AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO CONFERIDA PELO ANTÍGENO RECOMBINANTE DE CADEIA LEVE REGULADORA DE MIOSINA FRENTE À FASCIOLOSE EXPERIMENTAL EM RATOS

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1 AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO CONFERIDA PELO ANTÍGENO RECOMBINANTE DE CADEIA LEVE REGULADORA DE MIOSINA FRENTE À FASCIOLOSE EXPERIMENTAL EM RATOS Jonathan ROOS¹, Claiton Ismael SCHWERTZ¹, Manoela Marchezan PIVA¹, Mateus Eloir GABRIEL¹, Neuber José LUCCA¹, Luan Cleber HENKER¹, Ester Schardong da SILVA¹, Leandro Anderson RHODEN¹, Ricardo Evandro MENDES². ¹Acadêmico Medicina Veterinária. Bolsista Iniciação Científica IFC/CNPq. ²Orientador IFC- Câmpus Concórdia. Introdução Fasciolose, causada pelo trematódeo Fasciola hepatica, é uma doença de distribuição mundial, afetando particularmente bovinos e ovinos, e resultando em perdas anuais de US$ 3 bilhões à comunidade agrícola (SCIPS, 2003; BORAY et al., 1985). As perdas por condenação de fígado em abatedouros podem chegar a 80% em áreas endêmicas em ruminantes adultos. Infecções subclínicas em bovinos leiteiros reduzem em 8% a produção de leite, e entre 8 e 22% o ganho de peso (BORAY et al., 1985). Soma-se a essas perdas, a ocorrência da enfermidade em humanos, de caráter zoonótico (MAS-COMA, 1999; MASSOUD, 1989). O efeito patogênico do parasito resulta em parte da destruição do fígado pela migração larvária. Em adição, foi recentemente reconhecido a capacidade de levar a imunodepressão e desequilíbrio do sistema imune do hospedeiro definitivo (BRADY et. al., 1999; AITKEN et. al., 1978). A enfermidade é controlada pelo uso de anti-helmínticos (WOLSTENHOLME et al., 2004), entretanto, o uso exacerbado de fasciolicidas leva ao risco potencial de resíduos nos produtos cárneos e lácteos. Métodos alternativos de controle são necessários, sendo as vacinas uma opção satisfatória. O objetivo geral deste trabalho foi testar em ratos a eficácia do antígeno recombinante de cadeia leve de miosina frente à infecção experimental por Fasciola hepatica, com base na contagem de parasitos adultos no fígado, dinâmica dos ovos em fezes e as lesões hepáticas. Material e Métodos O processo de identificação e clonagem do antígeno MCLK (Antígeno Recombinante de Cadeia Leve Reguladora de Miosina) foi realizado no Witold Stefanski Institute of Parasitology Polish Academy of Science Varsóvia, Polônia, nos anos de 2009 e Para a realização do experimento, os ratos permaneceram durante três semanas em um ambiente com temperatura e umidade controladas, no biotério do IFC Câmpus Concórdia,

2 Escore de lesão para aclimatação. Posteriormente foram divididos em 4 grupos experimentais: 1) Controle infectado e ; 2) MCLK + TiterMax Gold Adjuvante; 3) Água + TiterMax Gold Adjuvante; iv) Controle não infectado e. Cada grupo foi composto de 15 ratos livres de qualquer patógeno. Os animais imunizados receberam 3 doses de 100 μg do antígeno (MCLK) com intervalo de 3 semanas. Após um mês da terceira dose foram infectados com 20 metacercárias de F. hepatica. Cinco animais de cada grupo foram eutanasiados 7 dias após a infecção para estudo das lesões causadas pela migração parasitária e os demais 107 dias após a infecção. Foram coletadas amostras representativas de fígado, os quais foram fixados em solução de formalina a 10%, processados rotineiramente e corados pela técnica de Hematoxilina & Eosina. As lâminas histopatológicas foram avaliadas em microscópio óptico e as lesões quantificadas em escala de 0 (ausentes) a 4 (muito severas). Os parâmetros lesionais analisados foram os mesmos avaliados por Mendes et al. (2010). A avaliação compreendeu também a contagem dos parasitos coletados na necropsia dos animais. A contagem de ovos em fezes foi realizada a partir da 8ª semana de infecção. Para tal, colheram-se fezes diretamente da ampola retal dos animais, as quais foram avaliadas pela técnica de Dennis, Stone & Swanson. Os dados foram submetidos à estatística descritiva e as médias encontradas para cada grupo foram comparadas através de gráficos de barras e linhas. Resultados e discussão 1. Avaliação histopatológica uma semana após a infecção Para avaliar a migração das larvas pelo parênquima hepático, antes da chegada dos parasitos aos ductos biliares, local onde estão praticamente fora do alcance do sistema imunológico, cinco ratos de cada grupo foram eutanasiados uma semana após a infecção. Os resultados estão expressos no Gráfico Controle infectado 2 - MCLK + TiterMax 3 - Água + TiterMax Necrose Infiltrado Inflamatório Gráfico 1. Lesões histopatológicas nos s 1, 2 e 3 uma semana após a infecção.

