MODELAGEM DO CRESCIMENTO DE FLORA NATURAL DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS EM PRESUNTO FATIADO E EMBALADO A VÁCUO.

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1 MODELAGEM DO CRESCIMENTO DE FLORA NATURAL DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS EM PRESUNTO FATIADO E EMBALADO A VÁCUO. N. M. C. MENEZES 1, W. F. MARTINS 1, E. M. FIGURA 1, D. A. LONGUI 2, G. M. F. ARAGÃO 1 1 Universidade Federal de Santa Catarina, Pós Graduação em Engenharia de Alimentos 2 Universidade Federal do Paraná, Departamento de Engenharia de alimentos para contato: glaucia.aragao@ufsc.br RESUMO As bactérias ácidos lácticas (BAL) são importantes deteriorantes de produtos cárneos. O objetivo deste estudo foi modelar a influência da temperatura (6, 12, 15, 20 e 25 C) sobre o crescimento da flora natural de BAL, em presunto fatiado e embalado a vácuo. O modelo primário de Baranyi e Roberts apresentou boa capacidade de ajuste, com valores de R 2 > 0,93, valores de RMSE próximos a zero e Bias e Exatidão próximos a 1,0. O aumento da temperatura de 6 para 25 C levou ao aumento da velocidade específica máxima de crescimento (µ máx ), variando entre 0,046 a 0,39 h -1, e os valores do parâmetro fase lag (λ) diminuíram de 179,2 para 21,4 h. O modelo secundário exponencial foi selecionado para descrever a influência da temperatura sobre µ máx (R 2 = 0,9687). Conclui-se que o crescimento da flora natural de bactérias ácido lácticas em presunto é fortemente influenciado pela temperatura de armazenamento, mesmo em condições de refrigeração, e pode ser predito pelo modelo secundário obtido. 1. INTRODUÇÃO Os produtos alimentares prontos para consumo, como presunto, peito de peru e peito de frango dentre outros, têm grande importância econômica, e seu consumo vem crescendo cada vez mais (AUDENAERT et al., 2010). O controle de qualidade e segurança destes alimentos em todas as fases da cadeia do frio são uma das principais preocupações da indústria. Esse controle é importante para reduzir as perdas de alimentos e os riscos para a saúde do consumidor (STAHL et al., 2015). As bactérias ácido láticas (BAL) são o principal grupo de bactérias associadas com a deterioração de produtos de cárneos cozidos e embalados a vácuo mantidos sob refrigeração, incluindo presunto. Essas bactérias podem causar efeitos indesejáveis, tais como sabores estranhos, produção de gás, diminuição do ph, descoloração e / ou cor esverdeada e produção de

2 limo, diminuindo a vida útil desses produtos (BORCH et al., 1996; SAMELIS et al., 2000; SLONGO et al., 2009; LLORET et al., 2016). A modelagem matemática é uma ferramenta importante para descrever a vida útil dos alimentos (KOUTSOUMANIS e NYCHAS, 2000; MATARAGAS et al., 2006). O modelo de Baranyi e Roberts é um dos modelos primários de crescimento mais utilizados na microbiologia preditiva (VAN IMPE et al., 2005; LERBET e LEBERT, 2006). Os modelos secundários descrevem as respostas de um ou mais parâmetros de um modelo de primário a uma ou mais condições ambientais (WHITING E BUCHANAN, 1993).. Muitos trabalhos descrevem o crescimento de microrganismos inoculados em alimentos, Silva (2015) estudou a vida útil de presunto inoculado com Weissela viridescens, mas poucos estudam o crescimento da concentração da flora natural presente nos produtos. O objetivo deste estudo foi modelar a influência da temperatura (6, 12, 15, 20 e 25 C) sobre o crescimento da flora natural de BAL, em presunto fatiado e embalado a vácuo. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Preparo das amostras As amostras de presunto utilizadas durante os experimentos foram adquiridas no comércio local, observando-se a data de fabricação do produto com data de produção inferior a 30 dias, e armazenadas a 4 C). Foi utilizado o presunto cozido sem capa de gordura ((Seara, São Paulo). As peças foram fatiadas utilizando um fatiador de frios (Metvisa, modelo CFIE 250), com espessura ajustada em 1,5 mm, em uma câmara de fluxo. As amostras de aproximadamente 20g foram acondicionadas em duas embalagens, a embalagem primária (em contato direto com o presunto) foi uma embalagem plástica estéril de homogeneização com capacidade para 384 ml, a qual foi dobrada e armazenada dentro da embalagem secundária para alimentos refrigerados. A embalagem secundária foi, então, selada a vácuo (Selovac, modelo 2006). Após a selagem, as amostras de presunto foram incubadas em estufa incubadora (B.O.D), sendo a temperatura no ambiente interno da estufa registrada em datalogger (Testo 174, Lenzkirch, Alemanha) previamente calibrado (com resolução de 0,1 C), a cada dez minutos. O crescimento da flora natural em presunto fatiado embalado a vácuo foi avaliado em cinco condições isotérmicas, nas temperaturas de 6, 12, 15, 20 e 25 C. As amostras foram retiradas ao longo do tempo de armazenamento, até que a curva de crescimento atingisse a fase estacionária, para cada temperatura. 2.2 Análises microbiológicas Como as amostras de presunto foram acondicionadas em embalagens de homogeneização, a água peptonada 0,1% (p/v) esterilizada foi adicionada diretamente à embalagem primária, na

3 proporção 9:1 (volume de água peptonada (ml)/massa de presunto (g)), obtendo-se a diluição 1:10 (10-1 ). As amostras foram homogeneizadas em Stomacher (Marca ITR, Modelo 1204) durante 60 segundos. A seguir, foram realizadas as diluições decimais apropriadas e plaqueadas em placas de Petri estéreis descartáveis (técnica pour plate), adicionando-se, posteriormente, o meio de cultura Ágar De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) (Difco TM Lactobacilli MRS Broth, Le Pont de Claix, França) em dupla camada, para a contagem de bactérias ácido lácticas. As placas foram incubadas invertidas em estufa a 30 ºC por 48 horas. A concentração foi expressa em UFC/g de presunto Modelagem matemática Modelo Primário O modelo de Baranyi e Roberts (BARANYI; ROBERTS, 1994) descrito pelas Equações (1, 2 e 3) foi ajustado aos dados experimentais de crescimento da flora natural das amostras de presunto cozido fatiado e embalado a vácuo, pelo software MATLAB R2013a (The MathWorks Inc, Natick, USA) para a estimativa dos parâmetros de crescimento: duração da fase lag (λ), velocidade específica máxima de crescimento (μ máx ) e população máxima atingida (y máx ). Para a obtenção de melhores ajustes do modelo aos dados, a estimativa foi realizada em duas etapas. Na primeira etapa, a estimativa dos parâmetros foi realizada pelo ajuste do modelo aos dados experimentais. A média aritmética entre os valores do parâmetro h 0 (equação 3) para todas as temperaturas foi calculada. Na segunda etapa, o parâmetro h 0 foi fixado com o valor da média calculada, e os parâmetros λ, μ máx e y máx foram estimados pelo novo ajuste. ( ) ( ) F( )- ( F - ( ( )) ) (1) ( ) ( (- ) (- ) - [(- )- ] ) (2) em que N é a concentração celular no tempo t, N 0 é a concentração celular inicial, N máx (y máx ) é concentração celular máxima, m é o parâmetro de curvatura do modelo e o parâmetro h 0 é considerado o estado fisiológico das células e é dado pela Equação 2.3: Modelos secundários Após a obtenção do parâmetro primário de crescimento, μ máx, três modelos secundários foram comparados quanto à capacidade de descrever a influência da temperatura sobre este parâmetro. Os valores de μ máx foram obtidos às temperaturas isotérmicas de 6, 12, 15, 20 e 25 C. (3)

