução ou oxidação do analito de interesse. A célula eletroquímica permite simular as condições do meio ambiente ou mesmo as reações que ocorrem no organismo, ou seja, dentro da célula, o potencial aplicado promove reações na interface entre os eletrodos e o eletrólito, também chamada interface eletrodosolução. É composta usualmente de três eletrodos, sendo um eletrodo auxiliar que fecha o I
3 circuito e permite a circulação da corrente entre este e o eletrodo de trabalho, um eletrodo de referência que possui um potencial constante e possibilita o cálculo do potencial absoluto medido para o analito e, por fim, o eletrodo de trabalho que é onde ocorrem, em sua superfície, as reações. Todas as soluções utilizadas foram preparadas com reagentes de alta pureza (P.A.) (Vetec, Synth ou Sigma Aldrich), utilizando água destilada através de um Sistema Purificador de água Osmose Reversa OS50 LX, balança analítica de precisão Classe I (Bel engineering, Mark M24A), e as vidrarias comuns de laboratório. Após preparadas, as soluções foram armazenadas em geladeira até a utilização. No decorrer do trabalho, foram preparadas soluções de Cloreto de Potássio (KCl 3,00 e 0,0 mol/l), Ácido Clorídrico (HCl 0,0 mol/l) e Cloreto de Hexamina Rutênio (Ru(NH 3 ) 6 Cl 3 0,05 mol/l) para caracterização e condicionamento do eletrodos, Tampão de Britton-Robinson (Tampão BR 0,040 mol/l), Tetraborato de Sódio (Na 2 0,0 mol/l) e Hidróxido de Sódio (NaOH 0,0 mol/l) para os experimentos e a solução de estoque de Ácido Fólico (,00x0-3 e,00x0-4 mol/l). RESULTADOS E DISCUSSÃO Comportamento eletroquímico do AF Os métodos voltamétricos se baseiam em medidas de corrente em função de um potencial aplicado e em condições que estimulem a polarização de um eletrodo de trabalho, e o sinal obtido é diretamente relacionada à concentração e identificação do analito de interesse. Neste trabalho, foram empregadas as técnicas de voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada. O primeiro eletrólito avaliado foi o Tampão BR [0,04 mol/l]. As análises iniciais partiram dos dois pontos de pka do AF, sendo o º em ph 2, e o segundo 2º em ph 8,, ajustados com NaOH [,00 mol/l]. Nestas condições foram avaliados os sinais analíticos obtidos para a redução do AF, onde observou-se a presença de dois picos de redução com valores de potenciais dependentes do ph do meio. Além destes valores de ph, também foram avaliadas as respostas analíticas em intervalo de ph de 2,0 a 2,0 empregando-se a Voltametria de Onda Quadrada (VOQ), e os parâmetros voltamétricos padrões pela literatura, com frequência de aplicação de pulsos de potenciais (f ) de 00 s -, amplitude de pulsos (a) 50 mv e incremento de varredura de potencias ( E s ) de 2 mv, em intervalo de varredura de potencial de 0 a -, V (vs. Ag/AgCl sat.). Os voltamogramas obtidos para os diferentes valores de ph estão apresentados na Figura 2, onde é possível observar a presença de dois picos de redução, com valores de potenciais e de correntes de pico fortemente dependentes do ph do meio. As maiores intensidades de corrente de pico foram observadas nos phs correspondentes aos valores de pk a do AF, indicando que a etapa determinante na reação redox é a protonação da molécula de AF ph 2, ph 4,00 ph 6,00 ph 8, ph 0,0 ph 2,0 Pico Pico 2-0,2-0,4-0,6-0,8 -,0 Potencial (E) Figura 2: Voltamogramas de Onda Quadrada obtidos para a redução de 9,90 x 0-5 mol/l de AF sobre AgSAE utilizando-se 0,05 mol/l de tampão BR em diferentes valores de ph, com f = 00 s -, a = 50 mv e E s = 2 mv. Experimentos de Voltametria Cíclica (VC) também foram realizados a fim de se avaliar o comportamento redox do AF, e os sinais voltamétricos obtidos estão apresentados na Figura 3, para velocidade de varredura de potencial de 00 mv/s, onde pode-se observar a presença de um pico de redução (varredura direta) e um pico de oxidação (varredura inversa) indicando que a redução do ácido fólico, nestas condições experimentais, é um processo reversível ou quase-reversível. O par redox observado nestes e experimentos correspondem ao segundo processo (pico 2) observado nos experimentos de VOQ, e o outro processo redox (pico ) não pode ser bem observado devido a sensibilidade da VC. Otimização experimental e voltamétrica A VOQ é uma técnica relativamente mais sensível do que a VC, deste modo foram avaliados os parâmetros ideais para a melhor intensidade de sinal. Antes disso, porém, avaliouse o efeito dos sinais voltamétricos com a mudança da composição da solução, afim de se eliminar possíveis interferentes no sinal analítico.
