CONTAGEM, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS PSICROTRÓFICAS PROTEOLÍTICAS PREDOMINANTES EM LEITE CRU REFRIGERADO

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1 CONTAGEM, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS PSICROTRÓFICAS PROTEOLÍTICAS PREDOMINANTES EM LEITE CRU REFRIGERADO D.C. Oliveira 1, J. W. Canuto 1, C. L. O. Pinto 2, R. C. A. B. Campos 3, P. R. Condé 3, M. L. Martins 4. 1-Estudantes de graduação - Departamento de Ciências e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais, Campus Rio Pomba CEP: Rio Pomba MG Brasil, Telefone: 55 (32) (dairocabral@gmail.com) 2- Farmacêutica Bioquímica, D.Sc. Microbiolgia Agrícola, Pesquisadora Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG/Sudeste), Vila Gianetti, 46, Caixa Postal 216, CEP Viçosa-MG. claudia@epamig.br 3- Técnicas de laboratório - Departamento de Ciências e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais, Campus Rio Pomba. 4- Professor do Departamento de Ciências e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais, Campus Rio Pomba. RESUMO A refrigeração do leite cru nas fazendas reduz perdas econômicas em consequência da atividade acidificante de bactérias mesofílicas. Entretanto, este processo, seleciona bactérias psicrotróficas relacionadas a problemas tecnológicos e econômicos para a indústria de laticínios. Objetivou-se avaliar e quantificar quanto ao seu potencial proteolítico a contagem de microorganismos psicrotróficos proteolíticos no leite cru armazenado em tanques de refrigeração de Minas Gerais. Bactérias psicrotróficas proteolíticas foram isoladas do leite cru refrigerado e caracterizadas quanto à coloração de Gram, morfologia, atividades de oxidase e catalase, fermentação de glicose e proteólise em Ágar Caseinato. Constataram-se altas contagens microbianas nas amostras de leite cru e isolados bacterianos fortemente proteolíticos. A microbiota Gram-negativa foi predominante dentre os isolados, em especial bactérias não fermentadoras de glicose, principalmente Pseudomonas. ABSTRACT The cooling of raw milk on farms reduces economic losses as a result of acidifying activity of mesophilic bacteria. However, this process selects psychrotrophic bacteria related to technological and economic problems for the dairy industry. In order to evaluate the microbiological quality of raw milk, samples from storage tanks of a dairy industry of Minas Gerais were analyzed. Proteolytic psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk and characterized for Gram stain, shape, oxidase and catalase activity, glucose fermentation and proteolyses in Caseinate Ágar. Cooled raw milk in addition to presenting high microbial counts, presented isolated highly proteolytic, lipolytic and lecithinase producers. The Gram-negative micro-organisms were isolated more frequently, particularly glucose non-fermentative bacteria being Pseudomonas prevalent among these isolates. PALAVRAS-CHAVE: Leite, micro-organismos deterioradores, identificação.

2 KEYWORDS: Milk, spoilage micro-organisms, identification 1. INTRODUÇÃO A implementação da coleta e transporte do leite cru refrigerado a granel (Brasil, 2011) tem contribuído para o alcance de novos mercados para o leite brasileiro e sustentabilidade da produção. Entretanto, a contaminação deste alimento com bactérias psicrotróficas representa um dos principais fatores limitantes para a obtenção de leite e produtos lácteos de boa qualidade. Esses microorganismos são capazes de multiplicar a 7 C ou a temperaturas inferiores, independentemente de sua temperatura ótima de crescimento, por possuírem mecanismos específicos de adaptação ao frio. Além disso, produzem enzimas proteolíticas, lipolíticas e lecitinases termo resistentes associadas à ocorrência de problemas tecnológicos como perdas de qualidade e rendimento, redução da vida útil do leite UHT e de outros produtos lácteos, coagulação doce do leite e ocorrência de sabores amargos (Speck; Adams, 1975; Godinho e Fox, 1981; Cousin, 1982; Fairbairn e Law, 1986; Sørhaug e Stepaniak, 1997; Chen et al., 2003; Pinto, 2004; Cempírková e Mikulová, 2009), com consequentes problemas econômicos para produtores e indústria de laticínios. A microbiota psicrotrófica inclui espécies de bactérias Gram-negativas como Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Alcaligenes, Burkholderia, Chromobacterium e Flavobacterium e bactérias Gram-positivas como Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus e Microbacterium spp. (Pinto, 2004). Dentre os micro-organismos que resistem à pasteurização, espécies do gênero Bacillus são predominantes, especialmente B. licheniformis e B. cereus (Sørhaug e Stepaniak, 1997; Pinto, 2004). Entre as bactérias psicrotróficas isoladas de leite cru e de produtos lácteos refrigerados, Pseudomonas é isolado com maior frequência por apresentarem baixo tempo de geração entre 0 e 7 ºC (Cousin, 1982; Sørhaug e Stepaniak, 1997; Eneroth et al., 1998; Uraz e Çitak, 1998; Eneroth et al., 2000a,b; Pinto, 2004; Pinto et al. 2006; Arcuri et al., 2008). As caseínas, principal alvo das proteases de bactérias psicrotróficas, são classificadas em quatro subgrupos de acordo com a sua sequência de aminoácidos: α, β, γ e κ-caseína (Walstra e Jennes, 1984). Essas proteínas são muito susceptíveis à hidrólise por possuírem forma helicoidal e agregarem-se na forma de micelas. A superfície da micela é composta, principalmente, por κ-caseína, a qual recobre o seu interior, composto pelas demais subunidades: α, β e γ-caseína (Walstra e Jennes, 1984). O armazenamento do leite a baixas temperaturas propicia a dissociação da fração β-caseína da micela, com aumento de até 30% da concentração de caseína solúvel e, assim, ocorre o aumento da exposição e susceptibilidade dessa fração à proteólise por atividade de enzimas termorresistentes de bactérias psicrotróficas. Portanto, a prevenção da contaminação do leite com micro-organismos psicrotróficos é uma condição crítica para a obtenção de matéria-prima e derivados de alta qualidade. A contaminação do leite cru com bactérias psicrotróficas proteolíticas superior a 2,0 x 10 6 UFC.mL -1 compromete a integridade das frações caseínicas, com consequente decréscimo de, aproximadamente, 5% na produção de queijos (Cousin et al.,1977; Costa et al., 2002). Embora a atividade proteolítica do leite não seja é correlacionada com a contagem de bactérias psicrotróficas e sim com o tipo de bactéria e o seu potencial enzimático (Cempírková e Mikulová, 2009), ainda há poucos estudos sobre a diferenciação do potencial de bactérias que compõem essa

