1. INTRODUÇÃO. G.D. Funck 1, J.L. Marques 2, W.P. Silva 1,2, A. Fiorentini 1

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1 MODELAGEM DA PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS DE ORIGEM PROTEICA (BACTERIOCIN-LIKE) POR Lactobacillus curvatus P99 EM RESPOSTA A CONDIÇÕES DE ph, TEMPERATURA E TEMPO DE INCUBAÇÃO G.D. Funck 1, J.L. Marques 2, W.P. Silva 1,2, A. Fiorentini 1 1-Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós- Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) gracifunck@yahoo.com.br wladimir.padilha211@gmail.com angefiore@gmail.com 2-Centro de Desenvolvimento Tecnológico Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) ju_marques@hotmail.com RESUMO Objetivou-se modelar a produção de substâncias antimicrobianas de origem proteica (bacteriocin-like) por Lactobacillus curvatus P99 em resposta a condições de ph, temperatura e tempo de incubação. A metodologia de superfície de resposta (MSR) foi utilizada para a análise do efeito da combinação do ph (4, 6,5 e 9), temperatura (25 C, 3 C e 35 ºC) e tempo de incubação (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 21, 22, 23 e 24 h) na produção das substâncias antimicrobianas. De acordo com a otimização matemática, as melhores condições foram: ph 6,22, temperatura de 3,6 C e tempo de incubação de 17,9 h. Nestas condições, a atividade antimicrobiana foi de UA.mL -1. Os dados de otimização forneceram informações básicas que possibilitam a produção de substâncias antimicrobianas em escala industrial. ABSTRACT The aim of this study was verify the optimal conditions for antimicrobial substances production (bacteriocin-like) by Lactobacillus curvatus P99 in the response of ph, temperature and incubation time conditions. Response surface methodology (RSM) was used to analyse the effect of combination ph (4, 6.5 and 9), temperature (25 C, 3 c and 35 ºC) and incubation time (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 21, 22, 23 and 24 h) on antimicrobial substances production. By mathematical optimization, the best conditions were ph of 6.22, a temperature of 3.6 C and incubation time of 17.9 h. Under these conditions, the antimicrobial activity was of AU.mL -1. The optimization data provided basic information for the production of antimicrobial substances on industrial scale. PALAVRAS-CHAVE: bactérias ácido-láticas; bacteriocina; superfície de resposta. KEYWORDS: lactic acid bacteria: bacteriocin; response surface. 1. INTRODUÇÃO Bactérias ácido-láticas (BAL) têm um longo histórico de uso e até hoje apresentam papel essencial nos processos de fermentação de alimentos. A contribuição mais importante destes micro-

2 organismos é estender a vida útil dos alimentos, por apresentarem atividade antagonista contra microorganismos deteriorantes e também contra patógenos importantes em alimentos (Baka et al., 211; Barbosa et al., 215). Esta atividade antagonista ocorre por diversos mecanismos, principalmente pela produção de substâncias inibitórias potencialmente letais aos micro-organismos alvos. As principais substâncias com potencial antimicrobiano são ácidos orgânicos, dióxido de carbono, álcoois, aldeídos, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas (Hugas, 1998; Oliveira et al., 28). Diversas pesquisas vêm sendo realizadas sobre o potencial antimicrobiano de metabólitos produzidos por BAL, em especial, as bacteriocinas, visando a substituição dos conservadores sintéticos, pois alguns estudos têm demonstrado riscos toxicológicos e carcinogênicos relacionados a ingestão frequente e/ou de altas concentrações destes aditivos (Guillard et al., 29; Mpountoukas et al., 28). Bacteriocinas são peptídeos ou proteínas antimicrobianas sintetizadas nos ribossomos das células bacterianas e liberadas no meio extracelular, que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre diversos micro-organismos (Jack et al., 1995). Além disso, são efetivas em baixas concentrações e não promovem alteração nas propriedades sensoriais do produto (Rodgers, 22). Lactobacillus curvatus é uma espécie de BAL comumente associada aos produtos cárneos fermentados e carnes refrigeradas embaladas a vácuo (Hebert et al., 212). Algumas linhagens de L. curvatus são comercializadas como culturas iniciadoras e biopreservantes para embutidos cárneos fermentados (Meat and Sausages, 215). Alguns estudos relatam o isolamento L. curvatus e avaliação de seu potencial bacteriocinogênico (Ahmadova et al., 213; Barbosa et al., 215), atribuído a diferentes bacteriocinas como as curvacinas e as sakacinas, com importante ação antimicrobiana (Macwana e Muriana, 212; Rivas et al., 214). Sabe-se que as condições de incubação como ph, temperatura e tempo podem influenciar a produção de bacteriocinas a qual é induzida por um mecanismo de quorum sensing, ou seja, a quantidade de bacteriocina formada esta correlacionada com a biomassa produzida (Leroy e De Vuyst, 22). Desta forma, no presente trabalho, objetivou-se modelar a produção de substâncias antimicrobianas de origem proteica (bacteriocin-like) por L. curvatus P99 em resposta a condições de ph, temperatura e tempo de incubação. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Micro-organismo Foi objeto deste estudo um isolado de BAL bacteriocinogênico, denominado L. curvatus P99 proveniente de presunto cozido fatiado. A confirmação do potencial bacteriocinogênico se deu através da sensibilidade da substância produzida frente a tripsina e a presença e expressão de dois genes que codificam para a produção de, sakacina X, T- e T-β. O isolado P99 pertence a coleção de culturas bacterianas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos - Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) e encontrava-se armazenado a 8 C em caldo De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) adicionado de 2 % de glicerol.

3 2.2 Modelagem da produção de substâncias antimicrobianas de origem proteica (bacteriocin-like) por L. curvatus P99 em resposta a condições de ph, temperatura e tempo de incubação Inóculo e condições de produção de substâncias antimicrobianas de origem proteica (bacteriocin-like): O inóculo foi obtido a partir da semeadura do isolado de L. curvatus P99 em 1 ml de caldo MRS e incubação a 37 C por 18 h sob agitação constante a 1 oscilações/minuto. Para realização do experimento, foi adicionado 1 ml (1 %) do inóculo em 1 ml de caldo MRS com diferentes ph (4, 6,5 e 9) e a incubação procedeu-se em diferentes temperaturas (25 C, 3 C e 35 ºC) durante um período de 24 h. Alíquotas de 2 ml foram retiradas, de hora em hora, para quantificação da atividade antimicrobiana após centrifugação, coleta do sobrenadante, neutralização do ph, tratamento térmico a 8 C por 1 minutos e filtração por membrana. Quantificação da atividade antimicrobiana: A determinação da atividade antimicrobiana do sobrenadante livre de células contendo substâncias antimicrobianas de origem proteica (bacteriocinlike) SLC, foi realizada através da técnica de difusão em ágar conforme descrito por Lewus e Montville (1991), com as modificações descritas a seguir. Para isto, 1 µl do sobrenadante bruto e diluído foram adicionados sobre ágar Brain Heart Infusion (BHI), previamente inoculado com a bactéria indicadora Listeria monocytogenes Scott A na concentração de 1 5 UFC.mL -1 determinada através da escala McFarland (,5) e diluições sucessivas até a concentração desejada. A seguir, as placas foram incubadas a 35 C por 18 h e os halos de inibição foram medidos (Biscola et al., 213). O SLC produzido por Lactococcus lactis subsp. lactis Dy13, contendo antimicrobiano (nisina), foi utilizado como controle positivo e como controle negativo, o tampão PBS. O experimento foi realizado em duplicata com três repetições. A atividade antimicrobiana foi expressa em unidade arbitrária por mililitro (UA.mL -1 ). 2.3 Análise estatística A metodologia de superfície de resposta (MSR) com desenho Box Behnken - BB (Box e Behnken, 196) foi utilizada para a análise do efeito da combinação do ph (4, 6,5 e 9), temperatura (25, 3 e 35ºC) e tempo de incubação (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 21, 22, 23 e 24h) na produção da substância antimicrobiana de origem proteica (bacteriocin-like), totalizando 12 unidades experimentais. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os efeitos das variáveis independentes na atividade antimicrobiana estão apresentados na Figura 1 (A, B e C). A atividade antimicrobiana foi significativamente afetada pelo ph, temperatura e tempo de incubação. A análise rotacional canônica indicou que o ponto estacionário foi um ponto de sela. De acordo com a otimização matemática, as melhores condições foram: ph 6,22, temperatura de

4 3,6 C e tempo de incubação de 17,9 h. Nestas condições, a atividade antimicrobiana foi de UA.mL -1. Figura 1 - Superfície de resposta e gráficos de contorno para atividade antimicrobiana (UA.mL -1 ) de Lactobacillus curvatus P99. A Atividade antimicrobiana (UA ml -1 ) , 6,5 ph 4, Temperatura (ºC) B Atividade antimicrobiana (UA ml -1 ) , 6,5 ph 4, Tempo de incubação (horas) C Atividade antimicrobiana (UA ml -1 ) Temperatura (ºC) Tempo de incubação (horas) A: efeito do ph e temperatura para uma incubação de 12 h; B: efeito do ph e tempo de incubação a uma temperatura de 3 C; C: efeito da temperatura e tempo de incubação para o ph 6,5. Em estudo realizado por Mataragas et al. (23), foi observado que a linhagem de L. curvatus L442 sofreu influência do ph e temperatura na produção de bacteriocinas. Os autores observaram ainda que, a máxima produção de bacteriocina (1.28 UA.mL -1 ), foi em ph 5,5, a temperatura de 25 C em 16 h. Messens et al. (23) também observaram influência das diferentes condições de ph e temperatura na e atividade antimicrobiana de L. curvatus LTH O valor ótimo de temperatura para produção de curvacina A foi a 25 C (3.1 UA.mL -1 ). Os autores observaram

5 ainda que a produção de bacteriocina ocorreu em uma ampla faixa de ph. Portanto, estes parâmetros devem ser avaliados para cada isolado, uma vez que, as condições ótimas de multiplicação celular e produção de metabólitos são cepa dependentes (Malheiros et al., 215). 4. CONCLUSÃO A partir da otimização das condições de produção de substâncias antimicrobianas (bacteriocin-like), obteve-se como condição ótima ph 6,22, temperatura de 3,6 C no tempo de 17,9 h. Os dados de otimização da produção de substâncias antimicrobianas forneceram informações básicas que possibilitam a produção de seus metabólitos em escala industrial. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ahmadova, A., Todorov, S. D., Hadji-Sfaxi, I., Choiset, Y., Rabesona, H., Messaoudi, S., Kuliyev, A., Franco, B. D. G. M., Chobert, J., & Haertlé, T. (213). Antimicrobial and antifungal activities of Lactobacillus curvatus strain isolated from homemade Azerbaijani cheese. Anaerobe, 2, Baka, A. M., Papavergou, E. J., Pragalaki, T., Bloukas, J. G., Kotzekidou, P. (211). Effect of selected autochthonous starter cultures on processing and quality characteristics of Greek fermented sausages. LWT - Food Science and Technology, 44(1), Barbosa, M. S., Todorov, S. D., Ivanova, I., Chobert, J., & Haertlé, T., & Franco, B. D. G. M. (215). Improving safety of salami by application of bacteriocins produced by an autochthonous Lactobacillus curvatus isolate. Food Microbiology, 46, Biscola, V., Todorov, S. D., Capuano, V. S. C., Abriouel, H., Gálvez, A., & Franco, B. D. G. M. (213). Isolation and characterization of a nisin-like bacteriocin produced by a Lactococcus lactis strain isolated from charqui, a Brazilian fermented, salted and dried meat product. Meat Science, 93(3), Box, G. E. P., Behnken, D. W. (196). Some New Three Level Designs for the Study of Quantitative Variables. Technometrics, 2, Guillard, V., Issoupov, V., Redl, A., & Gontard, N. (29). Food preservative content reduction by controlling sorbic acid release from a superficial coating. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 1(1), Hebert, E. M., Saavedra, L., Taranto, M. P., Mozzi, F., Magni, C., Nader, M. E., Valdez, G. F., Sesma, F., Vignolo, G., & Raya, R. R. (212). Genome Sequence of the bacteriocin-producing Lactobacillus curvatus strain CRL75. Journal of Bacteriology, 194(2), Hugas, M. Bacteriocinogenic lactic acid bacteria for the biopreservation of meat and meat products. Meat Science, 49(98), S139 S15. Jack, R. W., Tagg, J. R., & Ray, B. (1995). Bacteriocins of gram-positive bacteria. Microbiological Reviews, 59(2), Leroy, F., & De Vuyst, L. (22). Bacteriocin production by Enterococcus faecium RZS C5 is cell density limited and occurs in the very early growth phase. International Journal of Food Microbiology, 72, Lewus, C. B., & Montville, T. J. (1991). Detection of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Journal of Microbiological Methods, 13,

6 Macwana, S. J., & Muriana, P. M. (212). A bacteriocin PCR array for identification of bacteriocinrelated structural genes in lactic acid bacteria. Journal of Microbiological Methods, 88(2), Malheiros, P. S., Sant Anna, V., Todorov, S. D., & Franco, B. D. G. M. (215). Optimization of growth and bacteriocin production by Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a. Brazilian Journal of Microbiology, 46(3), Mataragas, M., Metaxopoulos, J., Gaiotou, M., & Drosinos, E. H. (23). Influence of ph and temperature on growth and bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides L124 and Lactobacillus curvatus L442. Meat Science, 64, Meat and Sausages (215). Starter cultures for making fermented sausages. Disponível em: < Messens, W., Verluyten, J., Leroy, F., & De Vuyst, L. (23). Modelling growth and bacteriocin production by Lactobacillus curvatus LTH 1174 in response to temperature and ph values used for European sausage fermentation processes. International Journal of Food Microbiology, 81, Mpountoukas, P., Vantarakis, A., Sivridis, E., & Lialiaris, T. (28). Cytogenetic study in cultured human lymphocytes treated with three commonly used preservatives. Food and Chemical Toxicology, 46(7), Oliveira, R. B. P., Oliveira, A. D. L., & Glória, M. B. A. (28). Screening of lactic acid bacteria from vacuum packaged beef for antimicrobial activity. Brazilian Journal of Microbiology, 39, Rivas, F. P., Castro, M. P., Vallejo, M., Marguet, E., & Campos, C. A. (214). Sakacin Q produced by Lactobacillus curvatus ACU-1: Functionality characterization and antilisterial activity on cooked meat surface. Meat Science, 97(4), Rodgers, S. Preserving non-fermented refrigerated foods with microbial cultures a review. Trends in Food Science & Technology, 12(21),