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1 Técnicas de Medição... 2 Medição de Volumes... 2 Medição volumes de sólidos... 2 Medição de temperaturas... 4 Medição de massas... 4 Medição volumes de líquidos... 5 Erros associados à posição incorreta do observador Pipetas... 8 Pipetas de vidro... 8 Técnicas de pipetagem (pipetas de vidro)... 9 Pipetas automáticas Verificação de Desempenho Padrão de Pipetas Automáticas: Bibliografia Recomendada Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 1

2 Curso: Análises Clínicas Disciplina: Bioquímica Clínica Técnicas de Medição Módulo: II Medição de Volumes A técnica de medição do volume de uma amostra depende do estado físico da amostra (líquido ou sólido) e da sua forma (regular ou irregular). Os resultados obtidos podem ser expressos em unidades do Sistema Internacional (SI): metro cúbico (m³), ou em unidades submúltiplas deste, que é o caso mais frequente. Normalmente, as unidades submúltiplas mais usadas são o mililitro (ml), ou centímetro cúbico (cm³), e o litro (L), ou o decímetro cúbico (dm³). Medição volumes de sólidos A técnica para medir o volume de um composto sólido depende da sua forma: regular ou irregular. Se o composto for um sólido de forma regular (cubo, esfera, paralelepípedo, pirâmide, etc.) medem-se os comprimentos necessários a aplicam-se as fórmulas que permitem calcular os respectivos volumes. A Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 2

3 Curso: Análises Clínicas Disciplina: Bioquímica Clínica Módulo: II B C D Sólido em formato de cruz é formado por 5 cubos idênticos. Cada aresta mede 2,0m. Volume de cada cubo = 2,0³ 2,0 x 2,0 x 2,0 Volume de cada cubo = 8m² Volume d o sólido figura = Σ volume 5 cubos Volume do sólido = 5x8 = 40 m³ Figura 01. Volume de sólidos: A) Sólidos de diferentes formatos e as fórmulas para calcular o volume, B) Volume do cubo, C) Volume da pirâmide, D) Volume de um sólido em formato de cruz. Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 3

4 Curso: Análises Clínicas Disciplina: Bioquímica Clínica Módulo: II Medição de temperaturas Na medição de temperaturas usam-se se termômetros, em geral de mercúrio, graduados, normalmente, em graus Celsius ( C). Antes de se fazer qualquer leitura, deve estudar-se se a escala do termômetro utilizado, de modo a evitar erros, e deve verificar-se o seu alcance está adequado à temperatura a medir. Figura 02: Comparação entre as escalas de temperatura. Exemplo 1: Qual a temperatura do corpo humano em o F? (TC/5) = [(TF-32)/9] 37/5 = [(TF-32)/9] TF-32 = (37/5) x 9 TF = [(37/5) x 9 ]+32 = 98,6 o F Exemplo 2: Ao tomar a temperatura de um paciente, um médico só dispunha de um termômetro graduado na escala Fahrenheit. Se o paciente estava com febre de 42 o C, qual a leitura feita pelo médico no termômetro por ele utilizado? (TC/5) = [(TF-32)/9] 42/5 = [(TF-32)/9] TF-32 = (42/5) x 9 TF = [(42/5) x 9] + 32 = 107,6 o F Exemplo 3: A temperatura ideal da cerveja é em torno de 4 o C, antes de beber. Se dispomos apenas de um termômetro com escala Kelvin, qual a temperatura correspondente ao mesmo estado térmico da cerveja ideal? (TC/5) =[(T-273)/5] (4/5) =[(T-273)/5] T = [(4/5)x5]+273 T = 277K Medição de massas Medir a massa de uma amostra é uma operação de pesagem. Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 4

