Controle imunológico de carrapatos: um desafio para pesquisadores da vacina anti-carrapato

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1 Controle imunológico de carrapatos: um desafio para pesquisadores da vacina anti-carrapato Dr. Alina Rodríguez Mallon Departamento de Biotecnología Animal Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología Habana, Cuba

2 Carrapatos: Podem transmitir uma ampla variedade de agentes infecciosos (vírus, bactérias e protozoários) que causam doenças em humanos e animais. A mudança climática tem um efeito adverso na distribuição de carrapatos e doenças transmitidas por carrapatos.

3 Métodos Químicos Métodos Biológicos Controle de carrapatos Métodos Físicos Métodos Imunológicos A vacinação é uma alternativa ecologicamente amigável aos produtos químicos no controle de infestações por ectoparasitas. Pode ser eficaz contra todos os genótipos de carrapatos resistentes a produtos químicos. O desafio é conseguir vacinas anti-carrapatos com alta eficácia semelhante à dos acaricidas.

4 As vacinas anti-carrapato não são vacinas clássicas e não têm um efeito de Knock down. Diminui o ingurgitamento, a oviposição e a fertilidade dos ovos. A vacinação para controle de carrapatos só é efetiva se usada dentro de um Programa de Controle Integrado. Reduz o uso de acaricidas químicos. Em consequência, retarda ou elimina a resistência de carrapatos a produtos químicos. Diminui a poluição ambiental e a contaminação de alimentos. Diminui a incidência de doenças hemoparasitárias. Diminui o custo do controle de carrapatos.

5 PROGRAMA DE CONTROLE INTEGRADO DE CARRAPATOS MAIS VACINA Utiliza todos os recursos disponíveis de forma planejada, para alcançar um nível de carrapatos economicamente aceitável no animal. Resistência do hospedeiro Rotação de pastagem Banhos por níveis de infestação, com acaricida eficaz O controle biológico O controle imunológico com vacina É importante a imunização de todo o rebanho, incluindo bezerros após 30 dias de idade. Não deve entrar animais não vacinados no rebanho.

6 Diminuição progressiva da população de carrapatos após várias gerações de carrapatos alimentados com animais vacinados

7 CARACTERÍSTICAS IDEAIS DE UM IMUNÓGENO ANTI-CARRAPATO O antígeno selecionado deve ter amplo espectro (ativo contra muitas espécies de carrapatos e, idealmente, contra múltiplos estágios do ciclo de vida dos carrapatos). O antígeno deve induzir uma imunidade duradoura para minimizar a necessidade de imunizações repetidas e reduzir custos. De preferência, a resposta ao antígeno deve afetar os carrapatos a partir de sua fixação. A vacina deve ter o potencial de reduzir a capacidade dos carrapatos como vetores e, consequentemente, reduzir a incidência de doenças transmitidas por carrapatos. Os antígenos vacinais devem ter um processo de produção relativamente fácil e barato.

8 Identificação e avaliação de antígenos candidatos. Definição de mecanismos imunológicos básicos induzidos por esses antígenos. Desenvolvimento de métodos adequados para a produção de antígeno. Otimização da resposta imune do hospedeiro. Testes de campo da vacina. Estudos econômicos. O registro do produto. Avaliação do produto apos ter sido liberado para uso comercial. MUITO CARO

9 TROSPA Serpinas Bm86 64 TRP Ferritina Salp15 Subolesina Aquaporina saliva Antígenos usados para imunização de hospedeiros pele do hospedeiro Repasto de sangue Redução da viabilidade de carrapatos Diminuição da alimentação, oviposição e fertilidade dos ovos dos carrapatos Diminuição da capacidade vetorial de carrapatos Muitos autores concordam que a combinação de vários imunógenos envolvidos em diferentes processos fisiológicos na mesma preparação poderia contribuir para a eficácia das vacinas contra carrapatos.

10 Bm86 intestino R. microplus Aplicado em mais de 3 milhões de animais em Cuba, Venezuela, México, Brasil e Colômbia. Picchia pastoris Eficácia entre 51 e 99% dependendo da linhagem de R. microplus. Esta é a maior evidência publicada no mundo sobre a aplicação bem-sucedida do controle imunológico de carrapatos nas condições de campo.

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12 P0 é uma proteína multifuncional Componente estrutural essencial dos ribossomos. Envolvido no reparo do DNA e apoptose. Presente na superfície celular de parasitas, leveduras e linhas celulares de mamíferos. Recentemente, foi identificado na saliva do carrapato.