4 Observou-se que em meio de uma solução de tetraborato de sódio (Na 2 ) ocorreu o favorecimento do sinal de redução do º pico do AF em -0,8 V com uma boa intensidade de sinal. Nestas condições o ph do eletrólito foi correspondente ao segundo ponto de pk a da molécula , M de Na 2 0,05 M de Na 2 0,025 M de Na Pico 2 Pico - -,2-0,9-0,6-0,3 0,0 Potencial (E) Figura 3: Voltamograma cíclico obtido para 9,90 x 0-5 mol/l de AF sobre AgSAE utilizando-se 0,05 mol/l de tampão BR ph 2,3 com intervalo de varredura de potenciais de 0 V a -,3 V e velocidade de 00 mv/s. Assim, foi realizado uma série de experimentos utilizando-se diferentes concentrações de Na 2 a fim de se avaliar o efeito da força iônica do meio (através do uso de soluções com diferentes concentrações de Na 2 ) no sinal analítico, sendo que em todas as concentrações avaliadas, o ph resultante é básico, condição onde se obtêm melhor intensidade de corrente de pico. A frequência de aplicação dos pulsos de potenciais é o parâmetro da VOQ mais importante, pois além de informar o melhor valor para obtenção de um bom sinal analítico, fornece informações acerca do mecanismo de reação redox. Assim o valor de f foi avaliado nos intervalos de 0 s - a 00 s - e considerando-se diferentes valores de concentração do eletrólito, correspondentes a diferentes força iônica para o meio. A Figura 4 mostra as relações obtidas para os valores de corrente de pico e f. Observa-se que não há relação linear entre os valores de f e as respectivas correntes de pico. De acordo com a teoria da VOQ, este é um comportamento característico de processos quase reversíveis, confirmando resultados preliminares observados nos experimentos de VC. Além disto, para fins analíticos definiu-se que o valor de f a ser empregado seria 40 s -, valor este onde se observa melhor intensidade do sinal de corrente Frequência (s - ) Figura 4: Relação entre f e correntes de pico obtidos à partir da redução de 9,90 x 0-5 mol/l de AF sobre AgSAE utilizando-se a = 50 mv, E s = 2 mv e diferentes concentrações de Na 2. A amplitude de aplicação de pulsos de potenciais também foi avaliada e as relações obtidas são apresentadas na Figura 5. Observouse um aumento do sinal até amplitude de 50 mv, para os diferentes valores de concentração do eletrólito. Assim, a = 50 mv foi definido para a aplicação analítica , M de Na 2 0,05 M de Na 2 0,025 M de Na Amplitude (mv) Figura 5: Relação entre a e correntes de pico obtidos à partir da redução de 9,90 x 0-5 mol/l de AF sobre AgSAE utilizando-se f = 40 s -, E s = 2 mv e diferentes concentrações de Na 2. A análise da Figura 6 mostrou que o aumento de E s promoveu uma diminuição do sinal analítico. Este comportamento é característico de processos redox onde a cinética de transferência de elétrons é lenta. O aumento de E s promove aumento na velocidade de varredura de potenciais, não permitindo que a reação redox ocorra completamente, promovendo uma diminuição no sinal. Assim, para fins analíticos definiu-se o uso de E s = 2 mv.