5 O instrumento necessário para essa operação é a balança, que está geralmente graduada em grama (g), unidade submúltipla do quilograma (kg). Existem vários tipos de balanças, com alcance e sensibilidade diversas. O alcance é o valor máximo que é possível medir utilizando a balança; a sensibilidade é o valor da menor divisão da sua escala. Após a seleção da balança, pesa-se a amostra com os seguintes cuidados: Não colocar a amostra diretamente sobre o prato da balança, mas, sim dentro de um recipiente limpo e seco que pode ser um vidro de relógio, um copo de precipitação ou até um simples papel de filtro. Estes recipientes devem estar à temperatura ambiente; Evitar derrame de líquidos ou reagentes sólidos sobre o prato da balança. Figura 03. Cartoon cômico sobre a utilização da balança para pesagem de mulheres. Medição volumes de líquidos Para medir volumes de líquidos usam-se diversos instrumentos (Tabela 01): Para medições rigorosas: pipetas, buretas ou balões volumétricos. Para medições menos rigorosas: provetas. Qualquer um destes instrumentos tem inscritas algumas informações importantes, tais como: Volume máximo (capacidade); Graduação da sua escala, normalmente em mililitros; Tolerância (limite máximo do erro); Traço de referência, no caso de pipetas ou balões volumétricos; Temperatura de calibração (temperatura a que deve ser feita a medição e que é, normalmente, 20 C). Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 5

6 Curso: Análises Clínicas Disciplina: Bioquímica Clínica Módulo: II Erros associados à posição incorreta do observador. A leitura deverá ser feita de modo a que a direção do olhar coincida com a linha tangente à parte interna do menisco se este for côncavo (ex: água), ou à parte externa do menisco se este for convexo (ex: mercúrio). Figura 04. Modo de leitura volumétrica de um líquido. A direção do olhar coincida com a linha tangente à: parte interna do menisco côncavo parte externa do menisco convexo Tabela 01. Principais instrumentos para medir volumes líquidos Imagem Instrumento Características 1) Pipetas Graduadas Escala graduada (ml) 2) Pipetas Volumétricas Há um traço de referência na parte superior, indicador do nível a que deve ficar o líquido, para que o volume medido seja o que está assinalado na pipeta. Dão medidas rigorosas (exatas) do volume de líquidos. 1. Lava-se a pipeta com água deionizada e, em seguida, com um pouco do líquido a medir. 2. Mergulha-se a extremidade da pipeta no líquido a medir e, com um pipetador ou pêra, aspiraacima do nível do volume pretendido, com a pipeta sempre na se o líquido até ligeiramente posição vertical; 3. Deixa-se cair o excesso de líquido até o nível pretendido, pressionando pipetador ou pêra; Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 6

7 4. Deixa-se, finalmente, escoar o líquido para o recipiente de recolha, com a extremidade da pipeta encostada à parede do recipiente, pressionando do mesmo modo pipetador ou pêra. Buretas Escala graduada, normalmente, em ml. Dão medidas rigorosas de volumes de líquidos. Na extremidade inferior têm uma torneira que permite controlar a quantidade de liquido. 1. Lava-se a bureta duas vezes, com um pouco do liquido a medir, rodando a bureta quase horizontalmente. 2. Prende-se a bureta num suporte. 3. Com o auxilio de um funil enche-se a bureta até um pouco a cima do nível desejado. 4. Deixa-se escoar o liquido em excesso, garantindo a eliminação de bolhas de ar que possam existir ao longo da bureta. 5. Faz-se a leitura do nível inicial do líquido (Vi). 6. Para os destros, com a mão esquerda controla-se a torneira que permite o líquido a escoar, para um recipiente de recolha, em geral um erlenmeyer, enquanto que com a mão direita se agita esse recipiente, caso não acha agitador magnético. 7. Faz-se a leitura final do líquido (Vf). O volume do líquido escoado será V= Vf-Vi Balões volumétricos Há um traço de referência na zona tubular, o colo do balão, indicativo do nível a que deve ficar o líquido a medir, para que tenha o volume correspondente à capacidade do balão. Dão medidas exatas do volume de soluções. Usam-se na preparação de soluções a partir da dissolução de sólidos ou na diluição de soluções de concentração conhecida. 1. Na preparação de soluções de soluções a partir de sólidos diluem-se os sólidos num pouco de água deionizada num copo de precipitação. 2. Aguarda-se que a solução fique à temperatura ambiente e só depois se transfere para o balão Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 7

