TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS

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1 TRANSFRMAÇÕES BIQUÍMICAS Guia de Normas e Experimentos 2º quadrimestre/2012 Coordenação: Prof. Dr. Tiago Rodrigues Autores: Núcleo Docente da UFABC 2012

2 Sumário AULA Introdução + Experimento 1 CNTEÚD Apresentação e Disposições Gerais do Curso Experimental + Uso e Calibração de Micropipetadores Experimento 2 Espectrofotometria: Conceitos e Aplicação Experimento 3 Aminoácidos: Estudo da Estrutura e Propriedade Ácido-Base Experimento 4 Desnaturação e Precipitação de Proteínas: Atividade Enzimática Presente no Suco do Abacaxi sobre Gelatina (Colágeno) Experimento 5 Extração e Caracterização de Lipídios Experimento 6 Extração e Caracterização Bioquímica do Amido da Batata: Reação com Iodo e Poder Redutor de Carboidratos

3 Apresentação e Disposições Gerais do Curso Experimental APRESENTAÇÃ A disciplina Transformações Bioquímicas é composta por aulas expositivas em sala de aula e por aulas práticas nos laboratórios didáticos. Este guia traz ao estudante o conteúdo das aulas práticas, com introdução, objetivos, procedimentos e normas que regem a execução destas atividades. BJETIVS E CMPETÊNCIAS s módulos práticos desta disciplina têm como objetivo apresentar uma seqüência de experimentos que permitirá ao aluno identificar aspectos estruturais, funcionais e de reatividade de aminoácidos, carboidratos, lipídeos e enzimas. Espera-se que, após a realização das aulas práticas, o aluno seja capaz de compreender os conceitos fundamentais das Transformações Bioquímicas, fazendo a conexão entre o macroscópico, acessível aos nossos sentidos, e os eventos que ocorrem em escala molecular. AULAS PRÁTICAS Existem normas de segurança para o trabalho em laboratório que devem ser seguidas e respeitadas. Um conjunto destas normas será entregue ao aluno no início das aulas de laboratório juntamente com um termo de compromisso (caso não o tenha recebido em disciplina anterior) no qual o aluno se compromete a ler e seguir as mesmas. Todos os trabalhos em laboratório serão realizados por equipes de no máximo 5 alunos. Espera-se que os resultados obtidos sejam obra de um esforço conjunto e que todos os componentes estejam presentes na hora marcada para o início das aulas. Haverá uma tolerância de 10 minutos e

4 após esse tempo os alunos retardatários não poderão realizar as atividades do dia. A aula será encerrada no horário pré-estabelecido, não havendo prorrogação para os alunos que não tenham concluído os experimentos dentro do prazo previsto por motivos alheios à prática. IMPRTANTE: Não haverá reposição de experimentos no caso de falta, ficando o aluno prejudicado com o aprendizado daquele conteúdo. AVALIAÇÃ Para a avaliação das atividades práticas, será utilizado o conteúdo do caderno de laboratório elaborado individualmente pelo aluno sobre cada experimento. aluno deverá fazer um pré-relatório no caderno anteriormente a aula em questão e utilizá-lo para as anotações durante a aula, bem como as anotações referentes à discussão dos resultados obtidos. Esse caderno deve ser apenas manuscrito e não poderá conter cópia xerográfica do caderno dos colegas ou de qualquer outro material. aluno não poderá participar, em hipótese alguma, da aula prática sem o caderno de laboratório contendo o pré-relatório. aprendizado na disciplina de Transformações Bioquímicas será avaliado por meio de duas provas que contemplarão conhecimento teórico com peso 6 e prático com peso 4. A prova prática envolverá a execução de experimentos no laboratório e resposta a questões propostas durante a execução. Alunos com rendimento igual ou superior a 86% obterão conceito A; com rendimento entre 70 e 85%, conceito B; com rendimento entre 56 e 70%, conceito C; de 50 a 55%, conceito D e rendimento inferior a 50% com conceito F. aluno reprovado (conceito F) poderá fazer EXAME com o conteúdo todo do quadrimestre que substituirá a menor média da primeira ou da segunda prova, considerando a média teoria + prática. RECMENDAÇÕES PARA AS AULAS EXPERIMENTAIS 1. É obrigatório o uso de avental (jaleco) no laboratório; o mesmo deve ser comprido, de mangas compridas e ser usado fechado (com os botões fechados); 2. Não será permitido fazer a aula de laboratório usando sandálias, bermudas, shorts ou saia;

5 3. Não é permitida a execução da aula de Transformações Bioquímicas de boné ou óculos escuros na cabeça; 4. É proibido comer ou beber no laboratório, nem utilizar telefone celular; 5. Cabelos compridos devem estar devidamente presos; 5. No dia da aula experimental todos devem apresentar um fluxograma individual (PRÉ- RELATÓRI) e feito à mão no caderno de laboratório para dar início à aula, sendo que o mesmo poderá ser utilizado durante a execução do experimento; 5. Evitar ao máximo faltar ou chegar atrasado às aulas práticas para não ser prejudicado; 6. aluno que faltou em aula prática terá prejuízo de nota nesta atividade (FC), uma vez que não há possibilidade de reposição da aula; Modelo de Fluxograma fluxograma pode ser feito de maneira esquemática ou na forma descritiva. objetivo é fazer com que todos leiam os conteúdos do experimento e resumam as atividades experimentais, ou seja, cheguem sabendo exatamente o que será feito. Sem o fluxograma não será permitido realizar a aula experimental. Experimento 1 Parte 1: Modelo de Fluxograma 1: Esquemático

6 Modelo de Fluxograma 2: Descritivo

7 Experimento 1 Uso e Calibração de Micropipetadores Abstract The purpose of this didactic experiment is to make students of Biochemical Transformations have the knowledge of correct use of micropipettes, pipetting modes applied to normal, volatile, foaming and viscous liquids, precision limits, and pipette calibration tests. Resumo Este experimento didático tem como proposta fazer com que os estudantes de Transformações Bioquímicas tenham conhecimento e desenvolvam a habilidade do uso correto de micropipetas, modos de pipetagem dos líquidos normais, voláteis, espumantes e viscosos, limites de precisão e testes da calibração de pipetas. Introdução A transferência de volume exato de líquidos é fundamental para vasta maioria dos experimentos nas áreas de bioquímica, biologia molecular, química, etc. De uma maneira geral, o conhecimento sobre o pipetamento de líquidos, a compreensão de seus limites de precisão, bem como o estudo de sua importância na execução reprodutível de experimentos justifica a relevância e abordagem deste tema nesta aula do curso de Transformações Bioquímicas da UFABC. Fundamentação Teórica Pipetas automáticas Micropipetas são aparelhos designados para a transferência de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 µl) com máxima precisão. A construção das micropipetas consiste em um corpo anatômico de polipropileno (autoclavável) equipado com um botão dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartáveis na parte inferior. Existem vários tipos de micropipetas: pipetas monocanal ou multicanal pipetas com volume fixo ou com volume variável pipetas com deslocamento de ar ou com deslocamento positivo

8 Figura 1: A - Pipeta de Deslocamento Positivo; B - Pipeta Deslocamento de Ar (monocanal) e C - Pipeta Deslocamento de Ar (multicanal). Funcionamento de micropipetas com deslocamento de ar Este tipo de pipetas é o mais utilizado, por ser muito versátil. botão dispensador é ligado a um pistão dentro da pipeta. Ao pressionar o botão, o pistão se move deslocando o ar que por sua vez desloca um líquido para dentro ou para fora da ponteira. A trajetória de botão dispensador tem dois estágios que podem ser percebidos por diferença da resistência de molas que retornam o botão dispensador para posição de repouso após ele ser liberado. s dois estágios permitem fazer a pipetagem usando duas técnicas diferentes: a pipetagem direta (esgotamento total) ou a pipetagem reversa (esgotamento parcial). A escolha da técnica depende das características do líquido a ser pipetado (viscosidade, volatilidade, hidrofilicidade) e do processo da pipetagem (pipetagem única, titulante ou repetida). A precisão da pipetagem é influenciada por vários fatores: - encaixe da ponteira na haste: antes de pipetar, a compatibilidade do tipo de ponteira (fabricante) com o tipo de haste deve ser verificada para evitar passagem de ar no encaixe. A ponteira deve ser encaixada por movimento circular que assegura boa vedação entre a ponteira e a haste, além de maior durabilidade pelo uso correto da haste. Por estas razões, o encaixe da ponteira por batimentos repetidos de haste na ponteira deve ser evitado. - ajuste de volume (pipetas com volume variável): cada indicador de volume tem uma pequena folga. Assim, para a maior precisão, o volume deve ser ajustado sempre e somente de um lado (de preferência, no sentido horário). Quando o ajuste ultrapassa o volume desejado, recomenda-se voltar <1/3 da rotação e ajustar o volume de novo. Para ajustar corretamente o volume, deve ser considerado o erro paralático; o eixo da visão tem que ser perpendicular à escala do indicador do volume.

9 - a porção imersa no líquido: por causa da compressibilidade do ar, existe uma medida ideal da imersão da ponta da ponteira que minimiza tais imprecisões (Tabela 1). Tabela 1: Imersão ideal da ponta da ponteira em relação do tipo de ponteira - volume pipetado - tensão lateral do líquido: os líquidos podem molhar a parede da ponteira, o que pode resultar em perdas de volume ejetado (parte dele fica nas paredes). A minimização dessa imprecisão consiste em aspiração e ejeção de líquido sem efetuar a transferência (no mesmo recipiente). Assim, as paredes já estarão molhadas e o volume da 2 a aspiração será transferido por completo. - volatilidade do líquido: para diminuir gotejamento do líquido durante a transferência e quando a natureza do líquido permite (não corrosivo, não infectante ou não radioativo), o líquido pode ser aspirado/ejetado no mesmo recipiente várias vezes até o ar em cima do líquido é trocado completamente por vapor do líquido. Pipetagem direta (esgotamento total) É a técnica de pipetagem mais conhecida. Utiliza-se para transferir volumes únicos de líquidos aquosos ou de líquidos não voláteis, não viscosos e não espumantes. princípio de transferência de líquido é mostrado na Figura 2: Figura 2: Esquema de procedimento usado por a técnica de pipetagem direta. Linhas pontilhadas representam as posições de botão de esgotamento: Repouso (linha superior), 1 o estágio (linha no meio) e 2 o estágio (linha inferior).

10 Pipetagem reversa (esgotamento parcial) É uma técnica de pipetagem pouco conhecida. Recomenda-se fortemente o uso desta técnica em casos de pipetagem de líquidos viscosos, voláteis e espumantes. Uso da pipetagem reversa em casos de pipetagem repetida de um volume do mesmo líquido (por exemplo, em dosagens de proteína amostra e curva padrão) pode melhorar a confiabilidade do método até 10 vezes. A transferência de líquidos por esta técnica resulta em um volume que sobra na ponteira após da transferência que pode ser uma desvantagem caso de líquidos caros ou de volume limitado. Porém, a grande vantagem consiste em ejeção de líquido viscoso ou espumante, onde é praticamente impossível realizar o esgotamento total (da técnica direta). Caso de líquidos voláteis, a transferência do líquido pode ser acompanhada por gotejamento do líquido fora da ponteira (vapor do líquido volátil expande o ar dentro da pipeta). A técnica da pipetagem reversa garante um volume de reserva na ponteira que permite a transferência de volume correto até de líquido bastante volátil. princípio de transferência de líquido é mostrado na Figura 3: Figura 3: Esquema de procedimento usado por a técnica de pipetagem reversa. Linhas pontilhadas representam as posições de botão de esgotamento: Repouso (linha superior), 1 o estágio (linha no meio) e 2 o estágio (linha inferior) Teste de calibração Cada micropipeta é calibrada para o valor indicado (valor teórico) corresponder ao valor efetivamente medido (valor real) na faixa da precisão de micropipeta (erro 2% para pipetas P10, P20, P100, P200, P1000 e 5% para pipetas P2 e P5000). Porém, com tempo e uso prolongado, os componentes mecânicos são sujeitos ao desgaste ou disfunção resultante de uso inadequado.

11 A medição de volume é um passo importante em qualquer laboratório porque um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado obtido. Assim, é essencial a verificação da calibração das micropipetas nas mesmas condições em que são utilizadas no laboratório. Esta verificação consiste essencialmente em um conjunto de medições usadas para re-estabelecer/atualizar a relação entre o valor indicado e o valor efetivamente medido. Normalmente, a verificação deve ser realizada nas seguintes situações: - após uma manutenção e/ou troca de peças; - após de um período de uso (~1 ano); - quando a pipeta sofre um dano: queda, contaminação da haste, etc; - de acordo com orientações do fabricante; Empregam-se geralmente três métodos de calibração de pipetas automáticas: 1. Método gravimétrico: uma série de medições do peso de líquido pipetado (considerando a temperatura, umidade, pressão atmosférica e coeficiente de expansão) posteriormente convertida em volume. Este método é realizado por laboratórios de calibração especializados. 2. Método titrimétrico: uma série de medições de quantidades de NaH com concentração conhecida em volumes pipetados (sem interferência da temperatura, umidade ou pressão atmosférica). Exige uma padronização das soluções envolvidas. 3. Método fotométrico: uma série de medições fotométricas de diferentes diluições de um cromóforo com concentração conhecida. Este método pode ser facilmente implantado no laboratório. Para a análise dos resultados da calibração, as séries de medições são convertidas para volume (valor efetivamente medido) e comparados com volumes ajustados no indicador da micropipeta (valores indicados). Calcula-se uma média (para mesmos volumes) ou regressão linear (para volumes diferentes) ± desvio padrão.

12 bjetivo Geral Aprender os modos de pipetagem positivo e negativo, determinar o limite de precisão de micropipetas e testar a sua calibração (volume real). Materiais Água destilada Glicerina ou solução de sacarose 20% Etanol 1 unidade de cada micropipeta automática de volume variável (P20, P100, P200 ou P1000) balança de precisão de 1 mg (3 ou 4 casas decimais) ponteiras 1 béquer Procedimento s líquidos a serem utilizados serão previamente preparados pelos colaboradores da disciplina. Para as pipetagens poderão ser utilizadas as micropipetas de vários volumes máximos, tais como P20, P100, P200 e P ) Pese o béquer seco e anote 2) Pipete água com volume máximo (nominal) da micropipeta no modo positivo para o béquer e pese o béquer com o líquido. Anote o peso na tabela. Repita este passo 10 vezes. 3) Pipete água com volume máximo (nominal) da micropipeta no modo negativo para o béquer e pese o béquer com o líquido. Anote o peso na tabela. Repita este passo 10 vezes. 4) Pipete água com 10% do volume máximo (nominal) da micropipeta no modo positivo para o béquer e pese o béquer com o líquido. Anote o peso na tabela. Repita este passo 10 vezes. 5) Pipete água com 10% do volume máximo (nominal) da micropipeta no modo negativo para o béquer e pese o béquer com o líquido. Anote o peso na tabela. Repita este passo 10 vezes. 6) Repita os passos 2) e 3) com etanol. 7) Repita os passos 2) e 3) com glicerina ou sacarose 20 %. 8) Pipete água com 20%, 40%, 60%, 80% e 100% do volume máximo (nominal) da micropipeta no modo positivo, ajustando o volume sempre no sentido horário, para o

13 béquer e pese o béquer com o líquido. Anote o peso na tabela. Repita este passo, ajustando o volume aleatoriamente, isto é, 2 volumes (a sua escolha) no sentido horário e 3 volumes restantes no sentido anti-horário. Análise dos dados Fazer uma tabela contendo os valores de peso de cada pipetagem. fazer gráficos dos valores de peso de pipetagem de água com volumes 100% e 10% do volume nominal da micropipeta um gráfico para modo positivo e um gráfico para modo negativo. fazer gráfico os valores de peso de pipetagem de etanol. fazer em gráfico os valores de peso de pipetagem de glicerina ou sacarose 20% Fazer análise da variação de volume por pipetagem para os dois modos e para todos líquidos. Expresse o valor médio do volume pipetado ± desvio padrão para cada modo e líquido. Discuta a precisão da calibração da pipeta (diferença do volume médio determinado experimentalmente com o volume garantido pelo fabricante). compare a precisão de modo positivo com o modo negativo em relação de líquidos viscosos e voláteis. discuta a importância de tipo de ajuste de um lado só do volume no marcador da pipeta em relação da precisão da pipetagem e compare o volume real com volume ajustado.

14 Experimento 2 Espectrofotometria: Conceitos e Aplicação Abstract The light absorption phenomenon directly by macromolecules or chromophores formed by secondary reactions is used by spectral characterization and/or quantification of such substances through spectrophotometry. The purpose of this experiment is to present UVvis electronic absorption spectrometry technique applied to Biochemistry, exploring the Lambert-Beer s law. To this class, it will be used Biuret method to protein quantification, firstly determining the wavelength of maximum absorbance of the cromophore to build a standard curve for the molar extinction coefficient calculation that will be used after to determine the concentration of an unknown sample. Resumo fenômeno de absorção de luz diretamente por macromoléculas ou cromóforos formados por reações secundárias é usado para caracterização espectral e/ou quantificação dessas substâncias por espectrofotometria. Este experimento didático tem como proposta apresentar a técnica de espectrometria de absorção eletrônica no UV-vis aplicada à Bioquímica, explorando a Lei de Lambert-Beer. Para esta aula, será usado o método do Biureto para quantificação de proteínas, primeiramente determinando o comprimento de onda de máxima absorção do cromóforo para se construir uma curva-padrão (curva de calibração). Esta curva será usada para a determinação da concentração de proteínas de uma amostra desconhecida.

15 Introdução termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). A maioria dos instrumentos tem, contudo, mecanismos para isolar uma faixa estreita de comprimentos de onda do espectro. s instrumentos que usam filtros para esse propósito são referidos como fotômetros de filtro ou colorímetros e os que utilizam prismas ou grades de difreção são chamados de espectrofotômetros. Comprimento de onda refere-se a distância entre dois picos da propagação da luz que ocorre na forma de onda, e essa distância normente é dada em nanômetros (nm). A radiação eletromagnética inclui desde a energia radiante dos comprimentos de onda curtos dos raios aos comprimentos de onda longos das ondas de rádio. termo luz é usado para descrever a energia dos comprimentos de onda visíveis ao olho humano e àqueles limítrofes. olho humano é capaz de detectar comprimentos de onda entre 380 e 750 nm, entretanto espectrofotômetros são capazes de medir também comprimentos de onda mais curtos (ultravioleta, UV) ou mais longos (infra-vermelho, IV) (Fig. 1). Fig. 1. Espectro eletromagnético evidenciando a faixa dos comprimentos de onda visíveis. (fonte: e

16 A espectrofotometria é um dos métodos ópticos de análises mais usados nas investigações bioquímicas (Fig. 2). espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a intensidade de luz absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante, como por exemplo, a água que absorve fortemente na região do IV. A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem da estrutura molecular e é característica para cada substância química. Quando a luz atravessa uma solução de determinada substância, parte da energia é absorvida (absorbância). A cor das substâncias se deve a não absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos. Esse fenômeno pode ser usado para quantificação de substâncias por meio da intensidade de absorbância em um comprimento de onda específico, com base em uma curva-padrão, utilizando-se da Lei de Lambert-Beer (PUNGR, 1995). Fig. 2. Esquema óptico simplificado de um espectrofotômetro. (fonte: Fundamentação Teórica Considere um feixe de luz incidente com intensidade I o passando por uma cubeta contendo uma solução de uma determinada substância que absorve luz de certo comprimento de onda (Fig. 3). A intensidade do feixe de luz transmitido (I) será sempre menor que I o, sendo que a transmitância (T) é definida como uma relação entre a intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz incidente (Lei de Beer). T = I/I o

17 Fig. 3. Esquema demonstrando a incidência de um feixe de luz em uma cubeta e sua transmitância. (fonte: eer_lambert.png/300px-beer_lambert.png) À medida que aumentamos a concentração da substância em solução, a transmitância varia em relação inversa ao logaritmo da concentração. Em conseqüência disso, pode-se definir um novo termo, absorbância (A), que será diretamente proporcional à concentração. Portanto, A = log I/I o = log T A = log 1/T Dessa forma, a absorbância é direta e linearmente proporcional à concentração. Esta varia também de forma direta com o caminho óptico (diâmetro interno) da cubeta, ou seja, se dobrarmos o caminho óptico mantendo a concentração constante, teremos um valor de absorbância duas vezes maior. Essa relação é frequentemente referida como Lei de Lambert- Beer: A = a.b.c nde A = abosrbância, a = constante de proporcionalidade (absortividade ou coeficiente de extinção), b = caminho óptico (em centímetros) e c = concentração. Como os valores de A são adimensionais, a unidade de a são as recíprocas daquelas para b e c. Quando b = 1 cm (geralmente é) e c é expresso em mol/l, a constante a pode ser chamada de absortividade ou coeficiente de extinção molar (, epsilon) e é constante para dado comprimento de onda, temperatura, ph, solvente, etc. Assim, a proporcionalidade direta entre absorbância e concentração pode ser usada para a determinação da absortividade de uma determinada substância em determinada condição experimental por meio de realização de uma curva-padrão. Para a construção dessa curva, soluções de concentrações conhecidas da substância devem ser preparadas e as

18 absorbâncias determinadas em determinado comprimento de onda. Posteriormente, essa absortividade pode ser utilizada para quantificação dessa substância em uma solução, cuja concentração é desconhecida (VET & VET, 2006). bjetivo Geral Introduzir os conceitos de espectrofotometria ao aluno utilizando como exemplo a dosagem de proteínas em uma amostra pelo método do Biureto. bjetivos específicos 1. Determinar o espectro de absorção UV-visível do complexo formado entre os íons Cu 2+ presentes no reagente de Biureto e as proteínas. 2. Utilizar o comprimento de onda de absorbância máxima para a elaboração de uma curvapadrão e determinação da absortividade. 3. Calcular a concentração proteína de uma solução de albumina. Materiais Reagente de Biureto H 2 destilada espectrofotômetros cubetas papel absorvente macio para limpeza das cubetas 2 pipetas volumétricas de 2 ml pera estante com 2 tubos de ensaio + 9 tubos de ensaio agitador tipo vórtex Soluções-padrão de soro albumina bovina (BSA) com as seguintes concentrações em % (m/v): 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 e 1,75. amostra de concentração desconhecida

19 Procedimento As soluções a serem utilizadas serão previamente preparadas pelos colaboradores da disciplina ou preparadas pelos estudantes dependendo da disponibilidade de tempo. Caso sejam fornecidas aos estudantes soluções prontas, os mesmos deverão apresentar os cálculos para a preparação de todas as soluções envolvidas no experimento, admitindo a preparação de 1 ml de cada solução-padrão e 100 ml da solução de Biureto. reagente de Biureto é composto por CuS 4 0,15 % (m/v), tartarato de sódio e potássio 0,6 % (m/v) e NaH 0,75 mol/l. Este reagente não deve ser guardado por mais de 30 dias, devido a possibilidade de precipitação do cobre na forma de óxidos ou sais insolúveis. As soluções de BSA usadas como padrão devem ser preparadas com o maior rigor possível a fim de garantir a exatidão da concentração desejada. REAÇÃ: Adicionar 0,5 ml da amostra, branco ou padrão em cada tubo e completar o volume para 1,5 ml com H 2 destilada. Após agitação, adicionar 1,5 ml do reagente de Biureto e tornar a agitar. Após 5 minutos a absorbância pode ser determinada (Cain & Skilleter, 1987). 1. Para a determinação do comprimento de onda, inicialmente, deve fazer a reação com a amostra de concentração 0,25 %. NÃ ESQUECER de fazer um tubo branco com a adição de água no lugar da amostra. Fazer a aquisição do espectro de varredura da reação obtida com a amostra de concentração 0,25 % de 400 a 800 nm, de 10 em 10 nm, zerando sempre com o branco a cada mudança de comprimento de onda. 2. Para a elaboração da curva padrão, numerar os nove tubos de ensaio, sendo um branco, oito padrões e uma amostra desconhecida. Realizar a reação de Biureto e determinar a absorbância no comprimento de onda onde a absorção é máxima, conforme dados obtidos no item 1 acima. Usar os padrões para o cálculo da absortividade e, após isso, usar a absortividade para calcular a concentração da amostra desconhecida. Análise dos dados

20 1) Demonstrar os cálculos para a obtenção do reagente Biureto e das soluções-padrão de BSA; 2) Plotar a absorbância da amostra do item 1 em função do comprimento de onda, determinando o comprimento de onda de máxima absorbância; 3) Plotar as absorbâncias das soluções padrão em função da concentração e calcular a absortividade; 4) Determinar a concentração da amostra desconhecida; Exercício: Descreva o princípio do método de Biureto para a dosagem de proteínas, relacionando suas vantagens e desvantagens em relação a outros métodos para dosagem de proteínas. Referências Bibliográficas 1. PUNGR, E. A practical guide to instrumental analysis. Boca Raton: CRC Press, c p. 2. VET, D; VET, J.G. Bioquímica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, CAIN, K.; SKILLETER, D.N. Preparation and use of mitochondria in toxicological research. Em: SNELL, K.; MULLCK, B. (ed.), Biochemical Toxicology, xford, IRL Press, p , 1987.

21 Experimento 3 Aminoácidos: Estudo da Estrutura e Propriedade Ácido-Base. Abstract The purpose of this experiment is to introduce structural aspects of the amino acids, study their properties and structural differences, in order to learn some characteristics of protein "building blocks" through the acid-base titrations. From the experimental point of view, will just be used acid-base titration techniques, however, the aim is to illustrate several characteristics of these compounds, in order to lead the students beyond to the discussion presented in the practical class. Resumo Este experimento didático tem como proposta fazer com que os estudantes de Transformações Bioquímicas tenham contato com os aspectos estruturais dos aminoácidos, estudem suas propriedades e diferenças estruturais e aprendam, por meio de titulação, as propriedades ácido-base das unidades monoméricas que constituem as proteínas. Do ponto de vista experimental, serão utilizadas técnicas simples de titulação ácido-base, porém, permitirá que o estudante correlacione diversas características estruturais destes compostos com seu comportamento químico fixando conceitos teóricos.

22 Introdução Em química, um aminoácido é qualquer molécula que contém simultaneamente grupos funcionais amina e ácido carboxílico. Em bioquímica, este termo é usado como termo curto e geral para referir os -aminoácidos, ou seja, ácidos carboxílicos em que as funções amino estão ligadas às posições (ou posição 2 em relação à carboxila). Na natureza existem cerca de aminoácidos, entretanto, somente 21 podem ser metabolizados pelo organismo humano, sendo 20 aqueles que geralmente constituem as proteínas. Dentre estes, 8 são chamados aminoácidos essenciais, isto é, não podem ser sintetizados pelo organismo humano, e precisam ser obtidos através de alimentos de origem animal ou vegetal. s outros 12 aminoácidos que geralmente constituem as proteínas são produzidos por grande parte dos organismos superiores e são chamados não essenciais. Há um aminoácido, a taurina, que está presente nos organismos superiores, mas não na constituição das proteínas. Aminoácidos essenciais (não sintetizados pelo organismo humano): isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina. Aminoácidos não-essenciais (sintetizados pelo organismo humano): arginina, alanina, asparagina, cisteína, glicina, glutamina, histidina, prolina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina e tirosina. Contudo, esta classificação não pode ser tomada como algo geral para todos os organismos superiores e em todas as etapas de seus ciclos de vida. Em crianças, por exemplo, os aminoácidos cisteína, tirosina, histidina e arginina são considerados semi-essenciais uma vez que as etapas metabólicas para sintetizar estes aminoácidos não estão completamente desenvolvidas. Portanto, esta classificação de essencial e não-essencial não reflete a importância destes -aminoácidos, uma vez que, todos os 20 -aminoácidos são necessários na constituição de proteínas e peptídeos, conseqüentemente, de toda a matéria viva. aminoácido mais simples é a glicina (Figura 1), e possui apenas um átomo de hidrogênio em sua cadeia lateral. A alanina vem a seguir, com um grupamento metila. Cadeias laterais hidrocarbônicas maiores são encontradas na valina, leucina e isoleucina. A prolina também tem uma cadeia lateral alifática, mas difere dos outros membros do conjunto dos vinte por sua cadeia lateral ser ligada tanto ao nitrogênio quanto ao átomo de carbono.

23 Esta resultante estrutura cíclica influencia fortemente a arquitetura das proteínas. Três aminoácidos com cadeias laterais aromáticas fazem parte do conjunto dos vinte. A fenilalanina contém um substituinte fenila ligado a um grupamento metileno. anel aromático da tirosina contém uma hidroxila, o que torna a tirosina menos hidrofóbica do que a fenilalanina. triptofano tem um anel indólico ligado a um grupamento metileno. Dois aminoácidos, serina e treonina, contêm hidroxilas alifáticas, o que as tornam muito mais hidrofílicas e reativas. Vamos agora aos aminoácidos com cadeias laterais muito polares, sendo altamente hidrofílicos. A lisina e a arginina têm cargas positivas em ph neutro. A histidina pode não ter carga ou tê-la positiva, dependendo de seu ambiente local. As cadeias laterais da arginina e da lisina são as mais longas no conjunto dos vinte. H H H 2 N H S H H NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 L-isoleucina L-leucina L-lisina L-metionina L-fenilalanina H H NH 2 NH 2 H HN NH 2 H NH 2 H H 2 N NH 2 H L-treonina L-valina L-triptofano L-alanina L-aspargina H NH 2 H HS NH 2 H H NH 2 H H 2 N NH 2 H NH 2 H ácido L-aspártico L-cisteína ácido L-glutâmico L-glutamina glicina H NH 2 H H N H H H NH 2 H 2 N NH N H NH 2 H N HN NH 2 H L-serina L-prolina L-tirosina L-arginina L-histidina Figura 1. Estrutura dos 20 L-aminoácidos encontrados em proteínas. Existem dois aminoácidos com cadeias laterais ácidas, o ácido aspártico e o ácido glutâmico. Esses aminoácidos são geralmente chamados de aspartato e glutamato para salientar que suas cadeias laterais têm, quase sempre, cargas negativas no ph fisiológico. A glutamina e a asparagina são derivados não carregados de glutamato e aspartato que contêm uma amida terminal em vez de um carboxilato. Sete dos vinte aminoácidos têm cadeias laterais facilmente ionizáveis. Um átomo de enxofre está presente nas cadeias laterais de dois aminoácidos. A cisteína contém uma sulfidrila (-SH) e a metionina possui um átomo de

24 enxofre em uma ligação tioéter (-S-CH 3 ). Ambas as cadeias laterais que contêm enxofre são hidrofóbicas. Deve-se destacar que a maioria destes aminoácidos presentes em proteínas possui pelo menos um centro quiral definido com estereoquímica (S) com exceção da cisteína que é (R) (notações de Cahn-Ingold-Prelog) e da glicina que não possui centro quiral (Figura 1); ainda, todos os aminoácidos comuns em proteínas são freqüentemente denominados L- aminoácidos, baseados na nomenclatura do gliceraldeído (configurações de Fisher). Estas características conferem a estes compostos uma grande diversidade química e estrutural, permitindo que estes possam constituir uma gama enorme de diferentes proteínas com diferentes arranjos espaciais e as mais diversas funções (Figura 2). Alguns autores relatam que para formar uma proteína é necessária uma cadeia com mais de 70 aminoácidos. Já os peptídeos ( fragmentos de proteínas ) podem ser formados por dois ou mais aminoácidos. Figura 2. Esquema representativo dos diferentes níveis de estrutura protéica da hemoglobina (LEHNINGER, NELSN & CX, 2006). Todos os aminoácidos são derivados de intermediários da glicólise, do ciclo do ácido cítrico (Krebs) ou da via das pentoses. nitrogênio entra nessas vias através do glutamato. Há uma grande variação no nível de complexidade destas vias, sendo que alguns aminoácidos estão a apenas alguns passos enzimáticos dos seus precursores e em outros as vias são complexas, como no caso dos aminoácidos aromáticos. De uma maneira geral, o conhecimento sobre as estruturas de aminoácidos, a compreensão de suas peculiaridades estruturais e reacionais, bem como o estudo de sua importância na química da vida (constituição de proteínas) justifica a relevância e abordagem deste tema nesta primeira aula do curso de Transformações Bioquímicas da UFABC.

25 FUNDAMENTAÇÃ TEÓRICA Propriedades ácido-base dos aminoácidos No organismo, os aminoácidos existem na forma de zwitterion, ou seja, compostos com cargas positivas e negativas totalizando uma carga nula (Figura 3). R NH 3 Figura 3. Estrutura de um aminoácido na forma de zwitterion. Quimicamente, os aminoácidos podem ser considerados como compostos anfotéricos uma vez que podem atuar como ácidos na presença de bases (Equação 1) ou como bases na presença de ácidos (Equação 2), seguindo a definição de Brönsted. R NH 2 H (aq) + H (aq) (aq) R NH 2 + H 2 (l) Ácido Base Base Ácido Equação 1. Aminoácido atuando como ácido. R NH 2 H (aq) H 3 (aq) + H (aq) R NH 3 + H 2 (l) Base Ácido Ácido Base Equação 2. Aminoácido atuando como base. Um estudo destas propriedades ácido-base pode ser realizado utilizando-se titulações partindo-se de aminoácidos contidos em soluções ácidas (completamente protonados na função amina). Nestes casos, quando se adiciona base (H ) na solução, o ph aumenta gradativamente, sendo possível monitorar o seu valor em função das quantidades adicionadas pelo o uso de phmetros ou papel de indicador universal (0-14 unidades). Se forem lançados

26 em gráfico o volume ou numero de mols de base (H ) em função do ph da mistura resultante, é possível obter algumas das propriedades intrínsecas dos aminoácidos como o pk a (logaritmo negativo da constante de ionização) e pi (ponto isoelétrico logaritmo negativo do ph em que os aminoácidos estão completamente na forma de zwitterion ) (Figura 4). Titulação da ALANINA Equivalentes de H - Figura 4. Curva de Titulação da Alanina. De uma maneira geral, quando consideramos um ácido do tipo HA ionizado em solução aquosa (Equação 3), podemos escrever a seguinte equação para descrever o ph do meio (Equação 4 Equação de Henderson-Hasselbach): HA (aq) + H 2 (l) H 3 (aq) + A (aq) Equação 3. Ácido de Brönsted em equilíbrio aquoso. ph = pk a + log [A ] [HA] Equação 4. Equação de Henderson-Hasselbach. Uma análise simples da equação de Henderson Hasselbach pode fornecer o pk a de um determinado ácido de Brönsted. Se o termo logarítmico da Equação 4 da for igual a 0 (zero), ou seja, quando as [HA] e [A ] são idênticas no equilíbrio, teremos que o ph do meio é igual ao pk a (ph = pk a ).

27 Tomando como exemplo o aminoácido alanina (Figura 4), pode-se verificar experimentalmente que durante sua titulação com base surge um primeiro ponto de inflexão na curva (ponto (I), pk a1 ) onde as variações de ph do meio são muito pequenas em função das adições de base. Assim, pode-se dizer que as concentrações relativas das espécies em equilíbrio [A ]/[HA] (no caso, considere as duas espécies de aminoácidos da Equação 5) não variam significativamente nas imediações deste ponto porque o sistema está tamponado. ponto de inflexão (II) é obtido numa faixa muito pequena da variação da quantidade de base adicionada, caracterizando o ponto de viragem na titulação da função ácido carboxílico (função mais acídica) e neste caso o pi (ponto isoelétrico). No ponto (III), de maneira similar ao que ocorre para o ponto (I), obtêm-se o pk a2 da função amina protonada. As Equações 5 e 6 descrevem os equilíbrios das espécies químicas durante as titulações. H 3 C NH 3 H (aq) K a1 + H 2 H (l) 3 C (aq) NH 3 + H 3 (aq) Equação 5. Equilíbrio envolvido na primeira ionização. H 3 C NH 3 (aq) K a2 H + H 2 3 C (l) (aq) NH 2 + H 3 (aq) Equação 6. Equilíbrio envolvido na segunda ionização. bjetivo Determinar os valores de pk a de aminoácidos por titulações ácido-base. Construir os gráficos e comparar os perfis das curvas, correlacionando os valores de pk a. Estudar as estruturas dos aminoácidos por meio de exercícios com as estruturas moleculares em 3 dimensões. Materiais

28 Soluções 0,1 mol/l de glicina, arginina e ácido glutâmico. Solução 4 mol/l de HCl Solução 0,25 mol/l de NaH phmetro 1 pipetas volumétricas de 20 ml 1 pipetas de Pasteur 1 Bureta 1 béquer de 100 ml Procedimento As soluções a serem utilizadas serão previamente preparadas pelos colaboradores da disciplina ou preparadas pelos estudantes dependendo da disponibilidade de tempo. Caso sejam fornecidas aos estudantes soluções prontas, os mesmos deverão apresentar os cálculos para a preparação de todas as soluções envolvidas no experimento, admitindo a preparação de 100 ml de cada e partindo dos reagentes comerciais. Para as titulações, poderão ser utilizados vários aminoácidos, sendo recomendado didaticamente o uso de glicina, arginina e ácido glutâmico. 1) Pipete 20 ml de uma solução 0,05 mol/l da solução de aminoácido e adicione em um béquer de 100 ml. Insira o eletrodo do phmetro (devidamente calibrado) no béquer e faça a medida do ph e anote o valor. Em seguida, acidifique a solução do aminoácido com HCl 4 mol/l até o ph do meio atingir 1,0. Seja cuidadoso com a adição de ácido para não baixar demasiadamente o ph. Utilize conta-gotas para esta etapa. 2) Em seguida, complete uma bureta de 50 ml com solução de NaH 0,125 mol/l e inicie a titulação adicionando porções de 0,5 ml da base, medindo o ph após cada adição. Lembre-se de agitar com cuidado a mistura titulada e então aferir o ph. (Muito cuidado ao agitar a solução para não quebrar o eletrodo do phmetro!). 3) Efetue adições sucessivas até que o ph do meio atinja valores entre 12,0 a 12,5. Após isso, lave o eletrodo com água destilada e coloque-o imerso na solução tampão de armazenamento do eletrodo. 4) Faça o procedimento para um aminoácido sugerido. Cada grupo deverá titular um aminoácido e os resultados deverão ser trocados entre os grupos de modo que cada grupo possua as três titulações para elaborar o relatório.

29 Análise dos dados 1) Uma tabela contendo os valores de ph juntamente com os respectivos volumes de NaH adicionados para cada aminoácido titulado. 2) Lance em gráfico os valores de ph (eixo y) em função dos volumes da solução titulante de NaH (eixo x). Faça isso para cada aminoácido (três gráficos separados) e depois faça um gráfico contendo as três curvas superpostas. 3) Indique nos gráficos lançados individualmente os valores dos pk a (pk a1, pk a2 e pk ar se houver) e indique o ponto isoelétrico (pi). btenha os valores de pk a determinados experimentalmente (localizando os pontos de inflexão na curvas) e compare-os com os valores de referência da literatura. (Sugestão: no exercício localizado no final deste experimento estão listados todos estes valores de referência da literatura!) 4) Escreva as equações de equilíbrio (todas as etapas) das espécies químicas envolvidas nas titulações. 5) Faça uma análise do perfil das curvas obtidas correlacionando com os valores de pk a obtidos e as funções orgânicas presentes. Você acha que se fossem realizadas adições sucessivas de 0,25 ml de solução de NaH seria possível calcular o valor de pk a com maior precisão? E se fosse utilizada uma solução 0,1 mol/l de NaH? 6) No caso específico do ácido glutâmico, os primeiros valores de pk a são relativamente difíceis de serem obtidos experimentalmente. Explique estes fatos dizendo se as medidas citadas acima podem melhorar a qualidade da curva e facilitar a obtenção destes valores de pk a. 7) Após construir todas as curvas aponte qual a espécie predominante nas soluções iniciais de aminoácidos utilizadas (medida inicial do ph antes da adição do HCl). Explique suas respostas. EXERCÍCI Atribua o nome de cada aminoácido (como exemplificado para a L-alanina) comparando as estruturas químicas (Figura 1) com as projeções moleculares 3D abaixo. Nas estruturas, considere os átomos de carbono em cinza, oxigênio em vermelho, nitrogênio em azul, enxofre em amarelo e hidrogênio em branco. Não se esqueça de considerar as múltiplas ligações que estão implícitas nestes modelos (por exemplo, uma única ligação entre um dos

30 carbonos e um dos oxigênios da L-alanina, significando que há uma dupla ligação pois o oxigênio é bivalente veja a posição circulada). L-alanina / 3,9 / 4,3

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33 Referências Bibliográficas 1. LEHNINGER, A.L; NELSN, D.L; CX, M.M. Princípios de bioquímica. 4 ed. São Paulo: Sarvier, p. 2. BERG, M.J.; TYMCZK, J.L., STRYER, L. Biochemistry 5th. Edition. W. H. Freeman and Company. New York, BETTELHEIM, F.A.; LANDESBERG, J.M. Laboratory Experiments for General, rganic & Biochemistry, Harcourt College Pub, New York, VET, D.; VET, J.G. Bioquímica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006.

34 Experimento 4 - Desnaturação e Precipitação de Proteínas: Atividade Enzimática Presente no Suco do Abacaxi sobre Gelatina (Colágeno). Abstract The first aim of this experiment is to demonstrate the enzyme activity present in pineapple, these activities promote the degradation of collagen, additionally, the experiment shows that the proteolytic activity can be destroyed boiling the pineapple juice, probably due the protein denaturation process caused by the heating. The second aim of this experiment is to demonstrate the protein precipitation by the addition of alcohol (coagulation) or ammonium sulfate (salting out) in the collagen solution, showing the modification of protein solubility. Resumo primeiro objetivo desse experimento é demonstrar a atividade enzimática presente no abacaxi, essas atividades promovem a degradação do colágeno, adicionalmente o experimento mostra que a atividade proteolítica pode ser destruída pela fervura do suco de abacaxi, provavelmente devido ao processo de desnaturação protéica causado pelo aquecimento. segundo objetivo do experimento é mostrar a precipitação protéica pela adição de álcool (coagulação) ou sulfato de amônio (salting out) na solução de colágeno, mostrando a alteração da solubilidade protéica.