3 microbiota. Desta forma, objetivou-se avaliar e quantificar quanto ao seu potencial proteolítico a contagem de micro-organismos psicrotróficos proteolíticos no leite cru armazenado em tanques de refrigeração. 2. MATERIAL E MÉTODOS Amostras de 200 ml de leite cru refrigerado foram coletadas em tanques de armazenamento de um laticínio de Minas Gerais em frascos de vidro esterilizados, aleatoriamente em três repetições entre fevereiro e maio de Imediatamente foram acondicionadas em banho de gelo, a temperatura inferior a 4 C e, transportadas ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do Campus Rio Pomba para a realização das contagens de microorganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos em Ágar Caseinato com incubação a 6,5 ± 0,5 ºC, por 10 dias (Martins, 2007). Para o isolamento de bactérias psicrotróficos proteolíticas, selecionou-se duas a três colônias em ágar leite das maiores diluições com halos de clarificação as quais foram inoculadas em Ágar Tripticaseína e Soja (TSA) semi-sólido e conservadas em a 4 C. Foram, desta forma, formada uma coleção 75 isolados. Para ativação dos isolados utilizou-se em caldo TSB, com incubação a 25 ºC, por 48 horas. Inicialmente, os isolados foram caracterizados quanto à reação de Gram, morfologia e atividades de oxidase e catalase. O metabolismo fermentativo da glicose foi pesquisado nos isolados Gram-negativos (PINTO, 2004). Estes isolados foram identificados empregando-se o sistema Bactray (Difco ) de acordo com as recomendações do fabricante. Após a identificação, os isolados foram inoculados em Ágar Caseinato com auxílio de uma alça de repicagem e incubados a 6,5 ± 0,5 ºC, por 10 dias. Posteriormente, foi realizada a medição dos halos de proteólise com auxílio de paquímetro. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na contagem de psicrotóficos, ficaram entre 4 x 10 3 UFC ml -1 á 5,9 x 10 5 UFC ml -1. E a contagem do psicrotóficos proteolíticos houve uma variação de 5 x 10 2 UFC ml -1 até 17,5x 10 4 UFC ml -1. Podemos observar que a contagem de psicrotrófico proteolítico está muito acima do índice que é de 2,0 x 10 6 UFC ml. Dentre os 75 isolados de bactérias psicrotróficas proteolíticas, 74 eram bastonetes Gram-negativos (98,7%) e um coco Gram-positivo (1,3%). Em relação às atividades de catalase e oxidase, 93,3% e 96,0% dos isolados foram positivos, respectivamente. Na fermentação de glicose, 96,0% foram negativos. Estes resultados indicaram a alta prevalência de bactérias do gênero Pseudomonas entre os isolados. Um total de 13 isolados foi identificado (Tabela 1), com predominância de espécies do gênero Pseudomonas. Pinto et al. (2015) constataram que estas bactérias apresentam alto potencial deteriorador, associado à produção de enzimas proteolíticas termorresistentes, lecitinases e lipases, à temperaturas de refrigeração recomendadas para a conservação do leite cru. Os isolados que apresentaram maiores diâmetros de halos de proteólise foram Pseudomonas e Pseudomonas Pseudoalcaligenes (Tabela 1), seguidos pelos isolados B5.5 e C4.2; C2.4 e C4.1.