8 com a ajuda de um funil e de uma vareta. 3. Lava-se o copo de precipitação mais uma ou duas vezes com um pouco de água deionizada que será transferida para o balão do mesmo modo. 4. Por fim enche-se o balão cuidadosamente até o traço de referência, com o auxilio de um contagotas. 5. Tapa-se o balão e inverte-se (agita-se) para homogeneizar a solução. Provetas Normalmente, graduadas em ml. Dão medidas pouco rigorosas de volumes de líquidos. 1. Após a medição do volume do líquido, escoa-se o líquido pela parede da proveta, lentamente, com a ajuda de um bastão de vidro. 2. A quantidade de líquido vertida é inferior à leitura efetuada, pois fica sempre um pouco de líquido aderido à parede da proveta. Pipetas Pipetas de vidro Dentre deste tipo de pipetas devemos diferenciar entre as pipetas volumétricas e as pipetas graduadas. Pipetas Volumétricas: permitem pipetar um volume único de líquido. Pipetas Graduadas: permitem a pipetagem de diferentes volumes. Ainda deve ser reconhecida uma diferença importante: as pipetas (seja de um tipo ou de outro) possuem uma ou duas listras no extremo superior. A existência de duas listras significa que quando o liquido é despejado, o que restar dentro da pipeta não deve ser extraído (ou soprado). Caso a pipeta apresente apenas uma lista, o líquido que restar, deve ser extraído (ou soprado). É importante neste ponto considerar que diferentes tipos de soluções podem ter distintas viscosidades e/ou tensão superficial, com o qual um especial cuidado deve ser tomado quando se Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 8

9 pipeta um líquido viscoso com uma pipeta de duas listras. Se o liquido é despejado muito rapidamente, a tendência será a que fique maior quantidade deste líquido no interior da pipeta, com o qual o volume pipetado será menor ao valor nominal. Uma pipetagem prévia do líquido é aconselhável para minimizar problemas de tensão superficial. Figura 05. 1) Pipeta graduada com uma lista, quando o liquido é despejado, o que restar dentro da pipeta deve ser extraído (ou soprado); B) Pipeta Volumétrica com duas listas, quando o liquido é despejado, o que restar dentro da pipeta não deve ser extraído (ou soprado). Técnicas de pipetagem (pipetas de vidro) 1. Segura-se a pipeta entre o polegar e os 3 últimos dedos da mão. 2. Coloca-se a pipeta no líquido (bem abaixo de sua superfície) e aspira-se cuidadosamente até que a coluna do líquido esteja um pouco acima da marca superior (a aspiração deve ser feita com pêras de aspiração ou pipetadores automáticos). 3. Fecha-se a abertura com o dedo indicador e retira-se a pipeta da solução. Deixando entrar um pouco de ar vagarosamente pela extremidade superior (controlar com o dedo indicador), permite-se escorrer a coluna de líquido até a coluna atingir a marca superior (mantendo em posição vertical e a marca ao nível dos olhos). 4. Remove-se então o líquido aderente a parede externa da pipeta por um papel absorvente. 5. Em seguida, coloca-se a ponta da pipeta junto à parede interna do tubo receptor, deixando escoar lentamente o conteúdo da pipeta até o nível desejado. No escoamento completo é importante remover a última gota encostando a pipeta na parede do tubo. Recomendações: - Ao pipetar soluções cujo frasco contém depósito de soluto, introduzir a pipeta no sobrenadante. Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 9

10 - Nunca introduzir pipetas sujas em frascos que contenham soluções ou reativos químicos puros. - Deve-se sempre usar pipetas secas para não diluir o líquido. Pipetas automáticas As pipetas automáticas têm como vantagem a rapidez de uso. Cuidados especiais, porém, devem ser considerados. Toda pipeta automática tem dois estágios no seu êmbolo. No momento de sugar o líquido, o êmbolo deve ser colocado no primeiro estágio. Para expulsar o líquido das ponteiras, o êmbolo tem que ser levado ao segundo estágio. Vários pontos devem ser cuidadosamente verificados: a. Nunca sugar um líquido ou solução colocando o êmbolo no segundo estágio. Se for assim, o volume pipetado será maior do que o valor nominal. b. Quando selecionar o volume, verificar que o volume escolhido esteja dentro da baixa de volumes da pipeta automática a ser utilizada. Ou seja, se uma pipeta tem uma faixa de volumes que vai de 200 a 1000 µl, sob nenhuma circunstância deve ser pipetado um volume de por exemplo µl. Na verdade, a escolha da pipeta adequada depende do volume que se deseja pipetar e da faixa de volumes na qual cada pipeta trabalha. Exemplo: num laboratório tem 2 pipetas automáticas. A pipeta A, tem uma faixa de volumes de 10 a 40 µl e a pipeta B tem uma faixa de volumes de 20 a 100 µl (Figura 2a). Se fosse necessário pipetar 40 µl, a escolha certa seria a pipeta B, devido a que o volume deseja não fica num dos extremos da faixa de trabalho da pipeta. c. Especiais cuidados devem ser levados em consideração quando a solução que se quer pipetar é cáustica (um ácido ou uma base forte, por exemplo). Neste caso qualquer gota do liquido (ou ainda o vapor do composto) que fique dentro da pipeta pode danificar seriamente o instrumental. Uma solução muito simples é colocar um pedaço de algodão dentro da ponteira, verificando que não seja atingida pelo líquido no momento de sugar. O algodão absorverá qualquer respingo que houver, impedindo que o líquido fique no interior da pipeta (Figura 2b). Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 10

