PALAVRAS-CHAVE: bactérias ácido-láticas; bioconservação; filme antimicrobiano; queijo.

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1 SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS DE ORIGEM PROTEICA (BACTERIOCIN-LIKE) POR Lactobacillus curvatus P99 APLICADOS EM FILME BIODEGRADÁVEL NO CONTROLE DE Listeria monocytogenes G.D. Funck 1, J.L. Marques 2, G.S. Dannenberg 1, C.E.S. Cruxen 1, W.P. Silva 1,2, A. Fiorentini 1 1-Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós- Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) gracifunck@yahoo.com.br gui.dannenberg@gmail.com cbrcruxen@hotmail.com wladimir.padilha2011@gmail.com angefiore@gmail.com 2-Centro de Desenvolvimento Tecnológico Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) ju_marques@hotmail.com RESUMO Objetivou-se aplicar o sobrenadante livre de células (SLC) contendo bacteriocinas, produzido por Lactobacillus curvatus P99, em filmes biodegradáveis de amido e verificar a eficiência destes no controle de Listeria monocytogenes em queijo Prato fatiado. Para isto, foram elaborados filmes biodegradáveis incorporados com as concentrações inibitória (CIM) e bactericida mínima (CBM) do SLC. Os filmes foram dispostos sobre fatias de queijo Prato contaminadas com L. monocytogenes. A contagem de L. monocytogenes foi avaliada imediatamente após a inoculação no queijo e nos tempos 2, 4, 6, 8 e 10 dias de armazenamento refrigerado. A CIM do SLC foi UA.mL -1, enquanto a CBM foi de UA.mL -1. Os filmes contendo a CBM foram eficientes no controle de L. monocytogenes em queijo Prato. Filmes biodegradáveis, incorporados de SLC, podem ser aplicados como agentes antimicrobianos na bioconservação de queijo Prato. ABSTRACT The aim of this study was to apply the cell-free supernatant (CFS) cointaining bacteriocins produced by Lactobacillus curvatus P99 in biodegradable films of starch and verify their efficiency in the control of Listeria monocytogenes in sliced Prato cheese. Biodegradable films were prepared with cell-free supernatant in its minimum inhibitory (MIC) and bactericidal (MBC) concentrations. The antimicrobial films were place on top of contaminated slices of cheese. The count of L. monocytogenes Scott A was performed immediately after inoculation in the cheese at 2, 4, 6, 8 and 10 days of refrigerated storage. The lowest concentration of CFS required to promote bacteriostatic effect (MIC) against L. monocytogenes was 6,400 AU/mL, while the bactericidal action (MBC) was 1,600 AU/mL. Films containing MBC were effective in controlling of L. monocytogenes in slices of Prato cheese. Thus, the CFS from L. curvatus P99 can be considered an alternative for the biopreservation of food. PALAVRAS-CHAVE: bactérias ácido-láticas; bioconservação; filme antimicrobiano; queijo. KEYWORDS: lactic acid bacteria: biopreservation; antimicrobial film; cheese.

2 1. INTRODUÇÃO Nos diferentes tipos de alimentos podem ser encontrados micro-organismos que interferem na sua vida útil e que podem também, transmitir doenças aos consumidores. Para garantir a segurança dos alimentos, a indústria aplica processos tecnológicos, como refrigeração, pasteurização e conservadores sintéticos. No entanto, há uma crescente demanda dos consumidores por alimentos livres de aditivos ou que utilizem conservadores naturais (Ahmadova et al., 2013, Marques et al., 2015). A bioconservação é uma técnica que utiliza culturas bioconservadoras e/ou seus metabólitos, com o intuito de estender a vida útil e aumentar a segurança dos alimentos. Esta técnica pode ser considerada uma medida de segurança adicional aos produtos minimamente processados, que dependem apenas de refrigeração como meio de conservação (De Martinis et al., 2002). Um produto pronto para o consumo, como o queijo Prato fatiado, pode ser contaminado após o processamento, durante a etapa de fatiamento. Entre os micro-organismos patogênicos de origem alimentar, destaca-se L. monocytogenes, que tem sido isolados de queijo Prato (Barancelli et al., 2011)e caracteriza-se como um micro-organismo Gram-positivo, anaeróbio facultativo, não formador de esporos, tem alta tolerância ao sal e capacidade de se proliferar em produtos alimentícios refrigerados, o que é particularmente preocupante em produtos prontos para o consumo (Allerberger e Wagner, 2010, Cole et al., 1990, Cosentino et al., 2012). Visando reduzir o problema