4 Na tabela 1 são apresentadas as equações dos modelos secundários utilizados. Os modelos foram ajustados com auxilio do software Excel (Microsoft ). Tabela 1- Modelos secundários usados para descrever a influência da temperatura no parâmetro velocidade especifica máxima de crescimento Modelos Equações Secundários Linear k= b + rt Raiz Quadrada k 1/2 = b (T T mim ) Exponencial k= a exp(bt) em que: k é o parâmetro de interesse (μ máx ), T é a temperatura ( C), T mim é a temperatura mínima para o crescimento ou coeficiente do modelo e a e b são coeficientes do modelo. As médias para o parâmetro da população máxima atingida y máx [ln (UFC/g)] foram utilizadas como modelo secundário Análises estatísticas A avaliação da capacidade preditiva dos modelos primários e secundários em descrever os dados experimentais foi analisada através dos índices estatísticos: coeficiente de determinação (R 2 ), raiz do erro médio quadrático (RMSE), fator bias e fator exatidão (ROSS, 1996). As equações utilizadas para calcular os índices estatísticos são apresentadas na Tabela 2. Tabela 2 - Índices estatísticos utilizados para comparação e validação dos modelos. Índices Estatísticos Equações R 2 ( ) ( ) RMSE ( ) Fator bias ( ( ) ) Fator exatidão ( ( ) ) em que n é o número de dados experimentais, p é o número de parâmetros do modelo.

5 O coeficiente de determinação (R 2 ) fornece uma medida da proporção da variação explicada pela equação de regressão em relação à variação total das respostas. Quanto ao valor de do RMSE, quanto menor seu valor melhor é o desempenho do modelo analisado. O fator bias é uma estimativa para avaliar a diferença média entre os valores observados e preditos. Fator bias igual a 1 significa que o valor observado é exatamente igual ao predito. No entanto, quando bias maior 1, o valor predito é maior que o observado e indica que o modelo falha de forma segura (fail-safe), enquanto fator bias menor 1, significa que o predito é menor que o observado e que o modelo falha de forma perigosa (fail-dangerous) (LONGHI et al., 2013). O fator exatidão é a medida da diferença média absoluta entre os valores preditos e observados, por se tratar de valores absolutos é sempre maior ou igual a 1, sendo que quanto maior o seu valor, menos precisa a estimativa da média. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO As curvas de crescimento da flora natural em presunto fatiado embalado a vácuo em condições isotérmicas nas temperaturas de 6, 12, 15, 20 e 25 C, ajustadas pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994) (Equações 1, 2 e 3), estão representadas na Figura 1. Figura 1- Curvas de crescimento de flora natural em diferentes temperaturas (6( ), 12(x), 15( ), 20( ) e 25( ) C) e ajuste do modelo de Baranyi e Roberts (-) aos dados experimentais obtidos em presunto. A Tabela 3 apresenta os valores dos parâmetros primários de crescimento de flora natural em presunto a 6, 12, 15, 20 e 25 ºC, ajuste demonstrado na Figura 1.

6 Tabela 3 - Parâmetros de crescimento obtidos pelo ajuste do modelo de Baranyi e Roberts aos dados experimentais obtidos em presunto a 6, 12, 15, 20 e 25 C Temperatura ( C) µ(h -1 ) λ (h) y máx Vida útil (dias) 6 0, ,2 19, ,089 93,0 18, ,093 89,0 19, ,244 34,0 18, ,387 21,4 18,92 2 A temperatura de armazenamento apresentou grande influência nos parâmetros fase lag (λ) e velocidade específica máxima de crescimento (µ máx ). O aumento da temperatura de 6 a 25 C levou ao aumento da velocidade específica máxima de crescimento (µ máx ), variando entre 0,046 a 0,39 h -1. Quanto aos valores do parâmetro fase lag (λ), o aumento da temperatura ocasionou diminuição destes valores, de 179,2 para 21,4 h. A estimativa precisa dos parâmetros de crescimento microbiano, particularmente a duração da fase lag (λ) e a velocidade específica máxima de crescimento (μ máx ), são essenciais em muitas áreas da microbiologia, por exemplo, para caracterizar os efeitos de antimicrobianos, avaliação da vida útil, para desenvolver modelos cinéticos para fermentação e tecnologia de alimentos (DALGAARD; KOUTSOUMANIS, 2001). Os índices estatísticos avaliados estão apresentados na Tabela 4. Tabela 4 - Índices estatísticos obtidos pelo ajuste do modelo de Baranyi e Roberts aos dados experimentais obtidos em presunto a 6, 12, 15, 20 e 25 C. Temperatura ( C) Índices Estatísticos R 2 RMSE Fator Bias Fator Exatidão 6 0,9386 0,9927 1,0029 1, ,9927 0,5492 1,0003 1, ,9994 0,1884 1,0002 1, ,9864 0,8102 1,0010 1, ,9910 0,551 1,0011 1,0036 Os valores observados na Tabela 4 mostram que o modelo teve um bom ajuste, com valores de R 2 em torno de 0,98 ±0,02. É possível observar um bom ajuste do modelo de Baranyi e Roberts aos dados experimentais, uma vez que os valores de R 2, fator bias e fator exatidão encontraram-se próximos de 1. Slongo (2009) obteve valores de R 2 de 0,80 avaliando o crescimento de bactérias ácido lácticas em presuntos pressurizados. Gospavic et al. (2008) estudaram o crescimento de Pseudomonas spp. em carne de frango em diferentes temperaturas, encontrando valores de R² em torno de 0,98 com o modelo de Baranyi e Roberts. Kreyenschmidt

7 et al. (2010) encontraram valores de R² em torno de (0,93 a 0,98) para determinação da vida útil de fatias de presuntos com base no crescimento de BAL. Os valores de RMSE encontrados variaram de (0,188 a 0,99). Kreyenschmidt et al. (2010) encontraram valores de RMSE variando entre 0,409 e 0,800. Esses valores de R² e RMSE podem ser explicados pelo fato de se tratar de contagens microbianas (microbiota natural) de um alimento sólido, o que pode levar às variações nas contagens. Dentre os modelos secundários, o modelo exponencial, descrito pela Equação (4), foi o que melhor descreveu a influência da temperatura sobre a velocidade específica máxima de crescimento (μ máx ) de flora natural de BAL, com valor de R 2 igual a 0,97. µ máx = 0,0215*exp (0,115*T) (4) A média aritmética dos valores do parâmetro y máx para todas as temperaturas foi utilizada como modelo secundário. O valor da média aritmética calculada para o parâmetro y máx nas amostras controle foi de 19,03 [ln (UFC/g)]. 4. CONCLUSÕES Os resultados obtidos neste estudo mostram que o modelo de Barany e Roberts apresentou um bom ajuste aos dados decrescimento da flora natural de bactérias ácido lácticas em presunto. Este crescimento foi fortemente influenciado pela temperatura de armazenamento, mesmo em condições de refrigeração, que pode ser predito pelo modelo secundário obtido. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AUDENAERT, K.; D HAE E, K.; MESSE S, K.; a. Diversity of lactic acid bacteria from modified atmosphere packaged sliced cooked meat products at sell-by date assessed by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Food Microbiol., v. 27, n. 1, p , BARANYI, J.; ROBERTS, T. A. A dynamic approach to predicting bacterial growth in food. Int. J. Food Microbiol., v. 23, n. 3-4, p , BORCH, E.; KANT-MUERMANS, M. L.; BLIXT, Y. Bacterial spoilage of meat and cured meat products. Int. J. Food Microbiol., v. 33, n. 1, p , DALGAARD, P.; KOUTSOUMANIS, K. Comparison of maximum specific growth rates and lag times estimated from absorbance and viable count data by different mathematical models. J. Microbiol. Methods, v. 43, n. 3, p , GOSPAVIC, R.; KREYENSCHMIDT, J.; BRUCKNER, S.; POPOV, V.; HAQUE, N. Mathematical modelling for predicting the growth of Pseudomonas spp. in poultry under variable temperature conditions. Int. J. Food Microbiol., v. 127, n. 3, p , HUANG, L. IPMP A comprehensive data analysis tool for predictive microbiology. Int. J.

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