11 (a) 40 µl µl Volume selecionado Faixas volumes podem de que ser Ponteira Botão selecionar volume para o pipetados (b) 40 µl µl Volume selecionado Faixas volumes podem de que ser Algodão Ponteira Botão selecionar volume para o pipetados Figura 06. Esquema indica como utilizar pipetas automáticas. Verificação de Desempenho Padrão de Pipetas Automáticas: Exatidão (Erro Médio ou Erro Sistemático): diferença entre o volume dispensado e o volume nominal ou o volume selecionado na pipeta. Calibração (Ajuste): conjunto de operações que estabelecem a relação entre o volume dispensado e o volume nominal ou selecionado correspondente na pipeta. Volume morto de ar: nas pipetas de deslocamento de ar, é o volume de ar entre a parte inferior do pistão e a superfície do líquido. Taxa de evaporação: estimativa da perda de água causada pela evaporação durante o processo de pesagem. Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 11

12 Análise gravimétrica: procedimento geral baseado na determinação da massa das alíquotas de água dispensadas por uma pipeta. Os valores são corrigidos com relação à perda por evaporação, e então, a massa real e o volume são calculados, com base na densidade da água em temperaturas específicas com correções para a pressão atmosférica do local (fator Z). Volume Nominal: maior volume selecionável pelo usuário e especificado pela Gilson. Nota: isto significa que, para uma pipeta de volume variável com uma faixa de volume útil de 10µl a 100µl, o seu volume nominal é 100µl. Volume selecionado: volume ajustado pelo usuário, para a dispensa do volume escolhido dentro da faixa de volume útil. Nota: para as pipetas e volume fixo, o volume selecionado é igual ao volume nominal. Precisão (Erro Aleatório): dispersão dos volumes dispensados ao redor da média dos volumes dispensados. Também conhecida (de acordo com o contexto) como desvio padrão, reprodutibilidade ou repetibilidade. Repetibilidade: é a dispersão entre os resultados de medidas sucessivas (realizadas em um curto espaço de tempo), onde não há alteração dos parâmetros nem das condições. Reprodutibilidade: é a dispersão entre os resultados de medidas realizadas em condições diferentes (local ou operador diferente), mantendo todos os parâmetros constantes. Especificações Volumétricas (Erros Máximos Admissíveis): são os extremos permitidos (superior e inferior) para o desvio entre o volume dispensado e o volume nominal ou o volume selecionado. Faixa de volume útil: parte do volume nominal que pode ser dispensado, dentro do erro máximo especificado na Norma Internacional ISO/ DIS O valor superior da faixa de volume útil é sempre o volume nominal. O valor inferior é 10% do volume nominal, se não estiver especificado de forma diferente pelo fabricante. Recalibração (ajuste feito pelo operador): é um procedimento que pode ser executado pelo usuário final, para garantir que a pipeta opere conforme as especificações publicadas. Bibliografia Recomendada Manual de operação da Pipetman P, disponível no blog Pipetman, Inspeção em dois minutos, disponível no blog Procedimento simplificado para verificação da performance das pipetas Gilson, disponível no blog Procedimento para verificação da performance das pipetas Gilson, disponível no blog Blog: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Página 12