35 Introdução Enzimas proteolíticas ou proteases catalisam o rompimento das ligações peptídicas em proteínas. São enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptídeo-hidrolases ou peptidases. Estas enzimas constituem uma grande família (EC 3.4), dividida em endopeptidases ou proteinases (EC ) e exopetidases (EC ), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia peptídica. Estas endopeptidases podem ser ainda subdivididas de acordo com o grupo reativo no sítio ativo envolvido com a catálise em serina- (EC ), cisteína- (EC ), aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC ) e metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC ). As enzimas cujo mecanismo de ação não está completamente elucidado são classificadas no subgrupo EC Exopeptidases As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido (aminopeptidases), um dipeptídeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptídeo (tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido (carboxipeptidases) ou um dipeptídeo (peptidil-dipeptidases). Endopeptidases Endopeptidases atuam preferencialmente nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as regiões N e C terminal. Tipos catalíticos Segundo Barret, 1994 as proteases são classificadas em carboxipeptidases e as endopeptidases e são divididas em subclasses, tendo como base o seu mecanismo catalítico. As carboxipeptidases foram subdivididas em serino-, metalo- e cisteíno- carboxipeptidases e as endopeptidases em serino-, cisteino-, aspártico- e metaloendopeptidases. Serino peptidases possuem um resíduo de serina em seu centro ativo, enquanto as aspártico-peptidases têm duas unidades de ácido aspártico no seu centro catalítico. Cisteíno-proteases apresentam um aminoácido cisteína e as metalo-proteases usam um íon metal no seu mecanismo catalítico.

36 Proteases: função e aplicação Proteases representam uma classe de enzimas com importantes papéis em processos fisiológicos. Além disto, elas possuem aplicação comercial, estando entre os três maiores grupos de enzimas industriais, sendo responsáveis por 60% da venda internacional de enzimas. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacêuticos. As enzimas proteolíticas também participam no catabolismo de proteínas, tanto nas vias degradativas como nas biossintéticas, e na liberação de hormônios peptídeos farmaceuticamente ativos a partir de proteínas precursoras. Certas modificações específicas e seletivas de proteínas durante a ativação de enzimas ocorrem via proteólise, que também colabora no transporte de proteínas secretórias na membrana. As proteases têm também uma variedade de aplicações principalmente na indústria de detergentes e de alimentos. Tendo em vista os recentes acordos mundiais para uso de tecnologias não poluentes, as proteases começaram a ser usadas em larga escala no tratamento do couro, em substituição aos compostos tóxicos e poluentes até então usados. Na indústria farmacêutica, as proteases são usadas em pomadas cicatrizantes e têm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as proteínas em peptídeos e aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas células; devido a seu papel despolimerizante, as enzimas extracelulares têm um papel importante na nutrição. bjetivo Demonstrar a atividade proteolítica presente no suco de abacaxi, o efeito da desnaturação protéica por temperatura e o efeito da alteração de solubilidade protéica, e conseqüente precipitação, provocados pela adição de álcool ou sal de amônio em solução de gelatina (colágeno).

37 Materiais 8 tubos de ensaio de 20 ml 1 tubo de ensaio de 30 ml Estante para tubos de ensaio Béquer de vidro de 100 ml (para aquecer água) Béquer de 25 ou 50 ml (para água destilada) Funil de vidro pequeno e papel de filtro, tesoura para cortar o papel de filtro Recipiente com gelo Almofariz e pistilo Pipetadores automáticos de 1,0 ml e ponteiras, ou pipetas de vidro de 5,0 ml Faca ou estilete Luvas de látex Bastão de vidro (para dissolver a gelatina) Placa aquecida ou banho-maria 100ºC Banho-maria 60ºC Banho-maria 30ºC Balança Reagentes Solução de sulfato de amônio 3 mol/l Etanol absoluto ou comercial 99,3º INPM Abacaxi maduro (1 fatia média) Gelatina incolor e sem sabor Água destilada Procedimento Parte 1: Atividade enzimática do suco de abacaxi e desnaturação protéica por aquecimento. Extração do suco de abacaxi Uma fatia de abacaxi deve ser cortada em pequenos pedaços. A extração do suco será feita macerando-se os pedaços utilizando almofariz e pistilo. suco deve em seguida ser filtrado utilizando funil de vidro e papel de filtro em um tubo de ensaio de 20 ml. tubo deverá ser armazenado no gelo. Preparo da gelatina Pesar 2 g de gelatina incolor e sem sabor de qualquer marca comercialmente disponível e dissolver em 20 ml de água destilada, em tudo de ensaio de 30 ml, após

38 solubilização a solução de gelatina deve ser aquecida a 60ºC e mantida nessa temperatura até o uso. Ensaio Pipetar os dois primeiros itens da tabela 1 nos tubos de ensaio de 20 ml. Incubar as amostras aquecidas (60ºC e fervido) em suas respectivas temperaturas por 5 minutos e resfriar no gelo imediatamente. Após o resfriamento das amostras fervidas adicionar em todos os tubos a solução de gelatina. Incubar as amostras por 10 minutos a 37 o.c e em seguida resfriar todas as amostras no gelo por 15 minutos, observar e anotar o resultado. Tabela 1. Resumo do procedimento experimental. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Água 2,0 ml Amostra Abacaxi - 2,0 ml - - Amostra Abacaxi 60ºC - - 2,0 ml - Amostra Abacaxi Fervida ,0 ml Gelatina 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml Parte 2: Precipitação de proteínas. Pipetar nos tubos de ensaio de 20 ml os reagentes conforme a tabela 2, realizar o experimento em temperatura ambiente (~ 25ºC). bservar e anotar o resultado para posterior discussão. Tabela 2. Resumo do procedimento experimental. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Água 2,0 ml - - Sulfato de amônio - 2,0 ml - Etanol Absoluto - - 2,0 ml Gelatina 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml

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