V. S. Gehring 1, C.L. de Quadros 1, A. Alía 2, I. Martin 2, J. J. Córdoba 2 L.R. dos Santos 1,3

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1 SCREENING DE EFEITO ANTI-LISTERIA DE ÓLEOS ESSENCIAIS E AVALIAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE CANELA (Cinnamomum cássia) SOBRE Listeria monocytogenes EM MATRIZ CÁRNEA V. S. Gehring 1, C.L. de Quadros 1, A. Alía 2, I. Martin 2, J. J. Córdoba 2 L.R. dos Santos 1,3 1- Mestrado em Bioexperimentação Universidade de Passo Fundo, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária CEP: Passo Fundo RS Brasil, Telefone: (54) Fax: e- mails: (svandreice@yahoo.com.br), (carolinelq@hotmail.com). 2- Pesquisadores - Higiene y Seguridad Alimentaria, Instituto Universitario de Investigación de Carne y Productos Cárnicos (IProCar), Universidad de Extremadura, Facultad de Veterinaria CEP: Cáceres, Extremadura Espanha, Telefone: s: (albertoam@unex.es), (irmartint@gmail.com), (jcordoba@unex.es). 3- Pós Doutoranda CAPES - Programa Estágio Sênior no Exterior, Processo / luruschel@upf.br. RESUMO Avaliou-se a atividade anti Listeria monocytogenes de óleos essenciais (OES) de cravo, canela, gengibre, orégano e tomilho visando o controle de L. monocytogenes em produtos cárneos processados. Inicialmente realizou-se uma triagem dos OES em Agar Difusão e, a partir da verificação da ação inibitória sobre L. monocytogenes, testou-se os OES em condições que simulam as de um derivado cárneo maturado, utilizando-se Agar adicionado de presunto curado liofilizado (PCL), incubados a 7º C por 7 dias. Nos ensaios de Agar Difusão apenas o óleo essencial de canela demonstrou ação sobre L. monocytogenes, sendo então selecionado para os ensaios em PCL, no qual evidenciou redução decrescente da multiplicação de L. monocytogenes conforme a concentração empregada (10, 5, 3 e 2%, respectivamente). O óleo essencial de canela demonstra potencial para ser utilizado como antimicrobiano natural em produtos cárneos processados prontos para consumo. ABSTRACT Was evaluated the anti Listeria monocytogenes activity of essential oils of cloves, cinnamon, ginger, oregano and thyme aiming at the control of L. monocytogenes in processed meat products. Initially there was a screening of the essential oils in Agar diffusion and, after the verification of the inhibitory action on L. monocytogenes the essential oils were tested in conditions that simulate those of a meat matured, using added Agar of lyophilized cured ham (LCH), incubated at 7 ºC for seven days. In the testing of Agar diffusion, just cinnamon essential oil demonstrated action on L. monocytogenes and was selected for the tests in the LCH medium, in which showed declining decrease in the multiplication of L. monocytogenes according on the concentration employed (10, 5, 3 and 2%, respectively). The cinnamon essential oil shows potential to be used as a natural antimicrobial in processed meat products ready for consumption. PALAVRAS-CHAVE: Óleos essenciais; Listeria monocytogenes; canela. KEYWORDS: Essential oils; Listeria monocytogenes; cinnamon.

2 1. INTRODUÇÃO O processamento tecnológico é uma das formas mais tradicionais de conservação de carnes, um produto altamente perecível, obtendo-se produtos industrializados classificados de modo geral como frescais, secos, curados, cozidos e conservas, segundo a Instrução Normativa n.º 22 (Brasil, 2000), que aprova os Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade de produtos como copa, presuntos e salames, dentre outros, dos quais destacam-se os chamados ready-to-eat ou prontos para consumo. Estes produtos podem ser fonte de Listeria monocytogenes, um importante patógeno alimentar que pode contaminar produtos não cozidos, pós cocção ou pós procedimentos como retirada dos envoltórios, bem como equipamentos como cortadoras, fatiadoras e embalagem. O FDA/USA classifica os produtos quanto ao risco de transmitir Listeria sp. em: muito alto (presunto, mortadela, fatiados, salsichas); alto risco (produtos lácteos, patês, queijos frescos, peixe defumado, leite); risco moderado (frutos do mar, saladas de carnes, salsichas secas, frutas); baixo risco (peixes em salmoura) e muito baixo (lácteos fermentados, queijos duros e processados, sorvetes e outros produtos lácteos congelados). Assim, produtos cárneos processados podem ser enquadrados em alto risco, aliado ao fato de não necessitarem cozimento previamente ao consumo. Originalmente utilizadas para alterar ou melhorar o sabor dos alimentos, as ervas e especiarias possuem metabólitos secundários, como os óleos essenciais, que desempenham papel protetor de plantas contra agentes infecciosos como bactérias (Bakkali et al., 2008), sendo consideradas importantes substâncias bioativas (Shao et al., 2011). A maior parte da atividade antimicrobiana dos OES parece estar associada aos compostos fenólicos (Simões e Spitzer, 2000) e seu efeito antimicrobiano relacionado principalmente à alteração da permeabilidade e integridade da membrana celular bacteriana (Lambert et al., 2001). Assim, neste trabalho, avaliou-se o potencial anti L. monocytogenes de óleos essenciais comercias de cravo, canela, gengibre, orégano e tomilho em Agar Difusão e Agar adicionado de presunto curado liofilizado visando aplicação no controle de L. monocytogenes em produtos cárneos processados. 2. MATERIAL E MÉTODOS Avaliação dos óleos essenciais em Agar difusão Realizou-se ensaios em Agar difusão (CLSI, 2012) para avaliação e seleção de OES comercias (cravo, canela, gengibre, orégano e tomilho, Oshadhi, Alemanha) frente a L. monocytogenes dos sorotipos 4b, ½a, ½b, ½c, selecionando-se o sorotipo 4b para os demais ensaios. As amostras eram provenientes do Instituto Universitario de Investigación de Carne y Productos Cárnicos (IProCar, Espanha), isoladas de produtos cárneos e identificadas por PCR, liofilizadas, adicionadas de glicerol e mantidas a -80ºC. Os OES foram diluídos em azeite de oliva nas proporções de 2, 3, 5 e 10% e testados sobre discos de papel de 10 mm. Para os ensaios de Agar difusão distribuiu-se 100 µl de L. monocytogenes 10-7 ufc/ml sobre as placas de Agar que, após a inoculação dos OES foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Selecionou-se para os ensaios em meio de cultura com matriz cárnea apenas os OES que evidenciaram formação de halo, independentemente do tamanho destes, que variaram entre 5 e 25 mm de diâmetro. Nas condições testadas, apenas o óleo essencial de canela (Cinnamomum cassia) apresentou inibição de L. monocytogenes, sendo então selecionado para os ensaios em Agar adicionado de presunto curado liofilizado PCL (Rodríguez et al., 2014). Para produzir este meio de cultivo utiliza-se 30 gramas de PCL, 20 gramas de Agar base, 120 ou 150 ml de glicerol (Aa 0.95 ou Aa 0.93) e H 20 suficiente para produzir 1000 ml.