3 Escore de lesão Esore de lesão Pode-se observar que não houve diferença entre as lesões histopatológicas observadas entre os grupos. A necrose (morte celular) ocorre na fase aguda da Fasciolose, pela migração das larvas de F. hepatica no seu caminho aos ductos biliares. Atribui-se a redução na ocorrência de necrose a um menor número de larvas que migraram pelo fígado ou a uma menor atividade das larvas pela ação do sistema imunológico previamente sensibilizado. 2. Avaliação histopatológica três meses após a infecção Após três meses da infecção, todos os animais restantes (10 por cada grupo) foram eutanasiados para determinação das lesões crônicas e da quantidade de parasitos adultos nos ductos biliares. Nas figuras 2 e 3 estão apresentadas as lesões histopatológicas observadas nos grupos 1, 2 e 3. Observa-se uma redução das lesões nos grupos em que foi utilizado o adjuvante TiterMax, com ou sem o antígeno, sendo essa uma ação do adjuvante, comumente observada. As principais lesões observadas foram proliferação de tecido conjuntivo fibroso substituindo o parênquima hepático, hiperplasia de ductos biliares e infiltrado inflamatório de linfócitos, eosinófilos e células gigantes. 1,2 1,8 1 - Controle infectado e 1,2 1,2 0,8 0,8 0,7 0,8 2 - MCLK+TiterMax 3 - Água+TiterMax Traj. crônicos Granuloma Fibrose portal Gráfico 2. Lesões histopatológicas nos s 1, 2 e 3 três meses após a infecção. 1,2 0,3 1,3 0,7 1 - Controle infectado e 0,4 0,9 0,4 0,1 2 - MCLK+TiterMax 3 - Água+TiterMax Hemorragia Perihepatite Inf. Linfop. Eosinófilos Gráfico 3. Lesões histopatológicas nos s 1, 2 e 3 três meses após a infecção.

4 3. Ovos em Grama de Fezes Com a finalidade de determinar se o antígeno utilizado reduz a quantidade de ovos nas fezes, seja pela menor quantidade de parasitas que chegam a fase adulta, seja por uma redução na fertilidade dos parasitos; exames coprológicos foram realizados a partir da 8ª semana pósinfecção, com o intuito de contabilizar o número de ovos eliminados nas fezes dos animais infectados. No Gráfico 4 observa-se uma redução no OPG do grupo 2 em relação ao 1 e ao 3 a partir da 13ª semana do experimento. Esse efeito é raramente observado em ensaios experimentais com antígenos, entretanto é extremamente desejável, pois reduz a pressão de infecção no ambiente. Gráfico 4. Ovos por Grama de Fezes (OPG) nos s 1, 2 e 3 dos ratos infectados com F. hepatica 4. Número de parasitos coletados na necropsia Após a eutanásia dos animais, os canalículos biliares foram abertos e os parasitos encontrados foram catalogados. Observou-se uma redução de 40,4% na carga parasitária constatada no 2 (média de 2,8 parasitos por animal) em relação ao 1 (4,7 parasitos por animal). Reduções de entre 40 e 50% na carga parasitária são comumente encontradas em trabalhos avaliando antígenos diversos na Fasciolose experimental (DALTON et. al., 2013). Conclusão Conclui-se que nas condições deste estudo o antígeno MCLK em adjuvante TiterMax Gold conferiu proteção contra a infecção experimental por F. hepatica em ratos. Houve uma

5 redução significativa e desejada na carga parasitária e no número de ovos eliminados nas fezes. Entretanto, essa redução deve ser aumentada para a utilização comercial do antígeno como vacina. Mais estudos são necessários para estabelecer um protocolo vacinal adequado na imunização contra F. hepatica utilizando o MLCK como antígeno. Projeto aprovado no Comitê de Ética em uso de animais do IFC-Concórdia sob número 01/2013. Projeto financiado pela FAPESC Nº 3468/2012 Referências BORAY, J.C Parasites, Pests and Predators (Gaafar, S.M., Howard, W.E. and Marsh, E., eds), Elsevier, p BRADY, M. T.; O NEILL S.M.; DALTON J. P.; MILLS K. H. G. Fasciola hepatica suppresses a protective Th1 response against Bordetella pertussis. Infect Immun 67: DALTON, J. P.; ROBINSON, M. W.; MULCAHY, G.; O'NEILL, S. M.; DONNELLY, S. Immunomodulatory molecules of Fasciola hepatica: Candidates for both vaccine and immunotherapeutic development. Vet Parasitol 195: MAS-COMA, S. Human Fasciolosis In: Dalton, J.P., ed, Fasciolosis. CABI Publishing, p MASSOUD, J. Fascioliasis outbreak in man and drug test (triclabendazole) in Caspian littoral, northern part of Iran. Bull Soc Fran Parasitol. 8: MENDES R. E.; PÉREZ-ÉCIJAA R. A.; ZAFRAA R.; BUFFONI L.; MORENO- MARTÍNEZ Á.; DALTONC J. P.; MULCAHU G.; PÉREZ J. Evaluation of hepatic changes and local and systemic immune responses in goats immunized with recombinant Peroxiredoxin (Prx) and challenged with Fasciola hepatica. Vaccine. Elsevier 10: SCIPS. Sustainable Control of Internal Parasites of Sheep. Disponível em: < Acesso em 02/02/ WOLSTENHOLME, A.J.; FAIRWEATHER I.; PRICHARD R.; SAMSON- HIMMELSTJERNA G.V.; SANGSTER N. C. Drug resistance in veterinary helminths. Trends Parasitol 20: