UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA. Comparação entre dois métodos para criopreservação de sêmen ovino

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA Comparação entre dois métodos para criopreservação de sêmen ovino MILTON ALBUQUERQUE FRANCO SOUZA Médico Veterinário Salvador, 2012

2 i MILTON ALBUQUERQUE FRANCO SOUZA Comparação entre dois métodos para criopreservação de sêmen ovino Dissertação apresentada ao curso de pós-graduação em Ciência animal nos trópicos, Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Orientador: Dr. Max Vitória Resende Salvador Semestre 2/2012

3 ii Sistema de Bibliotecas da UFBA Souza, Milton Albuquerque Franco. Comparação entre dois métodos para criopreservação de sêmen ovino / Milton Albuquerque Franco Souza f. : il. Inclui anexos. Orientador: Prof. Dr. Max Vitória Resende. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Salvador, Ovino - Reprodução. 2. Ovino - Criopreservação. 3. Sêmen. I. Resende, Max Vitória. II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia. III. Título. CDD CDU /.38

4 iii TERMO DE APROVAÇÃO MILTON ALBUQUERQUE FRANCO SOUZA Comparação entre dois métodos para criopreservação de sêmen ovino Dissertação aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos trópicos, Universidade Federal da Bahia, pela seguinte banca examinadora: Prof. Dr. Max Vitória Resende Presidente da Banca Prof. Dr. Alberto Lopes Gusmão Prof. Dr. Ana Karina da Silva Cavalcante Apresentada em:

5 iv AGRADECIMENTOS A Deus que guia os meus caminhos; Ao meu avô Clovis Franco, em quem me espelho; minha avó Wilma Franco; meus pais, Osny Souza e Carla Franco; meus irmãos: Daniel, Gabriele e Camila; Camila Caribé, minha noiva, que suportou minha ausência por muito tempo e todos os meus familiares pelo apoio e incentivo durante toda a minha escalada; Ao meu orientador, Prof. Dr. Max Vitória Resende, pelo incentivo, participação nas atividades, paciência, capacidade, empenho em dividir todo o seu conhecimento e estimulo para estar sempre buscando aprender cada vez mais e mais; Ao Prof. Dr. Alberto Lopes Gusmão por todas as oportunidades deste os estágios na graduação, confiança e, sobretudo por todos os ensinamentos passados durante o tempo de convivência, e a completa disposição dos animais e instalações para o desenvolvimento de todo o experimento; Aos poucos e bons amigos verdadeiros que pude formar durante a caminhada da graduação que trago junto a mim até os dias de hoje: Lindomar Brito, Nivaldo Filho, Amanda e Aline Souza ( Minhas irmãs ), Leandro Mendes Gomes grande parceiro, amigo irmão que me acompanha desde o ingresso na universidade dividindo as alegrias e ajuda mútua para enfrentar as dificuldades durante todo o tempo;

6 v A todos que compõem o laboratório de Bioquímica e Biologia molecular (LabNq), em especial as Prof. Drª. Silvia Lima Costa e a Prof. Drª. Maria de Fátima Dias Costa por todo carinho e apoio e parceria para o desenvolvimento de testes complementares; Enfim a todos que direta ou indiretamente me ajudaram a alcançar mais esse objetivo.

7 Quando ouvir alguém dizer que já não sonha mais, É bom saber que é capaz de morrer, Quem não tem esperança, Que não faz nada nascer... Preste atenção, Não abra mão dos próprios sonhos... Não tem perdão, Não deixe de sonhar, Não deixe de sorrir, Pois não vai encontrar Quem vá sorrir por ti... vi

8 vii RESUMO Com o interesse em intensificar a produção ovina, a inseminação artificial (IA) com sêmen criopreservado apresenta papel fundamental no melhoramento genético. Objetivou-se, no presente trabalho, comparar os parâmetros espermáticos do sêmen ovino (motilidade, vigor), testes complementares (termorresistência TTR, hiposmótico HO, teste do MTT e coloração), em dois sistemas de criopreservação de sêmen ovino com diferentes crioprotetores e suas associações. Para tanto, foram realizadas colheitas e criopreservação de sêmen e as amostras foram divididas em seis grupos: Grupo controle, utilizando o método convencional (palhetas soltas) e glicerol 5% e os Grupos teste (palhetas soltas e em raques Glicerol 5% + iodixanol 2,5% e Iodixanol 2,5%). Em relação aos parâmetros espermáticos não foi observada diferença significativa (p>0,05) entre os grupos. Para o TTR, foi observada diferença estatística (p<0,05), onde os grupos glicerol 5% e iodixanol 2,5% não-raqueado foram superiores aos demais. O grupo controle mostrou-se superior aos demais no teste HO. Para a coloração observou-se diferença entre os grupos, assim como no teste do MTT Palavras-Chaves: Criopreservação, iodixanol, raqueado, sêmen.

9 viii ABSTRACT With the intensifying interest in sheep production, artificial insemination (AI) with semen cryopreserved presents key role in breeding. The aim of the present study was to compare sperm parameters in ram semen (motility, vigor), additional tests (thermo - TTR, hyposmotic - HO, the MTT assay and staining) in two systems of sheep semen cryopreservation and different cryoprotectants and their association. For this purpose, samples were taken and cryopreservation of semen and samples were divided into six groups: control group, using the conventional method (loose straws) and 5% glycerol and test groups (loose straws and raques - Glycerol + 5% iodixanol 2.5% and 2.5% iodixanol). In relation to sperm parameters was not significantly different (p> 0.05) between groups. For TTR, was a statistical difference (p <0.05), where groups glycerol 5% and 2.5% iodixanol non-raqueado were superior to others. The control group was superior to the others in the test HO. For the color difference was observed among the groups, as in the MTT assay. Key Words: Cryopreservation, iodixanol, raqueado, semen.

10 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1 Esquema representativo das partes componentes do espermatozoide...04 Figura 2 Esquema representativo da capacitação espermática...11 Figura 3 Esquema representativo da reação acrossomal (a)...12 Figura 4 Esquema representativo da reação acrossomal (b)...12 Figura 5 Representação da estrutura química da molécula do Iodixanol...28 Figura 6 Características dos espermatozoides submetidos ao teste hiposmótico (microscópio de contraste de fase, 1000x): (A) Host positivo, (B) Host negativo...33 Figura 7 Esquema da caixa térmica utilizada na etapa de resfriamento: a Vista lateral; b Vista superir. 1 Água a 32 C; 2 Gelo comum e reciclável; 3 Recipiente contendo o sêmen...39 Figura 8 Esquema da caixa de congelamento...40 Figura 9 Grupo controle e grupo raqueado...40 Figura 10 Caixa de isopor e suporte com as palhetas e raque em vapor de nitrogênio para criopreservação Figura 11 Características dos espermatozoides submetidos ao teste hiposmótico (microscópio de contraste de fase, 1000x): (A) espermatozoide normal, (B J) espermatozoides com a cauda dobrada e (K - W) espermatozoides com a cauda fortemente dobrada. Adaptado de FONSECA et al., Figura 12 Placa de 96 poços para leitura em espectofotômetro...44 Figura 13 - Característica colorimétrica no teste do MTT...45 Figura 14 Modo de preparo do esfregaço...46

11 x Figura 15 - Classes de espermatozoides analisadas pela técnica de coloração Azul de Tripan/Giemsa. A: Espermatozoide vivo com acrossoma intacto. B: Espermatozoide vivo sem acrossoma. C: Espermatozoide morto com acrossoma. D: Espermatozoide morto sem acrossoma. Fotografia digital obtida a partir da ocular do microscópio. Aumento mínimo de 1000X. Utilizou-se o zoom do equipamento de fotografia digital, devido a isso, os espermatozoides não estão em um mesmo aumento...46 Figura 16 Esquema do delineamento experimental...47 Figura 17 Classes de espermatozoides, expressas em porcentagens, para os animais 1, 2, 3. VI = Vivo com acrossoma intacto; VD = vivo com danos. Colunas com letras diferentes diferem entre si (P<0,05)...53 Figura 18 Foto da placa de microtitulação após a realização de todos os passos do teste do MTT. Legenda: Nas três primeiras linhas da primeira coluna (A1 a C1) estão os controles da reação (Sem células espermáticas SDS 10% e solução de MTT); nas linhas e colunas subsequentes (D1 a A8) estão em triplicata, os sêmens descongelados dos animais testados e dos respectivos grupos experimentais...55

12 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1 Médias e desvios-padrão (DP) da motilidade e do vigor espermático do sêmen refrigerado (Pré-congelação) nos diferentes protocolos Tabela 2 Médias e desvios-padrão (DP) da motilidade e do vigor espermático apósdescongelação das doses de sêmen criopreservados nos diferentes protocolos e crioprotetores Tabela 3 Médias e desvios-padrão (DP) da motilidade e do vigor espermático das doses de sêmen criopreservados nos diferentes protocolos e submetidos ao teste de termorresistência (TTR) Tabela 4 Médias e desvios-padrão (DP) das doses de sêmen criopreservados e submetidos ao teste hiposmótico (HO) Tabela 5 - Classe de espermatozoides, expressa em porcentagem (VI; VD e Mortos), em relação aos grupos experimentais...54 Tabela 06 Médias de absorbâncias do teste do MTT com o sêmen fresco e descongelado...54

13 xii LISTA DE ABREVIATURAS Ca 2 + Bicarbonato de cálcio. AC Adenilato ciclase. AMPc Adenosina monofosfato cíclico. ATP Adenosina trifosfato. CO 2 Dióxido de carbono. CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. DAC anormalidades acrossômicas. DCA defeitos de cauda. DMA Defeitos maiores. DME Defeitos menores. E12 (ELSPBP1, PEBP1 e BSP1) Proteínas envolvidas na capacitação espermática. EROs Espécies reativas de oxigênio. HOST Hiposmótico. H 2 O Formula química da água. IA Inseminação Artificial. MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-y1) -2,5-difenil-brometo). NaCl Cloreto de sódio. PKA Proteína quinase ativada. TTR Teste de Termo resistência. ZP3 Proteína da Zona Pelúcida 3.

14 xiii Sumário LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Estrutura geral dos espermatozoides A membrana plasmática e sua relação com a criopreservação Relação entre a criopreservação, capacitação espermática e a reação acrossomal Considerações sobre a criopreservação de sêmen Etapa de refrigeração Etapa de congelação Descongelação Diluidores do sêmen Crioprotetores Crioprotetores não-penetrantes Crioprotetores penetrantes Glicerol Iodixanol Avaliação do sêmen pré-congelação Vigor e motilidade espermática Avaliação do sêmen descongelado Vigor e Motilidade Teste de termo-resistência (TTR) Teste hiposmótico (HO) Teste do MTT MATERIAL E MÉTODOS Delineamento experimental Local de realização e animais Colheita e avaliação do sêmen... 37

15 xiv 3.4. Processamento do sêmen Diluição e resfriamento Criopreservação Descongelação do sêmen Teste complementares Motilidade e vigor Teste hiposmótico (HO) Teste de termo-resistência (TTR) Teste do MTT Coloração Tripan-Blue / Giemsa Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXO

16 1 1. INTRODUÇÃO A criação de ovinos é uma atividade econômica explorada em todos os continentes. O Brasil possui um rebanho ovino de aproximadamente 16,8 milhões de cabeças, dos quais 56,9% encontram-se na região Nordeste, e nesse aspecto a Bahia destaca com 18,0% do rebanho nacional (IBGE, 2009). Apesar da criação de pequenos ruminantes ter experimentado uma grande expansão durante as duas últimas décadas (SALAMON e MAXWELL, 2000) e desempenhar papel fundamental no suprimento alimentar e geração de renda, principalmente na agricultura familiar no nordeste brasileiro, apresenta baixo potencial genético, dentre outros fatores, o que corrobora para os baixos índices de produtividade e rentabilidade (VIDAL et al., 2006). Dentre outros fatores, o uso de biotecnologias da reprodução, em especial a inseminação artificial (IA) com sêmen congelado é fundamental para programas de melhoramento, pois permitem a difusão em larga escala de genes de interesse econômico e possibilita trocas genética entre rebanhos mesmo distantes (LEBOEUF et al., 2000; SALVADOR et al., 2006; LIMA et al., 2010) ou mesmo depois de mortos, uma vez que o sêmen foi estocado em nitrogênio líquido à -196ºC, permanece viável por tempo indefinido (HAFEZ e HAFEZ, 2004). O uso do sêmen criopreservado apresenta inúmeros benefícios como o melhor aproveitamento de reprodutores e facilidade de comércio (SALAMON e MAXWELL, 1995). No entanto o uso de sêmen conservado não é tão difundido na espécie ovina,