4 Tabela 1 Bactérias psicrotróficas proteolíticas contaminantes isoladas de leite cru refrigerado granelizado e proteólise em Ágar Caseinato Bactéria Isolado Diâmetro do halo Raio do halo (cm) (cm) B 5.5 1,7 1,3 Pseudomonas stutzeri C 4.2 2,2 0,8 C 1.4/2 1,3 0,5 C 2.4 2,2 0,8 C 4.1 1,8 0,7 Pseudomonas pseudoalcaligenes A 3.4/1 1,8 0,5 C 3.3 1,6 0,4 B 1.1 1,4 0,3 Pseudomonas Putida A 3.1/2 1,8 0,6 A 3.5 1,8 0,6 Aeromonas hydrophila B 4.5 2,1 0,4 A 5.2 1,4 0,3 Pseudomonas fluorescens A 3.3 1,2 0,4 4. CONCLUSÕES As altas contagens de bactérias psicrotróficas proteolíticas, fortemente proteolíticas, constatadas no leite cru refrigerado são indicativas da necessidade de investimentos contínuos em boas práticas de fabricação pela indústria de laticínios para prevenção da contaminação e multiplicação desta microbiota no leite cru e, assim, minimizar os problemas tecnológicos e econômicos. 5. AGRADECIMENTOS A equipe agradece à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Grupo PET Ciências Agrário pelo apoio financeiro. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adams, D. M.; Barach, J. T.; & Speck, M. L. (1975). Heat resistant proteases produced in milk by psychrotrophic bacteria of dairy origin. Journal of Dairy Science, v.58, p Arcuri, E. F. (2008). Contagem, isolamento e caracterização de bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru refrigerado. Ciência Rural, v.38, n.8, p Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. (2011). Instrução Normativa nº 62, de 29 de dezembro de Aprova o Regulamento Técnico de Produção, Identidade e Qualidade do Leite tipo A, o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leite Cru Refrigerado, o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leite Pasteurizado e o Regulamento Técnico da Coleta de Leite Cru Refrigerado e seu Transporte a Granel, em conformidade com os Anexos desta Instrução Normativa. Diário Oficial da União.

5 Cempírková, R.; & Mikulová, M. (2009). Incidence of psychrotrophic lipolytic bacteria in cow s raw milk. Czech Journal of Animal Science, v.54, p Chen, L.; Daniel, R. M.; & Coolbear, T. (2003). Detection and impact of protease and lipase activities in milk and milk powders. International Dairy Journal, v. 13, n. 4, p ,. Costa, L. M. (2002). Purifi cación y caracterización de proteasas de Pseudomonas fl uorescens y sus efectos sobre lãs proteínas de la leche. Arch. Latinoam. Nutr., v. 52, n. 2, p Cousin, M.A. (1982). Presence and activity of psychrotrophic micro-organisms in milk and dairy products: a review. Journal of Food Protection, v.45, p Cousin, M. A.; &E. H. Marth. "Cheddar cheese made from milk that was precultured with psychrotrophic bacteria." Journal of Dairy Science 60.7 (1977): Cousin, M. A. (1982). Presence and activity psychrotrophic micro-organisms in milk and dairy products. Journal of Food Protection, v. 45, n. 2, p Eneroth, A.; Ahrné, S.; & Molin, G. (2000). Contamination of milk with gram-negative spoilage bacteria during filling of retail containers. International Journal of Food Microbiology, v.57, p Eneroth, A.; Christiansson, A.; Brendenhaug, J.; & Molin, G. (1998). Critical contamination site in the production line of pasteurized milk, with reference to the psychrotrophic spoilage flora. International Dairy Journal, v.8, p Fairbairn, D. J.; & Law, B. A. (1986). Proteinases of psychrotrophic bacteria: their production, properties, effects and control. Journal of Dairy Research, v. 53, n. 1, p Godinho, M.; Fox, P.F. (1981). Ripening of bluechesse influence of salting rate on lipolysis and carbonyl formation. Milchwissenschaft, Munich, v.36, n.8, p Martins, M. L. (2007). Caracterização de protease e lipase de Pseudomonas fluorescens e quorum sensing em bactérias psicrotróficas isoladas de leite f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa. Viçosa - MG,. Pinto, C. L. O. (2004). Bactérias psicrotróficas proteolíticas do leite cru refrigerado granelizado destinado à produção do leite UHT p. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola). Curso de Pós-graduação em Microbiologia Agrícola, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. Pinto, C. L. O.; Martins, M. L.; & Vanetti, M. C. D. (2006). Qualidade microbiológica de leite cru refrigerado e isolamento de bactérias psicrotróficas proteolíticas. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 26, n. 3, p Sørhaug, T.; & Stepaniak, L. (1997). Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products: Quality aspects. Trends in Food Science & Technology, v. 8, n. 2, p Uraz, G. & Çitak, S. (1998). The isolation of Pseudomonas and other gram negative psychrotrophic bacteria in raw milk. Journal of Basic Microbiology, v.38, n.2, p Walstra, P.; & Jenness, R. (1984). Química y física lactológica. Zaragoza: Acribia. 423p.