5 Assim, os parâmetros otimizados para a aplicação da metodologia para quantificação de ácido fólico foram: meio de 0, ml/l de Na 2 amplitude (a) 50 mv, frequência (f) 40 s - e incremento ( E s ) 2 mv , M de Na 2 0,05 M de Na 2 0,025 M de Na Incremento (mv) Figura 6: Relação entre E s e correntes de pico obtidos à partir da redução de 9,90 x 0-5 mol/l de AF sobre AgSAE utilizando-se f = 40 s -, a = 50 mv e diferentes concentrações de Na 2. Curva analítica para o AF Depois de estabelecidos os parâmetros ideais de aplicação de potencial, bem como o eletrólito de suporte ideal, pode ser construída uma Curva Analítica para a redução do AF sobre AgSAE empregando-se VOQ, e assim se avaliar as figuras de mérito (limites de detecção e limites de quantificação) do procedimento analítico proposto. Para isto utilizaou-se 0 ml do eletrólito e efetuou-se a adição de alíquotas consecutivas de solução padrão de AF em diferentes concentrações. Nestas condições, observou-se um aumento proporcional dos valores de corrente de pico em função do aumento de concentração do AF, possibilitando-se assim, a construção de uma curva analítica, ou curva de calibração. Foram construídas três curvas analíticas no intervalo de concentração de 4,97x0-7 e 7,83x0-6 mol/l. A Figura 7 apresenta a curva média obtida. A partir da regressão linear da Curva de calibração foi possível determinar algumas correlações importantes, como a dependência do I p (altura do pico de redução) com a concentração molar do AF e a linearidade da relação obtida, que apresentou a seguinte equação para a reta: () 2,5 0,0 7,5 5,0 2,5 I p (A)= 5,29 x 0-7 (A) +,52 x 0-6 (A/ mol/l) r = 0,996 Ácido Fólico Regressão Linear 0,0 0,0,5 3,0 4,5 6,0 7,5 9,0 Concentração ( mol/l) Figura 7: Curva de Calibração obtida à partir dos voltamogramas de onda quadrada do AF em meio de 0, mol/l de Na 2 com f = 40 s -, a = 50 mv e E s = 2 mv. Para calcular o limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ), foram empregados as Equação 2 e Equação 3, respectivamente: onde, obtido através de um desvio padrão das correntes de pico obtidas para 0 voltamogramas obtidos para a solução do branco (todas as condições experimentais da curva analítica, sem a adição de AF) e, que é a inclinação da curva analítica. Assim, o LD calculado foi,05x0-7 mol/l, que corresponde a 4,63 mg/l (4,63 ppm). O LQ calculado foi de 3,50x0-7 mol/l que corresponde a,54 mg/l (5,44 ppm). De acordo com a ANVISA, os alimentos precisam ser fortificados com até 50 mg de AF por Kg de alimento. Assim, com o método proposto, será possível a realização do controle de qualidade de alimentos fortificados, já que o LD e LQ do método proposto, apresentaram valores menores que o limite definido pela agência reguladora. CONCLUSÃO (2) (3) A otimização experimental foi suficientemente satisfatória, tanto para a identificação quanto para a detecção do AF em solução, e posterior aplicação em amostras de alimentos fortificadas com AF. A variação de eletrólitos mostrou o comportamento variável do pico de redução do AF e
6 revelou a necessidade de estabelecer um eletrólito de suporte mais estável. E a variação de parâmetros voltamétricos forneceu os valores onde é possível uma melhor detecção do AF em solução. Os parâmetros estabelecidos foram efetivamente utilizados, possibilitando a construção de uma curva de calibração na região entre 4,97x0-7 a 7,83x0-6 mol/l. A curva de calibração apresentou excelente linearidade, possibilitando o cálculos das figuras de mérito da metodologia proposta. O LD e LQ calculados apresentaram valores abaixo do valor máximo de fortificação de alimentos, permitindo o uso do método no controle de qualidade de alimentos industrializados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Latinoamericana de Nutrición, [S.l.], v. 58, nº, 08. MARTIN, C. B.;WALKER, D.; SONIAT, M. Density functional theory study of possible mechanisms of folic acid photodecomposition. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, [S.l.], v. 8, p. -6, 09. SKOOG, D.A.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Princípios de Análise Instrumental. 6. ed. Porto Alegre: Bookmam, 09. cap AGRADECIMENTOS Agradecemos à FAPEMIG (APQ-052-2) e à PROPP-UFU. ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária -Disponível em:< Acesso em: 26 fev. 3. BANDZUCHOVA, L.; SELESOVSKA, R.; NAVRATIL, T.; CHYLKOVA, J. Voltammetric determination of folic acid using liquid mercury free silver amalgam electrode. Electrochimica Acta [S.l.]: v. 56, n. 5, p ,. DAVIS, R. E. Clinical chemistry of folic acid.advances in Clinical Chemistry, Farmington, USA, 25, p , 986. DE SOUZA, D.; MASCARO, L. H.; FATIBELLO FILHO, O. The effect of composition of solid silver amalgam electrodes on their electrochemical response. Journal of Solid State Electrochemistry. Springer, [S.l.], vol.5, n.9,. DE SOUZA D.; MACHADO S. A. S. Study of the Electrochemical Behavior and Sensitive Detection of Pesticides Using Microelectrodes Allied to Square-Wave Voltammetry. Electroanalysis, v. 8, n. 9, p , 06. GALLI A.; DE SOUZA D.; GARBELLINI G.S.; COUTINHO C.F.B.; MAZO L.H.; AVACA L.A.; MACHADO S.A.S. Utilização de técnicas eletroanalíticas na determinação de pesticidas em alimentos. Química Nova, v. 29, n., p. 05, 06. HOEGGER, D. [Et. al.]. Disposable microfluidic ELISA for the rapid determinationof folic acid content in food products, Springer-Verlag, [S.l.], v. 387, p , 07. LIMA-POLLONE, J. A. [Et. al]. Determinação Determinação de folatos em espinafre avaliação da influência do tipo de cultivo, época de colheita e cozimento. ARCHIVOS LATINOAMERICANOS DE NUTRICION: Organo Oficial de la Sociedad
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