17 2 quando comparada a outras espécies domésticas, devido à dificuldade na utilização do sêmen congelado (ANEL et al., 2006; CARVALHO et al., 2008; O HARA et al., 2010). Isto acontece devido à própria anatomia ovina (CHAVEIRO et al. 2006) e a fatores relacionados a técnica, a qual ocasiona redução da motilidade atribuída às várias causas, como a formação de cristais de gelo, danos oxidativos nas membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e induzir mudanças similares à capacitação e reação acrossomal (SALAMON e MAXWELL, 1995). Além da toxicidade apresentada pelos crioprotetores e ao estresse osmótico (WATSON 2000; COOTER et al., 2005). O desenvolvimento de técnicas adequadas para preservação de sêmen é um dos passos mais importantes no avanço da reprodução animal e vem sendo conseguido pela aplicação de biotécnicas cada vez mais modernas (PAPA et al., 2002). Diante desta importância, torna-se imprescindível a diminuição de custos para aumentar a lucratividade e competitividade entre os profissionais de campo e as empresas de produção e processamento de sêmen, pelo menor consumo do nitrogênio líquido e dinamização da técnica com menor manipulação das paletas e conseguente menor exposição das mãos do profissional com o vapor do nitrogênio e durante o processo de congelação, economizando o máximo possível de tempo durante a criopreservação, aumentando deste modo o volume de sêmen processado. Dentro destas perspectivas, o presente trabalho objetivou comparar dois crioprotetores visando melhorar a eficiência do sêmen ovino criopreservado, para aumento nos índices de prenhez em programas de inseminação artificial utilizando sêmen congelado. Além de validar o iodixanol como crioprotetor para criopreservação de sêmen ovino.

18 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Estrutura geral dos espermatozoides Os espermatozoides são formados dentro dos túbulos seminíferos dos testículos, maturados nos dois terços iniciais do epidídimo e posteriormente armazenados na sua porção caudal, permanecendo quiescentes até a ejaculação (GARNER, HAFEZ, 2004; DACHEUX et al., 2005; MOURA et al., 2010). Os gametas masculinos são células altamente especializadas, alongadas, constituídas de uma cabeça achatada contendo o núcleo e de uma cauda dotada de motilidade. O espermatozoide é todo recoberto pela membrana plasmática (plasmalema). O acrossoma é uma estrutura de parede dupla situada entre a membrana plasmática e a porção anterior da cabeça. O colo conecta a cabeça à cauda, a qual é subdividida em peça intermediária, principal e terminal (HAFEZ e HAFEZ, 2004). São formados nos testículos (FRANCA et al., 2005; DACHEUX et al., 2005). Na figura 1 está representado um espermatozoide e suas regiões distintas quanto à forma e função.

19 4 Figura 1: Esquema representativo das partes componentes do espermatozoide. Fonte: Adaptado de Abnormal morphology of bovine spermatozoa - Barth e Oko, A função primordial do espermatozoide é fornecer informações do genoma haplóide do macho para o oócito, migrar, alcançar à tuba uterina ipsilateral a ovulação, e fecundar o oócito e assim permitir a combinação com o genoma haplóide feminino (HAFEZ e HAFEZ, 2004; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 2005; SOTO, GÓMEZ e LA SOTA, 2008). Para que ocorra esta combinação de genoma, inicia pela fecundação existe a necessidade de alterações bioquímicas prévias tanto no espermatozoide quanto no oócito. O espermatozoide deve ser móvel e estar capacitado para que ocorra sua ligação à zona pelúcida do oócito maturado e em pausa meiótica (GATTI et al., 2005; RATH et al., 2005; SOTO, GÓMEZ e LA SOTA, 2008).

20 A membrana espermática e sua relação com a criopreservação A membrana plasmática envolve todo o espermatozoide e é o componente mais externo. Embora seja contínua sobre a superfície dos espermatozoides, a sua natureza difere regionalmente (FLESH e GADELLA, 2000). A composição de proteínas das membranas de regiões diferentes varia mais do que a composição de lipídios, refletindo a especialização funcional (SCOTT, 1973). Tendo, desta forma, a função de permitir o transporte seletivo de moléculas através da célula, sendo sua integridade importante para que ocorram as reações necessárias à fertilização (JEYENDRAN et al., 1984), juntamente com suas organelas e componentes intracelulares mantém o gradiente químico de íons e outros componentes solúveis (SILVA e GADELLA, 2006). Nas células de eucariontes, a membrana é formada pelo modelo do mosaico fluido, sendo composta por duas camadas de fosfolipídios com proteínas integrais, glicoproteínas de superfície de ligação e glicosídeos organizados (SINGER e NICOLSON, 1972). Contudo, atualmente é aceito que a organização dos lipídios na membrana plasmática é muito mais complexa, sendo arranjados em um mosaico de domínios (LADHA, 1998). Tal como acontece com as células somáticas, a organização da membrana espermática é uma mistura heterogênea de lipídios, esteróis, fosfolipídios, glicolipídios, proteínas e glicoproteínas e, que são distribuídos de forma assimétrica entre os folhetos interno e externo da membrana (APEL-PAZ et al., 2003). Embora exista uma considerável variação entre as diferentes espécies de mamíferos, a membrana plasmática é constituída por aproximadamente 70% de fosfolipídios, 25% de lipídios neutros (colesterol) e 5% de glicolipídios (MANN e LUTWALK-MANN, 1981).

21 6 No espermatozoide ovino, sua composição difere em comparação com outras espécies de mamíferos, cujos espermatozoides são mais resistentes à criopreservação, como os da espécie bovina (PARKS e LYNCHY, 1992). As células espermáticas distinguem-se da maior parte das células somáticas por muitas características físicas e funcionais, tais diferenças são fundamentais para que os espermatozoides possam se adaptar aos mais variados ambientes, seja no trato genital masculino e feminino. Para essa adaptação possuem uma fração elevada de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, em especial o docosapentaenóico (22:5) e docosaexanóico (22:6) (LADHA, 1998; FLESCH e GADELLA, 2000). Para que ocorra a união dos gametas, o espermatozoide deve manter condições básicas, como: metabolismo para a produção de energia, motilidade progressiva, integridade acrossomal e integridade das proteínas de membrana, objetivando a ligação com o gameta feminino e, finalmente, a fecundação (FLESCH e GADELLA, 2000). Durante o processo de criopreservação do sêmen ocorrem varias situações de estresse para as células espermáticas, entre elas: grandes variações de temperaturas, exposição a temperaturas não fisiológicas, estresse osmótico devido a expressivas concentrações de solutos existentes nos meios utilizados para a criopreservação e, pela formação e dissolução de cristais de gelo formados no meio extracelular. Situações, estas que irão comprometer a viabilidade das células espermáticas (WATSON, 2000). Holt (2000) diz que, em geral, qualquer célula viva, quando submetida ao processo de congelação, sofre algum dano decorrente das interações água-soluto que ocorrem durante a formação de cristais de gelo.

22 7 No entanto, Amman e Pickett (1987) afirmam que quando o sêmen é resfriado a temperaturas abaixo de 0 C ocorre a formação de cristais de gelo no meio extracelular, resultando em um aumento na concentração de sais neste fluido e favorecendo a saída de água do meio intracelular para o extracelular, levando a desidratação progressiva do espermatozoide, o que pode resultar em altas concentrações intracelulares de soluto, sendo assim, deletério a célula. Em uma curva de resfriamento muito rápida (>60 C/min.) a água não tem tempo hábil de sair da célula e, em algum ponto abaixo de 10 C, a célula sofrera a congelação interna. As extensões dos danos causados pelo gelo intracelular dependem do grau de formação deste e do tamanho dos cristais. Grandes cristais podem causar danos mecânicos à célula, enquanto que os pequenos podem não ser deletérios, no entanto, se reaquecidos, o crescimento destes pequenos cristais, em decorrência da recristalização, pode vir a causar danos severos (MAZUR, 1980). Durante a descongelação, a sobrevivência dos espermatozoides esta relacionada à habilidade dos mesmos em passar novamente pela faixa critica de temperatura. A curva preferencial de aquecimento depende do método em que o semen foi congelado. Se a congelação for lenta, a descongelação deve também ser lenta, para permitir a descongelação dos cristais de gelo extracelulares, provocando a diluição do soluto e, lentamente, a reidratação das células. Se o sêmen for descongelado muito rapidamente, os cristais extracelulares descongelam-se na mesma velocidade e a água do meio invade muito bruscamente a célula, causando ingurgitamento e danos à membrana plasmática. Igualmente, se o sêmen foi congelado rapidamente os espermatozoides não sofrerão desidratação e, portanto, quando o gelo extracelular derreter não haverá influxo rápido de

23 8 água através da membrana celular. Este sêmen também deve ser descongelado rapidamente, de modo que o gelo intracelular que se formou durante a congelação não tenha tempo de recristalizar (AMMAN e PICKETT, 1987; BETTENCOURT, 2007). Deste modo, a criopreservação é estressante para os espermatozoides, afetando a integridade das membranas espermáticas, incluindo a plasmática, acrossomal e membrana mitocondrial (PARKS e GRAHAM, 1992; WATSON, 1995; JANUSKAUSKAS et al., 2003). Como consequência, devido a mudanças de temperatura durante o processo, ocorre queda de fertilidade, estresse osmótico e tóxico representado pela exposição aos crioprotetores e a formação e dissolução de cristais de gelo extracelulares (WATSON, 2000;) Relação entre a criopreservação, capacitação espermática e reação acrossomal Durante o trânsito epididimário, a membrana plasmática do espermatozoide passa por significativas mudanças bioquímicas (TULSIANI e YOSHIBA-KOMIYA, 1997). Após a ejaculação, os espermatozoides de mamíferos, passam por uma série de modificações bioquímicas e funcionais que ocorrem na sua passagem no sistema genital feminino, especialmente na tuba uterina, denominadas como capacitação espermática, tornando-os assim capazes de fecundar o oócito (FLESCH e GADELLA, 2000; HARRISON e GADELLA, 2005; RODRIGUEZ e MARTINEZ, 2005), sendo pré-requisito essencial para que ocorra a fertilização (HAFEZ e HAFEZ, 2004).

24 9 As modificações da capacitação envolvem a remoção ou a inativação de fatores da superfície do espermatozoide; mudanças na localização, estrutura molecular e na mobilidade de proteínas; adsorção espermática de proteínas (MEDEIROS et al., 2002), ocorrendo mediado por secreções do sistema genital feminino, desestabilizando a bicamada fosfolipídica (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Alterações na composição lipídica da membrana, com remoção e alteração de componentes derivados dos testículos, como as glicoproteínas (THERIEN et al., 1998) e em particular efluxo do colesterol (VISCONTI et al., 1999) permitindo aumento da fluidez da membrana, principalmente pelo aumento da concentração de fosfatidilcolina, desestabilizador de membrana, elevam a permeabilidade ao bicarbonato e Ca 2 + (WENNEMUTH et al., 2003; HAFEZ e HAFEZ, 2004; HARRISON e GADELLA, 2005;), sódio, ph intracelular; favorecendo a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), ativação de adenilato ciclase (AC), que forma adenosina monofosfato (AMPc) para ativação da proteína quinase (PKA) levando a fosforilação da proteína tirosina (ZENG e TULSIANI, 2003; BREITBART, RUBINSTEIN e ETKOVITZ, 2006; SALICIONI et al., 2007), e modificações de algumas atividades enzimáticas, principalmente a proteína quinase C (HAFEZ e HAFEZ, 2004), fatores necessários para o espermatozoide se ligar à zona pelúcida (GADELLA, 2008). Segundo Frits et al. (2000), espermatozoides de humanos e bovinos com alto conteúdo de colesterol requerem um maior período para se capacitarem (8 e 6 horas, respectivamente), enquanto que os espermatozoides suínos e ovinos com baixo conteúdo do colesterol, requerem 1 ou 2 horas para a capacitação.

25 10 O potencial de fertilidade está associado a algumas proteínas envolvidas na capacitação espermática, tais quais a isoforma de proteína de ligação espermática E12, subunidades alfa e fosfatidiletanolamina (ELSPBP1, PEBP1 e BSP1) (GIBBONS et al., 2005; GWATHMEY et al., 2006; NIXON et al., 2006; SAHIN et al., 2009; D AMOURS et al., 2010). Revelando a possibilidade em reprodutores, mesmo aprovados no exame andrológico, os espermatozoides não fertilizar o oócito, devido falha de indução na reação acrossomal, relacionado a maiores quantidades de BSP1, proteína associada com baixa fertilidade de touros (D AMOURS et al., 2010; LESSARD et al., 2011). A perda da integridade funcional da membrana plasmática predispõe à capacitação prematura, fazendo que o espermatozoide perca sua habilidade em ligar-se ao ovócito e penetre na zona pelúcida (THUNDATHIL et al., 2001). O processo de capacitação termina com o evento de exocitose chamado de reação acrossomal, que tem como objetivo, permitir que os espermatozoides possam penetrar na zona pelúcida do oócito (YANAGIMACHI, 1994). Vale ressaltar que ainda não está bem elucidada a base molecular deste processo (SALICIONI et al., 2007). Por outro lado, pesquisadores descrevem que a capacitação está associada às modificações na membrana plasmática e na concentração intracelular de íons que ativam segundos mensageiros (TULSIANI et al., 1998; HARRISON e GADELLA, 2005). A reação acrossomal está envolvida com a formação de múltiplas vesículas na membrana acrossomal, as quais se fundem na membrana plasmática, ocorrendo posteriormente sua dispersão, sendo o processo essencial para a penetração na zona pelúcida (GORDON, 2003), resultando na modificação de algumas proteínas da membrana plasmática do