da contaminação de alimentos prontos para o consumo, bacteriocinas têm sido incluídas em polímeros para produção de embalagens ativas (Deegan et al., 2006, Marcos et al., 2010, Massani et al., 2014a). As bacteriocinas são peptídeos ou proteínas antimicrobianas sintetizadas nos ribossomos das células bacterianas e liberadas no meio extracelular, que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre diversos micro-organismos (Jack et al., 1995). A utilização de bacteriocinas purificadas na matriz alimentícia pode acarretar na redução da atividade antimicrobiana, perdendo sua eficiência, à medida que possa sofrer degradação enzimática ou ainda interagir com outras proteínas e lipídeos. A utilização do sobrenadante livre de células contendo bacteriocinas (SLC) é uma alternativa, já que outros metabólitos biologicamente ativos podem estar presentes e causar efeitos sinérgicos (Hartmann et al., 2011). A incorporação de SLC em filmes biodegradáveis de amido pode contribuir significativamente para a indústria de alimentos, já que além de auxiliar na separação das fatias, quando utilizado em produtos prontos para consumo, contribuem eliminando possíveis contaminações superficiais por patógenos. No presente trabalho, objetivou-se aplicar o SLC produzido por Lactobacillus curvatus P99 em filmes biodegradáveis de amido e verificar a eficiência destes no controle de L. monocytogenes em queijo Prato fatiado. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Micro-organismo e obtenção do SLC Foi objeto deste estudo um isolado de BAL bacteriocinogênico, denominado L. curvatus P99 proveniente de presunto cozido fatiado. A confirmação do potencial bacteriocinogênico se deu através

3 da sensibilidade da substância produzida frente a tripsina e a presença e expressão dos genes que codificam para a produção de, sakacina X, T- e T-β. Pertence a coleção de culturas bacterianas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos - Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) e encontrava-se armazenado a - 80 C em caldo De Man, Rogosa e Sharpe MRS (Kasvi ) adicionado de 20 % de glicerol. O SLC foi produzido a partir da semeadura de 1% de inóculo do isolado de L. curvatus P99 em caldo MRS e incubação a 30 C por 18 h sob agitação constante a 100 oscilações/minuto. Após este período, o caldo foi centrifugado, o sobrenadante coletado, neutralizado, submetido a tratamento térmico a 80 C por 10 minutos e filtrado em membrana de 0,22 µm. 2.2 Quantificação da atividade antimicrobiana: concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) A determinação da CIM foi realizada pela técnica de microdiluição (CLSI, 2012). O SLC do isolado P99 foi diluído em caldo BHI (Acumedia ) obtendo concentrações de 50 a 0,1 %. Em seguida, L. monocytogenes Scott A foi adicionada ao caldo, obtendo a concentração final de 10 4 UFC.mL -1 em cada poço. As placas de microtitulação foram incubadas a 37 C por 24 h, e a leitura realizada em espectrofotômetro de placas (Robonik Readwel plate) a 625 nm, considerando a maior diluição onde não houve multiplicação celular (Ojeda-sana et al., 2013). A CBM foi determinada a partir da transferência de alíquotas de 10 µl, de cada poço, onde houve inibição no teste de CIM para ágar Oxford (Himedia ). A CBM foi considerada como a menor concentração onde não houve multiplicação microbiana neste novo meio de cultura. Cada um dos testes foi realizado em triplicata. 2.3 Elaboração dos filmes antimicrobianos contendo SLC Os filmes foram elaborados a partir da técnica casting, de acordo com Soares (1998). As soluções filmogênicas (SF) foram compostas por 3 g de amido.100 g -1 de água destilada, 0,3 g de glicerol.g -1 de amido seco, 100 µl de Tween 20 e duas concentrações de SLC do isolado P99 (CIM e CBM). Um filme sem a adição de SLC foi utilizado como controle negativo. O amido, o glicerol e o Tween 20 foram suspensos em água e aquecidos em banho-maria a 85 ºC por 10 min. A seguir, a SF foi resfriada a 60 ºC e o SLC do isolado P99 incorporado, seguida de homogeneização manual. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de Petri acrílicas de 9 cm de diâmetro e mantidas em estufa com circulação de ar a 35 ºC por 24h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em umidade relativa de 75 ± 5 % por 24 h para posteriores análises. Foram preparadas duas repetições de cada tratamento.

