PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS LÁCTICAS A PARTIR DE AMOSTRAS DE LEITE CRÚ DE BÚFALA PARA APLICAÇÃO EM ALIMENTOS

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1 PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS LÁCTICAS A PARTIR DE AMOSTRAS DE LEITE CRÚ DE BÚFALA PARA APLICAÇÃO EM ALIMENTOS A.S. Motta 1, J.I.B. Gonçalves 2, M.M. Gomes 3 1 Departamento Microbiologia, Imunologia e Parasitologia Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Instituto de Ciências Básicas da Saúde CEP: Porto Alegre RS Brasil, Telefone: 55 (51) Fax: 55 (51) (amanda.motta@ufrgs.br) 2 Aluno de Graduação em Ciências Biológicas da UNIVATES, Departamento Microbiologia, Imunologia e Parasitologia Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Instituto de Ciências Básicas da Saúde CEP: Porto Alegre RS Brasil, Telefone: 55 (51) Fax: 55 (51) (joaoismaelbudelon@gmail.com) 3 Mestre em Ciência e Tecnologia Agroindustrial Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Agronomia Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) (meantiqua@gmail.com) RESUMO O trabalho objetivou avaliar as propriedades tecnológicas e de inocuidade de bactérias ácido-lácticas (BAL) oriundas do leite crú refrigerado de búfala. Das amostras de leite recebidas foram selecionados dois isolados identificados como Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris e Enterococcus faecium, que demonstraram os resultados esperados nas avaliações realizadas. Na avaliação do perfil de acidificação ambos os isolados obtiveram ph próximo a 5,0 ao final de 48 h. Nas avaliações do perfil proteolítico, ambas as BAL, apresentaram halos de proteólise, mostrando a capacidade de degradação da caseína. Na avaliação dos parâmetros de inocuidade nenhuma das culturas apresentou a produção de hemolisinas ou gelatinases; apenas uma das culturas apresentou resistência ao antibiótico tobramicina. Quando expostas a diferentes conservantes usados na indústria de alimentos, as culturas permaneceram estáveis. Neste sentido estes isolados tornam-se interessantes de serem explorados no sentido que poder-se incrementar os estudos com aplicação em produtos lácteos. ABSTRACT The study aimed to evaluate the technological properties and safety of lactic acid bacteria (LAB) arising from the raw cooled buffalo milk. The incoming milk samples were selected two isolates identified as Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris and Enterococcus faecium, which showed the expected results in the assessments. In the evaluation of the acidification profile of the isolates obtained ph around 5.0 at the end of 48 h. In the evaluations of the proteolytic profile, both BAL showed halos proteolysis, showing the casein degradation capacity. In the evaluation of the safety parameters none of the cultures showed the production of hemolysin or gelatinases; only one of the cultures showed resistance to tobramycin antibiotic. When exposed to different preservatives used in the food industry, the cultures remained stable. In this sense these isolates become interesting to be explored in order to be able to increase the studies with application in dairy products. PALAVRAS-CHAVE: leite de búfalo, propriedades tecnológicas, novos derivados lácteos, queijo de búfalo, inocuidade KEYWORDS: instructions; buffalo milk, technological properties, new dairy products, buffalo cheese, safety

2 1.INTRODUÇÃO Uma variedade de microrganismos, em particular bactérias ácido lácticas (BAL), têm sido avaliadas pelo seu potencial de aplicação como culturas probióticas, como culturas adjuntas ou starters em vários produtos alimentícios e ou aplicações terapêuticas (Rodgers, 2008). As BAL apresentam grande relevância econômica, uma vez que elas realizam um importante papel tanto no controle fermentativo na produção de produtos fermentados e como probióticos para a saúde humana e animal (Konings et al., 2000). A suas propriedades metabólicas contribuem para o desenvolvimento de características sensoriais desejáveis e também permitem a preservação ou o aumento do valor nutritivo da matéria-prima na qual elas são incorporadas (Cogan et al., 1997). Muitas das propriedades tecnológicas das BAL starters e não-starters isoladas do leite e do queijo são importantes para explorar quando você pensa no uso destes microrganismos na produção e determinação das características dos produtos. As BAL são naturalmente encontradas em vários produtos alimentícios e são importantes também na inibição de microrganismos