26 11 segmento acrossomal equatorial e pós-equatorial num nível necessário para a fusão com a membrana do oócito (PATRAT et al., 2000). Deste modo, a reação do acrossomo é um processo do espermatozoide, absolutamente necessário para que ocorra a fecundação, para que estejam aptos a atravessar a zona pelúcida, ligar-se a membrana plasmática do oócito e se fundir com o gameta feminino, devido à liberação de enzimas, as quais são essenciais para a sua penetração na zona pelúcida do oócito (YANAGIMACHI, 1994). Algumas evidências indicam que a progesterona, secretada pelas células do cumulus e presente no líquido folicular, seja um importante cofator nesse processo (OSMAN et al., 1986), in vivo, a reação é induzida por glicoproteínas da zona pelúcida (ZP3), a qual pode atuar como ligante para um ou mais receptores da membrana plasmática do espermatozoide (WASSARMAN, 1999). Figura 2: Esquema representativo da capacitação espermática. Fonte: Esquema representativo da capacitação espermática.

27 12 Figura 3: Esquema representativo da reação acrossomal (a). Figura 4: Esquema representativo da reação acrossomal (b).

28 Considerações sobre a criopreservação de sêmen Pesquisas sobre tecnologias reprodutivas demonstram a crescente vantagem do uso da inseminação artificial (IA) para aumento na produção animal (THIBIER e GUÉRIN, 2000). Dentre as técnicas associadas a IA, destaca-se a criopreservação de sêmen, constituindo um grande potencial de aproveitamento genético de reprodutores nacionais e internacionais (ANDRIOLI et al., 2003). A criopreservação do sêmen, com o objetivo de conservar a capacidade fecundante do espermatozoide, o leva a um estado de quiescência, reduzindo seu metabolismo, contribuindo assim para a preservação celular, além de aumentar o número de fêmeas fertilizadas com um único ejaculado (WATSON, 2000). O processo de criopreservação das células espermáticas resulta em diminuição da fertilidade quando comparada com sêmen recém-colhido (WATSON, 2000), já que, quando submetidos a baixas temperaturas sofrem modificações na estrutura lipídica e permeabilidade da membrana, o que parece reduzir a viabilidade e funções fisiológicas espermáticas (HOLT, 2000). Esta ocorrência de danos ultraestruturais, bioquímicos e funcionais, reduz a motilidade e a viabilidade, impedindo o trânsito espermático no sistema reprodutivo feminino e, consequentemente, prejudicando a fertilidade (LEBOEUF et al., 2000). Há muito tempo é conhecida à importância da motilidade dos espermatozoides de mamíferos durante o armazenamento, principalmente quando utilizada a criopreservação. Em geral, os espermatozoide que sobreviveu à refrigeração, particularmente no intervalo

29 14 em que ocorre a formação dos cristais de gelo e, consequentemente, a desidratação celular (KUMAR et al., 2003), e se manteve potencialmente viável à temperatura de -196 C ainda deve ser capaz de superar o estresse da descongelação, transpassando pela segunda vez a zona crítica de temperatura, entre -15 e -60 C (SÖDERQUIST et al., 1997). Danos na membrana, segundo Mazur (1984), são atribuídos à ruptura da membrana espermática, causada pela formação de cristais de gelo intracelular, que ocorre durante o processo de congelação e descongelação. Entretanto, a diluição em meios para proteção, aparentemente garante resistência ao choque-frio para os espermatozoides (HOLT, 2000). Além disso, a qualidade do sêmen armazenado é influenciada pelos procedimentos associados à manipulação, como diluente, diluição e centrifugação (KANKOFER et al., 2005). Mais especificamente em ovinos, outros fatores também influenciam a sobrevivência das células espermáticas pós-descongelação, como os tipos e a concentração dos ingredientes utilizados nos diluentes de sêmen, a concentração de glicerol, além da qualidade do sêmen (EL-ALAMY e FOOTE, 2001). Segundo Salmon e Maxwell (1995), apesar de 40 a 60% dos espermatozoides de carneiros preservarem a motilidade pós-descongelação, cerca de 20 a 30% deles permanecem inalterados biologicamente, podendo apresentar danos ultraestruturais, físicos, bioquímicos ou funcionais. Dentro deste contexto, o interesse comercial pelo uso da IA com sêmen criopreservado, vem aumentando as pesquisas na área da criopreservação, buscando padronizar a técnica para proporcionar resultados satisfatórios (WATSON, 2000).

30 Etapa de resfriamento O resfriamento do sêmen, como etapa anterior à criopreservação, implica na exposição dos espermatozoides a uma redução gradual de temperatura (5 ou 15ºC) o suficiente para diminuir o metabolismo espermático (WATSON 2000; HOLT, 2000; ANEL et al., 2006). Esta fase de transição se dá por uma reorganização das cadeias hidrocarbonadas da membrana espermática, que de estado fluido e desordenado passam para o estado de gel, com uma organização mais acentuada, tendo início uma agregação lipídica, tornando as membranas susceptíveis a rupturas (STRYPER 1992), com redução da fluidez da membrana (HOLT, 2000). Anel et al. (2003) compararam três métodos de resfriamento para sêmen ovino à 5 C, utilizando-se uma taxa de refrigeração com queda de temperatura de 0,3ºC/min; 0,2ºC/min e 0,25ºC/min e observaram que após o período de equilíbrio, uma curva de refrigeração de 0,25ºC/min proporcionou uma melhor motilidade espermática (89,1 ± 8,0; P<0,05) em relação aos outros métodos (um 84,3 ± 8,2 e dois 87,6 ± 7,6), com alta capacidade de manutenção das células espermáticas ovinas por períodos de refrigeração de 24 e 48 horas (SOUSA e BICUDO, 2002). O processo de resfriamento pode causar danos irreversíveis ao espermatozoide, em virtude do choque-frio (PICKETT e AMANN, 1993). As mudanças irreversíveis a membrana plasmática dos espermatozoides ocorrem de maneira geral entre 15 a 5 C (QUINN et al., 1980; WATSON, 1995), intervalo onde são produzidas as injurias (WATSON, 2000; AGCA 2002; CRITSER, 2002). Com isso é necessário o uso de substâncias ricas em lipoproteínas, como o leite e a gema de ovo, açúcares como frutose, glicose, lactose,

31 16 manose, rafinose e trealose com função crioprotetora, durante o processo de resfriamento do sêmen (MILCZEWSKI et al., 2000; MOUSSA et al., 2002; CARVALHO et al., 2008). Mesmo no resfriamento lento a mudança de temperatura determina estresse sobre as membranas, sendo possível que este processo seja devido às mudanças de fase dos lipídios da bicamada e alteração do estado funcional (De LEEW et al., 1990). Outro efeito importante durante o resfriamento é produzido quando elementos da membrana, como proteínas integrais, são agrupados pela separação da fase lipídica, processo pelo qual as funções dessas proteínas terminam sendo afetadas, a exemplo dos canais iônicos de cálcio. Deve-se a isto o fato que a permeabilidade da membrana aumenta após o resfriamento (ROBERTSON 1986; WATSON, 1986). A regulação do cálcio é claramente afetada, tendo efeitos sobre a função celular. A saída de cálcio tem implicações na capacitação e fusão entre a membrana plasmática e a porção externa da membrana acrossomal. Esta saída de cálcio durante o resfriamento contribui para mudanças relacionadas à capacitação e ração acrossomal prematuras (WATSON, 2000) Etapa de congelação Quando as células são congeladas, elas ficam sujeitas ao estresse submetido pela interação água-soluto (ABOAGLA e TERADA, 2004) acompanhada das mudanças de pressão osmótica, resultantes da formação de cristais de gelo (WATSON, 2000). A etapa de congelação do sêmen determina marcadas alterações na estrutura da membrana promovendo redução do transporte espermático e diminui sua viabilidade no sistema genital das ovelhas (BAG et al., 2002).

32 17 A curva de congelação é extremamente importante na manutenção da integridade celular, pois se a mesma é rápida, não há tempo para que ocorra a desidratação dos espermatozoides, o que possibilita a formação de gelo intracelular, que é prejudicial à célula. Em casos de curva de congelação lenta, haverá a desidratação dos espermatozoides impedindo a formação de gelo intracelular, porém a alta concentração de solutos também pode causar danos à célula (WATSON, 1995). Durante esta etapa, existem três patamares de temperaturas (arrefecimento, congelação e criogênica). A temperatura de arrefecimento situa-se perto dos 0ºC. A exposição contínua a estas temperaturas causa danos nas células da grande parte dos animais, sendo os principais os danos devido à formação de cristais de gelo intracelulares e o consequente efeito de solução causado pelo aumento da concentração dos solutos à medida que os cristais de gelo se vão formando (PESCH e BERGMANN, 2006). A este período está também associado à fase de transição de membrana (lipídios) e a perda de permeabilidade seletiva (WATSON, 1995). As temperaturas situadas entre 0 à -40ºC encontra-se a temperatura de congelação (PESCH e BERGMANN, 2006), e neste intervalo, ocorrem a maioria dos danos celulares (BYRNE et al., 2000). A temperatura criogênica (-196ºC) à qual os efeitos bioquímicos e fisiológicos são praticamente nulos (WOLFE e BRYANT, 2001; PESCH e BERGMANN, 2006) Descongelação Tanto a congelação como a descongelação induzem graves alterações no volume de água na célula, devido à temperatura e aos efeitos osmóticos, o que confere stress mecânico nas

33 18 membranas celulares (BAILEY et al., 2000), mostrando a sua importância para a sobrevivência espermática, já que o espermatozoide que sobreviveu ao resfriamento a - 196ºC, ainda será desafiado ao aquecimento na descongelação, atravessando novamente a zona crítica de temperatura (SALAMON e MAXWELL, 1995; SALAMON e MAXWELL, 2000 ). A taxa de descongelação é dependente da taxa de congelação, onde é necessário atentar se a congelação foi suficientemente rápida para produzir a congelação intracelular ou lenta o bastante caminhando para a desidratação espermática. (PARKS e GRAHAM, 1992). Nesta etapa, a célula sofre o processo inverso ao da congelação (WATSON, 1995), onde a entrada de água durante o aquecimento é extremamente perigosa, mais do que a saída durante a congelação (HOLT e NORTH, 1994). Este fenômeno requer a acomodação a um novo volume pelo deslocamento da membrana, o que pode levar à sua danificação por destruição do citoesqueleto ou pela entrada do grande volume de água através da bicamada (HOLT, 2000a,b). Deste modo, é necessário fazer a descongelação com elevadas taxas de aquecimento para limitar o tempo de recristalização dos cristais de gelo intracelulares (HOLT e NORTH, 1994; HOLT, 2000b), além de expor os espermatozoides por um tempo mais curto ao soluto concentrado e ao crioprotetor que na descongelação lenta (SALAMON e MAXWELL, 1995a). Para o sêmen ovino congelado, a maior parte dos pesquisadores defendem temperaturas em torno de 35 a 42 C para a descongelação (EVANS e MAXWELL, 1990b; SALAMON e MAXWELL, 1995a; UPRETI et al., 1996; OLLERO et al., PAYNE, OLIVER e UPRETI, 1999; SALAMON e MAXWELL, 2000; AISEN, MEDINA e VENTURINO, 2002;

34 19 KUMAR, MILLAR e WATSON, 2003; SÖNMEZ e DEMIRCI, 2004; AISEN et al., 2005). Segundo Mejorada et al., 1999, quanto mais se elevar a temperatura de descongelação, aumenta-se a porcentagem de motilidade espermática e se diminui os danos acrossômicos. Contudo, recomenda-se temperaturas mais próximas à corporal, tanto pela facilidade de alcançá-las quanto de mantê-las, sobretudo a nível de campo (EVANS e MAXWELL, 1990b; MEJORADA et al., SÖDERQUIST, LUNDEHEIM e NILSSON, 1999) Diluidores do sêmen Sabe-se que a baixa fertilidade do sêmen refrigerado e congelado são atribuídas a danos irreversíveis causados às células durante o processo de resfriamento, congelação e descongelação (BYRNE et al., 2000; SALAMON e MAXWEL, 1995.b; MAXWELL e WATSON, 1996). O plasma seminal oferece uma proteção limitada para os espermatozoides contra mudanças de temperatura, sendo necessário expandir o sêmen em diluentes especiais para reduzir tais prejuízos, um bom diluidor, segundo Mies Filho (1987), deve apresentar as seguintes características: ausência de toxicidade celular, osmolaridade igual ou próxima a do sêmen, ph favorável segundo a espécie, preparação simples e baixo custo. O uso de meios diluentes durante o processamento do sêmen tem como finalidade principal aumentar o volume e favorecer a proteção aos espermatozoides (SOUSA et al., 2010).

35 20 Os diluidores utilizados para criopreservar o sêmen de ovinos e caprinos devem ter propriedades semelhantes às dos diluidores utilizados para sêmen fresco, porém devem estar tamponados, contra as mudanças de ph e tonicidade espermática, conter uma fonte de energia e diminuir o crescimento bacteriano, pela adição de antibióticos. Além disso, devem conter uma substância para proteger a membrana celular, durante o resfriamento a 5ºC e um agente crioprotetor para evitar lesões da membrana durante a criopreservação (EVANS e MAXWELL, 1990). Os crioprotetores são adicionados ao meio diluidor para reduzir o ponto de congelação e proteger as estruturas espermáticas durante a congelação e descongelação. As soluções crioprotetoras normalmente têm caráter de hiper-osmolaridade, reduzindo o ponto de congelação para 5 a 7 ºC, estabilizando as membranas celulares (SILVA e GADELA, 2006). O glicerol, principal crioprotetor penetrante, atua aumentando o volume de solvente não congelado e diluindo a concentração de soluto. Uma alta concentração pode ser prejudicial se permitir uma desidratação que leve à deformação estrutural da membrana, alteração ou desnaturação das proteínas e separação das estruturas do citoesqueleto. Desta forma, uma concentração alta de crioprotetor é tóxica para os espermatozoides e pode resultar em taxa de fertilidade menor (GRAHAM, 1996). Os componentes encontrados na gema de ovo, segundo Salamon e Maxwell (1995) são bastante utilizados como crioprotetor externo em protocolos de criopreservação para sêmen ovino. Os crioprotetores, então, são substâncias capazes de promover a sobrevivência celular durante o processo de resfriamento, congelação e descongelação, apesar de seu mecanismo de ação na criopreservação ainda não ser completamente elucidado (FÜRST, 2003).

36 21 Também são adicionados antibióticos ao diluente, os quais previnem as amostras de sêmen contra contaminações principalmente durante o processo de manipulação do mesmo. Antimicrobianos como a estreptomicina e a penicilina, sendo eficazes em reduzir a carga bacteriana do sêmen produzida durante seu processamento (SOUZA et al., 2006; MOUSTACAS et al., 2010). Diversos estudos revelam que a gentamicina como o antibiótico que apresenta melhor efetividade, na redução da carga bacteriana durante o processamento (BOUSSEAU et al., 1998; AURICH e SPERGSER, 2007; PRICE et al., 2008; MOUSTACAS et al., 2010) Crioprotetores São substâncias capazes de promover a sobrevivência celular durante as etapas de resfriamento, congelação e descongelação, apesar de seus mecanismos de ação ainda não estarem completamente elucidados (WATSON, 2000). Os crioprotetores podem ser classificados de acordo com a permeabilidade da membrana à sua penetração em não penetrantes (macromoléculas impermeáveis à membrana plasmática) e penetrantes ou intracelulares (atravessam a membrana), atuando no meio intra e/ou extracelular (HOLT, 2000; BORGES, 2003) Crioprotetores não penetrantes Açúcares, proteínas e polímeros sintéticos são crioprotetores extracelulares, ou seja, não conseguem penetrar na célula espermática. Ao agir no meio extracelular, aumentando a

37 22 pressão osmótica, induzem a desidratação da célula, diminuindo a formação de cristais de gelo intracelular (CELEGHINI et al., 2008). Os mais comuns são os açúcares, o leite e a gema de ovo (THUN, HURTADO, JANETT, 2002). Os componentes hidroxila das moléculas de açúcares têm a capacidade de proteger as células das injúrias causada pela congelação eutética do meio biológico, pela sua habilidade em capturar sais como o NaCl em um meio viscoso ou mesmo em uma fase cristalizada (NICOLASJSEN e HVIDT, 1994). Trabalhos mais recentes mostraram que meios diluidores com trealose e sacarose contribuem para a proteção do espermatozoide contra as taxas de congelação acima da ideal (WOELDERS et al., 1997). A gema de ovo tem sido largamente utilizada para espermatozoides de mamíferos, devido ao seu efeito protetor para os efeitos do rápido resfriamento e choque frio. A aceitação na utilização da gema de ovo, rica em fosfolipídios, é devida principalmente pelo conhecimento da perda de fosfolipídios pela membrana espermática no resfriamento e congelação, caracterizando-se como principal causa da diminuição de viabilidade (PARKS; GRAHAM, 1992) Crioprotetores penetrantes Crioprotetores penetrantes atravessam rapidamente a membrana plasmática por ser tanto solúveis na membrana plasmática das células espermáticas quanto no água (WOLFE e BRYANT, 2001), tendo como efeito intracelular, a capacidade de redução do efeito de estresse osmótico intracelular causado pela desidratação. Para tanto, atuam recolocando a

38 23 água intracelular necessária para a manutenção do volume celular, interação com íons e macromoléculas, deprimindo o ponto de congelabilidade da água (HAMMERSTEDT e GRAHAM, 1992) Glicerol Estruturalmente, o glicerol possui três grupamentos hidroxila, sendo classificado como um álcool podendo aceitar íons hidrogênio da água em seis sítios diferentes (POLGE et al., 1949). O glicerol foi o primeiro crioprotetor a ser utilizados na criopreservação espermática, sendo o mais utilizado. Segundo Kundu et al., (2000) seu mecanismo de proteção é devido a capacidade de ligação dos íons hidrogênio pelos átomos de oxigênio dos grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana espermática, promovendo a estabilização da membrana durante a queda da temperatura. Segundo Parks e Graham, 1992, o glicerol apresenta alguns efeitos para com a membrana, tais quais ligação com fosfolipídios reduzindo a fluidez da membrana através da interação com proteínas e glicoproteínas; redução da capacidade elétrica devida a reorganização, em grande escala, da membrana incluindo a formação de junções semelhantes às junções GAP; formação de interdigitações da bicamada lipídica alterando a fluidez pela reorganização das cadeias de ácidos e diminuição em tamanho e em número dos cristais de gelo (PESCH e BERGMANN, 2006), entretanto, é clara sua ação na membrana e