4 2.4 Aplicação dos filmes biodegradáveis contendo antimicrobianos (bacteriocin-like) em queijo Prato fatiado Foi pesado e esterilizado 1g de queijo Prato, em cabine de segurança biológica classe II sob exposição a luz ultravioleta (UV) por 15 minutos para cada um dos lados. A seguir, a superfície das fatias de queijo foi contaminada com 10µL de uma suspensão celular de L. monocytogenes Scott A (5 x 10 4 UFC.g -1 ). A suspensão celular foi preparada a partir de diluições seriadas do cultivo ajustado na escala 0,5 de McFarland. Então, os filmes antimicrobianos foram sobrepostos nas fatias contaminadas. Os tratamentos dos filmes consistiram em: (1) filme contendo SLC com a CIM; (2) filme contendo SLC com a CBM; (3) filme sem adição de SLC (controle). As amostras foram colocadas em placas de petri estéreis e armazenadas a temperatura de 4 ºC durante 10 dias. A contagem de L. monocytogenes Scott A foi avaliada imediatamente após a inoculação no queijo e nos tempos 2, 4, 6, 8 e 10 dias de armazenamento em refrigeração. Foram realizadas diluições decimais seriadas a partir de 1g da amostra, e estas foram inoculadas em ágar Oxford em duplicata. As placas foram incubadas a 30 ºC por 48 h e os resultados expressos em log UFC.g RESULTADOS E DISCUSSÃO A menor concentração do SLC do isolado P99 necessária para promover efeito bacteriostático (CIM) sobre L. monocytogenes Scott A foi de UA.mL -1 (15,6 µl.ml -1 ), enquanto a ação bactericida (CBM) contra o mesmo micro-organismo, foi de UA.mL -1 (62,5 µl.ml -1 ). Anacarso et al. (2011) avaliaram a CIM do SLC produzido por E. casseliflavus IM 416K1, contendo enterocina 416K1 e, observaram que, esta foi de UA.mL -1 (39 µl.ml -1 ). Pode-se perceber que o SLC produzido pela linhagem E. casseliflavis IM 416K1, teve uma atividade antimicrobiana inferior a atividade antimicrobiana no SLC, produzido pelo isolado P99, em estudo. Foi observado que a multiplicação celular de L. monocytogenes Scott A variou em função da concentração do SLC utilizado nos filmes. Os resultados demostraram que os filmes contendo a CBM do SLC foram capazes de reduzir a contagem do patógeno em fatias de queijo Prato. Durante os dez dias de armazenamento refrigerado, a enumeração do micro-organismo permaneceu abaixo do limite de detecção da técnica (2,7 log UFC.g -1 ). Nos filmes controle (sem SLC), pode-se perceber um comportamento típico da multiplicação de L. monocytogenes uma vez que este patógeno é capaz de se desenvolver a temperatura de refrigeração (4 C), atingindo contagens superiores a 4,3 log UFC.g -1 em 10 dias de armazenamento. A CIM do SLC não demonstrou ser eficiente no controle do patógeno, já que não apresentou diferença estatística (p 0,05) quando comparado ao controle conforme mostra a Figura 1. Figura 1 - Contagem de Listeria monocytogenes Scott A em queijo Prato fatiado adicionado de filme biodegradável incorporado com sobrenadante livre de células contendo substâncias antimicrobianas (bacteriocin-like) produzidas por Lactobacillus curvatus P99 na concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) durante dez dias de armazenamento a 4 ºC.

5 Contagem de células viáveis (log UFC.mL -1 ) Inóculo Tempo (Dias) Controle CIM CBM No ensaio in situ, as contagens de L. monocytogenes Scott A, nas fatias de queijo, foram reduzidas abaixo do limite de detecção da técnica na presença dos filmes com a CBM do SLC de L. curvatus P99 e, o filme com a CIM do SLC não diferiu significativamente (p 0,05) do controle. Este resultado corrobora com o encontrado por Marcos et al. (2007) ao avaliarem a utilização de filmes biodegradáveis de alginato, zeína e álcool polivinil contendo enterocinas em diferentes concentrações no controle de L. monocytogenes em fatias de presunto cozido. A maior concentração de enterocina utilizada pelos autores apresentou resultado mais eficiente. Produtos prontos para o consumo é um desafio para a seguridade alimentar, uma vez que, devido a manipulação pós-processamento e o contato com superfícies, utensílios e equipamentos contaminados, é possível a incidência de patógenos alimentares. Queijos fatiados tem vida útil de aproximadamente 7 dias, após este período ele pode vir a se tornar inaceitável para o consumo. A utilização de filmes antimicrobianos pode ajudar, não só no controle de micro-organismos patogênicos, como também a aumentar a vida útil destes alimentos pelo controle de micro-organismos deteriorantes, como já foi demonstrado no estudo realizado por Massani et al. (2014b). Os resultados apresentados neste estudo confirmam o potencial antimicrobiano do filme adicionado da CBM de SLC contendo substâncias (bacteriocin-like) produzidas por L. curvatus P99 no controle de L. monocytogenes em queijo, aumentando assim a qualidade e segurança em alimentos prontos para o consumo. 4. CONCLUSÃO Filmes biodegradáveis, incorporados de SLC contendo substâncias antimicrobianas, podem ser aplicados como agentes antimicrobianos na bioconservação de queijo Prato, quando armazenado em refrigeração.