13 POR QUE ESCOLHER ESTA PROTEÍNA P0 foi utilizada como antígeno imunogênico contra: Toxoplasma gondii, Neospora caninum (Mol Biochem Parasitol 2007; 153: 141-8) Trypanosoma cruzi (J Immunol 1993;151: ) Leishmania infantum (Infect Immun 2003; 11: ; Infect Immun 2005, 73(9): ) várias espécies de Babesia (Vaccine 2007, 25: ) Plasmodium (Infect Immun 2000; 68(7):4312-8). Silenciamento do gene da proteína ribossômica P0 é letal para o carrapato Haemaphysalis longicornis (96% de mortalidade. Gong et al., Vet Parasit2008)

14 Elevado grau de identidade de aminoácidos entre proteína ribossomal P0 de carrapato e proteína ortóloga em mamíferos hospedeiros é inconveniente para usar este antígeno como imunógeno contra carrapatos

15 Sequência proteica de P0 de Rhipicephalus sp. MVREDKTTWKSNYFLRLVQLLDEYPKCFIVGVDNVGSKQMQTIRVSLRKHAVLLMGKNTMIR KAIRGHLDNNPALEKLLPHIKGNVGFVFTKEDLTEVREKIIDNKVKAPARAGALAPLDVMIPAQ NTGLGPEKTSFFQALQIPTKISKGTIEILNEIHLIKKDDRVGASEATLLNMLNISPFSYGLKILQVYD SGTVFSPDILDITPEDLRSAFVEGVRNVAAVSLSIGYPTVASVPHSIVNGLKNLIAIAVETDITFKEAE MAKEYLKDPSKFAAAAAPAAGGGAAAAKPEESKKEEAKKEESEEEDDDMGFGLFD Alinhamento da sequência peptídica P0 reportada Rhipicephalus sanguineus-pulchellus-microplus(100%) AAGGGAAAAKPEESKKEEAK 20 Haemaphysalis longicornis (85%) AAGGGAAGAKPAEAKKEEAK 20 Amblyomma cajennense-maculatum (95%) AAGGGAAAAKPEEAKKEEAK 20 Hyalomma marginatum rufipes (100%) AAGGGAAAAKPEESKKEEAK 20 Dermacentor nitens (95%) AAGGGAAAAKPEASKKEEAK 20 Ixodes ricinus-scapularis (83%) AAGGGAA-AKPDA-KKEEAK 18 *******.*** :******

16 AAGGGAAAAKPEESKKEEAK Quimicamente conjugado KLH Peptídeo Sintético Hemocyanina de Megathura crenulata kda subunidades que se agrupam em estruturas decaméricas e multi-decamerica. pp0-klh contido em PBS1X e formulado em VG Montanide 888 (preparado para 10% em óleo mineral) em uma proporção de 60/40 de imunógeno / adjuvante.

17 Demonstração do conceito Desafiado com: R. sanguineus Eficácia obtida com o conjugado químico pp0-klh 90% R. microplus 96% R. sanguineus 89%

18 Plataforma Biotecnológica criada no CIGB para expressão recombinante de proteínas Bactérias Levedura Células Mamíferas Animais transgênicos Plantas transgênicas

19 Proteínas recombinantes expressas em levedura e E. coli Nanopartículas Nanopartículas - pp0 Experiência em andamento. (pp0) n -Bm86 Bm86-(pP0) n Bm-pP0-86 inteina-(pp0) n -TT Títulos de anticorpos insuficientes contra pp0 Eficácia em torno de 50% contra carrapatos

20 Partículas semelhantes a vírus (VLPs - cápsulas vazias) Conjugados químicos com outras proteínas transportadoras Apresentação de VLPs-Multimeric de epítopos antigênicos VLPs de Calicivírus VLPs of VP60-pP0 Agro infiltração de Nicothiana Benthamiana Conjugados químicos p64k-pp0 Bm86-pP0 Experiência de imunização e desafio em andamento

21 AAGGGAAAAKPEESKKEEAK Peptídeo Sintético Quimicamente conjugado Bm86 Ingrediente farmacêutico ativo do GAVAC pp0-bm86 contidos em PBS1X e formulados em VG Montanide 888 (preparado para 10% em óleo mineral) em uma proporção de 60/40 de imunógeno / adjuvante.

22 Imunização de cães e desafio com carrapatos R. sanguineus de Jaboticabal, Brasil pp0-klh pp0-bm86 Colaboração com o Prof. Bechara, FCAV-UNESP-Brasil

23 Eficácia EpP0-KLH = 85% EpP0-Bm86 = 68%

24 Imunização de bovinos e desafio com carrapatos R. microplus

25 Eficácia

26 Obrigado Todos os colegas do projeto "Novos antígenos contra carrapatos no CIGB Todos os colegas de Pesquisas Agrícolas Departamento de Síntese de Peptídeos, Biotério e outros no CIGB Laboratório Nacional de Parasitologia de Cuba Instituto de Ciência Animal de Cuba Prof Bechara e Prof. Rosangela e suas equipes na FCAV-UNESP, Jaboticabal