39 24 citoplasma, exercendo efeito osmótico sobra a membrana plasmática (MCKINNON, 1996; LEIBO e BRADLEY, 1999). O glicerol apresenta toxicidade para as células espermáticas dependendo da concentração utilizada (FAHY, 1996; WOELDERS, 1997). Além disto, está relacionado com alterações nos microtúbulos podendo afetar as transduções de sinal (PARKS e GRAHAM, 1992), indução ou aceleração da reação acrossomal em espermatozoides de carneiros, reduzindo as taxas de prenhez (SLAVIK, 1987; SALAMON e MAXWELL, 2000). A toxicidade encontra-se também relacionada com o tempo de exposição à temperatura a que este é adicionado (HOLT, 2000) e com a taxa de arrefecimento (quanto mais elevada maior a concentração de glicerol) (WATSON, 1995). É descrito como sendo mais prejudicial a sua adição aos 30ºC do que aos 5ºC (HOLT, 2000; SALAMON e MAXWELL, 2000), no entanto, Evans e Maxwell (1990) obtiveram resultados igualmente satisfatórios quando da adição aos 30ºC. A sensibilidade ao glicerol é específica da espécie (HOLT, 2000): o espermatozoide de carneiro e de cão são mais sensíveis ao glicerol do que os de touro ou de garanhão (PESCH e BERGMANN, 2006). O glicerol penetra mais facilmente os espermatozoides de carneiro comparativamente aos de touro (SALAMON e MAXWELL, 2000). Segundo Mazur (1985), seu efeito prejudicial é menor quando sua adição é feita a temperaturas próximas a 0ºC, tendo como explicação possível desta toxicidade o efeito osmótico imediato causado pela adição abrupta ao sêmen. Outros crioprotetores intracelulares utilizados em menor escala são o dimetilsulfóxido, 1,2- propanodiol e o etilenoglicol (LEITE et al., 2011).

40 Iodixanol O OpitPrepTM (solução estéril e não tóxica composta de Iodixanol a 60% peso/volume - diluído em água) é um componente iodinatado não iônico desenvolvido para estudos envolvendo raios X (FORD et al., 1994) e sua fórmula química é 5,5 -[(2- hydroxy-1,3- propanediyl)-bis(acetylimino)] bis- [N,N bis(2,3dihydroxypropyl)-2,4,6- triiodobenzenedicarboxamide], com peso molecular de 1550,20 e 49,1 % de iodo. O Iodixanol é um ótimo contraste radiográfico tendo utilizações diversas. O iodixanol vem sendo utilizado como contraste radiográfico, apresentando osmolaridade de 290 mosm/kg H 2 O sob temperatura de 37 C, aproximando-se muito do glicerol, e um potencial menos tóxico às células (FORD et al., 1994; GRAHAM et al., 1994). Por ou lado o iodixanol tem sido utilizado na formação de Gradiente de densidade em estudos de desvio da proporção de sexo e integridade do DNA dos espermatozoides bovinos, nos quais após a descongelação não foi observados danos no DNA de espermatozoides bovinos (RESENDE et al., 2010). Dentre outras formas de utilização do iodixanol,encontra-se a centrifugação de semen para a separação espermática, tem sido usado em diferentes espécies: humanos (HARRISON, 1997); touros (SMITH et al, 1997); garanhões (ECOT et al, 2005; SIEME et al, 2006). Além disso, devido as suas propriedades físico-químicas, foi adotado como Gradiente de densidade durante a centrifugação para seleção de células viáveis e, em trabalho recente, esta substância (OptiPrep ) também foi testada como opção de crioprotetor (SARAGUSTY et al., 2009). No estudo foi utilizado o diluente Andromed, acrescido de 0% (controle); 1,25%; 2,5% e 5% de OptiPrep. Os resultados mostraram que o iodixanol

41 26 a 2,5% preservou a integridade e funcionalidade da membrana plasmática durante o processo de criopreservação, além de manter a motilidade espermática, enquanto a concentração de 5% foi prejudicial às células, mesmo a fresco. Figura 5: Representação da estrutura química da molécula do Iodixanol AVALIAÇÃO DO SÊMEN PRÉ-CONGELAÇÃO A avaliação laboratorial do sêmen é de suma importância para a inseminação artificial, por permitir o fornecimento de produtos de qualidade (MOCÉ e GRAHAM, 2008). Esta avaliação objetiva de estimar a capacidade e o potencial fecundante espermático para que o espermatozoide seja considerado qualitativamente viável e potencialmente fértil, sendo complementar ao exame andrológico (RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2006). Para tanto, diferentes parâmetros de avaliação do sêmen, in vitro, têm sido desenvolvidos e utilizados ao longo dos anos para determinar a viabilidade espermática em várias espécies, relacionando-os com a fertilidade (PAPADOPOULOS et al.). Deste modo, é possível estimar a capacidade fertilizante dos espermatozoides através de teste laboratoriais, identificando e classificando as amostras quanto à qualidade (MOCÉ e

42 27 GRAHAM, 2008). Dentre as avaliações podem ser citadas a motilidade, o vigor, a morfologia espermática, a integridade das membranas, a concentração dentre outros testes complementares como as colorações, teste de termo resistência e hiposmótico Vigor e motilidade espermática A motilidade e o vigor espermático, rotineiramente, são parâmetros subjetivos usados na avaliação de campo do semen (WOELDERS, 1991; FOOTE, 2003), onde o vigor espermático representa a força do movimento da cauda, o qual determina a velocidade com que os espermatozoides se movimentam, sendo o mesmo classificado de zero a cinco. A motilidade expressa à percentagem total de espermatozoides móveis e suas subdivisões: Células que deslocam para frente (movimento progressivo), movimento em circunferência (movimento circular) ou, ainda, podem apenas se limitar a oscilar no campo microscópico (movimento oscilatório ou local) (SALVIANO e SOUZA, 2008). Estes parâmetros são essenciais para a fertilidade, pois facilitam a passagem pelo sistema genital feminino e torna possível a penetração na zona pelúcida do ovócito (KUMAR, 2000; QUINTERO-MORENO et al., 2004), já que os espermatozoides imóveis de mamíferos são incapazes de superar as barreiras do sistema genital feminino, ou penetrar o cumulus (GLOVER e BARRATT, 2004).