6 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ahmadova, A., Todorov, S. D., Hadji-Sfaxi, I., Choiset, Y., Rabesona, H., Messaoudi, S., Kuliyev, A., Franco, B. D. G. M., Chobert, J., & Haertlé, T. (2013). Antimicrobial and antifungal activities of Lactobacillus curvatus strain isolated from homemade Azerbaijani cheese. Anaerobe, 20, Allerberger, F., & Wagner, M. (2010). Listeriosis: a resurgent foodborne infection. Clin Microbiol Infect 16, Anacarso, I., Niederhäusen, S., Iseppi, R., Sabia, C., & Bondi, M. (2011). Anti-listerial activity of chitosan and Enterocin 416K1 in artificially contaminated RTE products. Food Control, 22(12), Barancelli, G. V., Camargo, T. M., Reis, C. M. F., Porto, E., Hofer, E., & Oliveira, C. A. F. (2011). Incidence of Listeria monocytogenes in cheese manufacturing plants from the Northeast region of São Paulo, Brazil. Journal of Food Protection, 74, CLSI, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically ; Approved Standard Ninth Edition. Cole, M.B., Jones, M. V, & Holyoak, C. (1990). The effect of ph, salt concentration and temperature on the survival and growth of Listeria monocytogenes. Journal of Applied Bacteriology, 69, Cosentino, S., Fadda, M. E., Deplano, M., Melis, R., Pomata, R., & Pisano, M. B. (2012). Antilisterial Activity of nisin-like bacteriocin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis isolated from traditional Sardinian dairy products. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, 1 8. De Martinis, E. C. P., & Freitas, F. Z. (2002). Screening of lactic acid bacteria from Brazilian meats for bacteriocin formation. Food Control, 14, Deegan, L. H., Cotter, P. D., Hill, C., & Ross, P. (2006). Bacteriocins: Biological tools for biopreservation and shelf-life extension. International Dairy Journal, 16, Hartmann, H. A., Wilke, T., & Erdmann, R. (2011). Efficacy of bacteriocin-containing cell-free culture supernatants from lactic acid bacteria to control Listeria monocytogenes in food. International Journal of Food Microbiology, 146, Jack, R. W., Tagg, J. R., & Ray, B. (1995). Bacteriocins of gram-positive bacteria. Microbiological Reviews, 59(2), Marcos, B., Aymerich, T., Monfort, J. M., & Garriga, M. (2010). Physical performance of biodegradable films intended for antimicrobial food packaging. Journal of Food Science, 75, Marques, J. L., Volcão, L. M., Funck, G. D, Kroning, I. S., Silva, W. P., Fiorentini, A. M., Ribeiro, G. A. (2015). Antimicrobial activity of essential oils of Origanum vulgare L. and Origanum majorana L. against Staphylococcus aureus isolated from poultry meat. Industrial Crops and Products, 77, Massani, M. B., Botana, A., Eisenberg, P., & Vignolo, G. (2014). Development of an active wheat gluten film with Lactobacillus curvatus CRL705 bacteriocins and a study of its antimicrobial performance during ageing. Food Additives & Contaminants, 31, Massani, M. B., Molina, V, Sanchez, M., Renaud, V., Eisenberg, P., & Vignolo, G. (2014). Active polymers containing Lactobacillus curvatus CRL705 bacteriocins: effectiveness assessment in Wieners. International Journal of Food Microbiology, 178, Ojeda-sana, A. M., Baren, C. M. Van, Elechosa, M. A., Juárez, M. A., & Moreno, S. (2013). New insights into antibacterial and antioxidant activities of rosemary essential oils and their main components. Food Control, 31, Soares, N. F. F. (1998). Bitterness reduction in citrus juice through nariginase immobilized into polymer film (PhD Dissertation). Cornell University, New York.