patógenos pela produção de uma variedade de compostos como ácidos, diacetil, peróxido, hidrogênio, dióxido de carbono, álcool, aldeído e bacteriocinas (Galvez et al., 2007). Importante considerar que diferentes espécies possuem diferentes padrões de atividade e comportamento sob condições industriais, assim como seus efeitos em promover a qualidade aos produtos (Piraino et al., 2008). A viabilidade destes organismos nos alimentos pode ser afetada por fatores como condições de fermentação, temperatura de armazenamento, processos de conservação e características inerentes do leite de cada espécie (Shah, 2000). As pesquisas envolvendo a microbiota láctica a partir de leite de búfala ainda são escassas, sendo assim este estudo visa dar suporte às investigações nessa área, isolando e identificando culturas com potencial funcional e antimicrobiano para ser aplicado em produtos alimentícios. O objetivo desse estudo foi isolar BAL a partir de amostras de leite cru de búfala refrigerado e identificar características individuais que podem ser exploradas no processo de preparação de produtos derivados do leite de búfala. Com este trabalho espera-se contribuir com informações relevantes em relação a microbiota láctica desta matéria-prima. 2.MATERIAS E MÉTODOS 2.1 Isolamento e identificação dos isolados As bactérias ácido láticas foram isoladas a partir de amostras de leite crú de búfala refrigerado, recebidas de um Laticínio localizado no sul do Estado do Rio Grande do Sul - Dabúfala (CISPOA 854) localizado no Cassino, RS, Brasil. De cada amostra do reservatório, foi retirado 1 ml de leite e homogeneizado em 9 ml de solução salina (0,85%), e após feitas as diluições foi realizado plaqueamento em Agar MRS com incubação a 30ºC por horas. Após a incubação as placas foram avaliadas e as colônias foram isoladas para a realização dos demais testes previstos neste estudo. A identificação das bactérias selecionadas foi realizada a partir do sistema Vitek. 2.2 Avaliação da capacidade de acidificação A avaliação do potencial de acidificação dos isolados foi feita a partir de um pré-inóculo das bactérias codificadas como M1A1 e M7AN7, e de uma cultura controle (Fermento Láctico/Danisco)

3 em caldo MRS a 30º C por 24 horas. Após a confirmação do crescimento, inoculou-se 1% de cada preparado em 10 ml de leite UHT desnatado, sendo o experimento realizado em triplicata com os seguintes preparados: P1: M1A1, P2: M7AN7, P3: M1A1 + M7AN7 e P4: Fermento láctico. A incubação foi feita a 35º, com as avaliações do ph tendo sido feitas nos tempos: 0h, 6h, 24h, 30h e 48h. Esta metodologia foi feita de acordo com Zacarias et al., (2011) com modificações. 2.3 Avaliação da atividade proteolítica A avaliação da atividade proteolítica foi realizada em ágar-leite. As culturas foram inoculadas em forma de picada, em duplicata. As placas foram incubadas a 30ºC. Como controle positivo utilizou-se a bactéria indicadora Pseudomonas aeruginosa ATCC As leituras dos halos foram feitas em 24h e 48h (Belgacem et al., 2010). O fermento láctico foi também testado para avaliação do potencial proteolítico. 2.4 Avaliação da inocuidade dos isolados de bactérias lácticas A avaliação da capacidade hemolítica dos isolados foi feita a partir de inoculação em ágar sangue, através do método de esgotamento, e as placas foram incubadas a 35 C por 24 horas. Utilizou-se a bactéria indicadora Staphylococcus aureus ATCC como controle positivo e a cultura fermento como controle negativo. Para a avaliação da produção de gelatinase os isolados foram inoculados no meio de cultura ágar gelatina, em duplicata e incubou-se a 35 C por 24h. Após, os meios inoculados foram incubados a 4 C por 30 minutos para se proceder com a leitura. Como controle positivo utilizou-se a bactéria indicadora Pseudomonas aeruginosa ATCC e como controle negativo a bactéria indicadora Escherichia coli ATCC Para a avaliação da suscetibilidade dos isolados aos antibióticos foi realizado o antibiograma. O procedimento foi feito em ágar Mueller-Hinton. Os antibióticos usados foram Ciprofloxacina, Norfloxacina, Tobramicina e Ampicilina. Incubou-se as placas a 35 C por 24 horas e depois observou-se o resultado, com a avaliação das medições dos halos e verificação dos perfis de suscetibilidade. 2.5 Avaliação da estabilidade das bactérias lácticas aos conservantes de alimentos Para a avaliação da estabilidade dos isolados M1A1 e M7AN7, estas culturas foram expostas a diferentes concentrações de diferentes preservativos químicos usualmente aplicados em alimentos, para verificar a manutenção da concentração celular. Foram empregados: Pediocina 0,5% e 1%; Sorbato de Potássio 0,1%, 0,2%, 0,5% e 1%; Propionato de Cálcio 0,3% e 0,6%; e Nisina 0,01% e 0,02%). Este experimento foi realizado e as culturas foram avaliadas pelo método da microdiluição com a contagem e expressão dos resultados em unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml), buscando-se avaliar a manutenção ou não das concentrações dos isolados quando expostos as diferentes condições. Como controle foram empregadas as culturas sem a aplicação dos conservantes químicos (Georgieva et al., 2009).

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Várias bactérias lácticas puderam ser isoladas e parcialmente estudadas, tendo sido selecionadas duas culturas para serem exploradas nesta pesquisa. Os isolados foram identificados a partir do sistema Vitek, sendo Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris (M7AN7) e Enterococcus faecium (M1A1). De acordo com Ogier et al. (2002), BAL pertencentes aos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus e Streptococcus são comumente isoladas de amostras de leite e de outros produtos lácteos, mostrando que os gêneros das BAL isoladas das amostras de leite de búfala, são bactérias comumente encontradas e que apresentam caraterísticas importantes de serem estudadas. Considerando as propriedades passíveis de serem exploradas, a aplicabilidade esperada para culturas starters é que tenham capacidade para acidificar a matéria-prima de forma rápida e o desenvolvimento de características sensoriais desejáveis aos produtos finais (Leroy et al., 2006). A importância da rápida acidificação se dá pela preservação do alimento, além de impedir o crescimento de microbiota patógena, sem alterar as características do produto. O potencial de acidificação do leite dos isolados foi analisado pelo período de 48h. Pode ser observado, que ambas as culturas, de forma isolada ou associadas, apresentaram um resultado semelhante ao observado quando da avaliação de um fermento lácteo comercial (Danisco) composto por duas bactérias lácteas (Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactacoccus lactis subps. cremoris; o que indica que possuem propriedades tecnológicas que podem ser exploradas na produção de derivados do leite de búfala. Com relação à atividade proteolítica, ambos os isolados mostraram a capacidade de hidrólise da caseína em Agar leite, com medidas de halos de 13,66 mm para E. faecium e 14 mm para L. mesenteroides. O controle positivo foi o isolado de Pseudomonas que apresentou halo de 17,85 mm. Na avaliação da inocuidade, ambos os isolados não foram produtores de hemólise quando avaliados sobre Agar sangue, nem produtores da enzima gelatinase, sendo estas propriedades desejáveis quando se pensa na aplicação de bactérias em alimentos. Os isolados, quando submetidos a diferentes tipos de agentes antimicrobianos, apresentaram resistência somente a um deles, a tobramicina, sendo sensíveis aos demais testados. Quando submetidos aos tratamentos com diferentes conservantes químicos usados na indústria de alimentos, pode-se observar que nenhum dos isolados teve redução no número de unidades formadoras de colônias por mililitro, nem a cultura controle (Fermento comercial), mostrando a estabilidade destas culturas quando submetidas aos diferentes tratamentos, o que mostra a possiblidade destas culturas de se manterem nas condições de processamento. Estas características são extremamente desejáveis pensando na aplicação no desenvolvimento de novos produtos; e as culturas hoje empregadas comercialmente apresentam estas propriedades. Testes preliminares já foram feitos no sentido do desenvolvimento de um novo produto com as duas culturas associadas. Porém mais testes necessitam ser realizados. 4. CONCLUSÕES O presente estudo mostrou que os isolados Leuconostoc mesenteroides e Enterococcus faecium apresentaram propriedades importantes, sugerindo um estudo mais aprofundado para que se tenha maior conhecimento, também, sobre suas características probióticas e sua aplicação na produção de alimentos. A rápida acidificação do leite, semelhante à cultura controle (Fermento Danisco), demonstrou que os isolados possuem potencial para serem culturas starters na produção de derivados do leite, bem como sugere-se ainda a aplicação como culturas adjuntas, no sentido de observar a conferência de outras propriedades e/ou benefícios aos produtos lácteos obtidos.

5 5. AGRADECIMENTOS Agradecemos ao Laticínio DaBúfala (Cassino RS) e a COOPERBUFALO que são parceiras deste trabalho no fornecimento da matéria-prima leite de búfala. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial pela Bolsa de Mestrada a aluna Melina Mesquita Gomes e ao aluno João Ismael que pode dar continuidade ao referido trabalho. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Belgacem, Z. B., Abriouel, H., Omar, N. B., Lucas, R., Martínez-Canamero, M., Gálvez, A., Manai, M. (2010). Antimicrobial activity, safety aspects, and some technological properties of bacteriocinogenic Enterococcus faecium from artisanal Tunisian fermented meat. Food Control, 21, Cogan, T. M.; Barbosa, M.; Beuvier, E.; Bianchi-Salvadori, B.; Cocconcelli, P. S.; Fernandes, I.; Gomez, J.; Gomez, R.; Kalantzopoulos, G.; Ledda, A.; Medina, M.; Rea, M. C.; Rodriguez, E. (1997). Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy products. Journal of Dairy Research, 64, (3), Disponível em: Gálvez, A.; Abriouel, H.; López, R.L.; Omar, N.B. (2007). Bacteriocin-based strategies for food preservation. International Journal of Food Microbiology, 120, Georgieva, R., Iliev, I., Haertlé, T., Chobert, J. M., Inanova, I., Danova, S. (2009). Technological properties of candidate probiotic Lactobacillus plantarum strains. International Dairy Journal, 19, Konings, W.N.; Kok, J.; Kuipers, O.P.; Poolman, B. (2000). Lactic acid bacteria: the bugs of the new millennium. Current Opinion of Microbiology, 3(3), Leroy, F.; Verluyten, J.; Vuyst, L. (2006) Functional meat starter cultures for improved sausage fermentation. International Journal of Food Microbiology, 106, (3), Ogier, J. C.; Son, O.; Gruss, A.; Tailliez, P.; Delacroix-Buchet, A. (2002). Identification of the bacterial microflora in dairy products by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Applied Environmental Microbiology, 68(8), Piraino, P.; Zotta, T.; Ricciardi, A.; Mcsweeney, P.L.H.; Parente, E. (2008). Acid production, proteolysis, autolytic and inhibitory properties of lactic acid bactéria isolated from pasta filata cheeses: a multivariate screening study. International Dairy Journal, 18, Rodgers, S. (2008). Novel applications of live bacteria in food services: probiotics and protective cultures. Trends and Food Science and Technology, 19, Shah, N.P. (2000). Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods. Journal of Dairy Science, 83,

6 Zacarías, M. F., Binetti, A., Laco, M., Reinheimer, J., Vinderola, G. (2011). Preliminary technological and potential probiotic characterisation of bifidobacteria isolated from breast milk for use in dairy products. International Dairy Journal, 21,