3 Avaliação de óleo essencial de canela com ação anti-listeria em PCL As avaliações do óleo essencial de canela foram realizadas em meio PCL adicionado de 12 ou 15% de glicerol para obter Aa de 0.95 ou 0.93, respectivamente (Rodríguez et al., 2014), incubados a 7ºC graus por 7 dias, simulando as condições de temperatura utilizada nas fases iniciais de estabilização ou armazenamento de derivados curado-maturados. Foram aplicados 100 μl do óleo essencial de canela sobre o meio PCL, em triplicata e, após 10 minutos, inoculou-se 100 ul de L. monocytogenes 4b 10 4 ufc/ml. Para o controle de L. monocytogenes retirava-se o Agar com estilete, colocava-se em bolsa estéril com filtro, acrescentava-se 30 ml de APT 1% e levava-se a stomacher a 300 rpm por 2 minutos. Deste conteúdo semeava-se 200 µl por espalhamento em Agar ALOA, incubando-se por 24/48 horas a 37º C e realizando-se contagem da bactéria. Para avaliação da ação anti-listeria do óleo essencial de canela realizou-se procedimento semelhante ao controle de L. monocytogenes, mas após 7 dias de incubação a 7º C, procedendo-se diluições em APT 1% de 10 1 até 10 4 a partir do PCL com Aa 0.95 e de 10 1 até 10 2 a partir do PCL com Aa 0.93, semeando-se 100 µl em triplicata em ALOA, incubando-se a 37ºC por 24/48 horas e procedendo-se as contagens da bactéria. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) do óleo essencial de canela (adaptado de Santurio et al., 2011) Para determinação da CIM e CBM o óleo essencial de canela foi diluído em azeite de oliva até a concentração de 779 mg ml -1 (solução I). A seguir, foi diluído na proporção de 1:100 em Caldo BHI, obtendo-se a concentração de 7790μg ml -1 (solução II). Volumes de 100μL de caldo BHI foram distribuídos nos poços de placa de microtitulação e, em seguida, 100μL da solução II foram acrescidos ao primeiro poço e, após homogeneização, transferiu-se 100μL para o segundo poço e assim sucessivamente, obtendo-se concentrações finais de 3895, 1947, 973, 486, 243 e 121μg ml -1. Uma cultura overnight de L. monocytogenes foi diluída até 10-6 ufc/ml e, desta suspensão, inoculou-se 10μL (1x10 5 ufc/ml -1 ) em cada poço já contendo o óleo essencial de canela. Os ensaios foram realizados em triplicata, utilizando-se L. monocytogenes como controle positivo e caldo BHI como controle negativo. As microplacas foram incubadas por 24h a 37ºC e a CIM consistiu na menor concentração capaz de causar inibição total do crescimento bacteriano, realizando-se leitura visual e por densidade óptica a 630 nm (DOD630). Para determinação da CBM, definida como a menor concentração capaz de causar morte do inoculo, a partir dos poços onde não havia crescimento bacteriano visível após 24 horas de incubação, transferiu-se uma alíquota de 10 μl para a superfície de ALOA e, após 24/48 horas de incubação a 37 C, registrava-se a menor concentração nas quais não se evidenciava crescimento bacteriano. Estes ensaios também foram realizados em triplicata. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os OES comercias de cravo, gengibre, orégano e tomilho não mostraram ação sobre L. monocytogenes nos ensaios em Agar Difusão. Já o óleo essencial de canela mostrou halos de inibição de até 25 mm, sendo então selecionado para os ensaios em Agar adicionado de presunto curado liofilizado, demonstrando redução na multiplicação de L. monocytogenes conforme a concentração empregada (Figura 1). Estes resultados são promissores ao mostrar o efeito redutor do óleo essencial de canela sobre L. monocytogenes utilizando-se um modelo de matriz cárnea, ou seja, Agar adicionado de presunto curado liofilizado, e condições que simulam tempo e temperatura de alimentos prontos para consumo, a exemplo dos produtos cárneos processados.

4 Figura 1. Ação de óleo essencial de canela sobre a multiplicação de L. monocytogenes em Agar adicionado de presunto curado liofilizado após incubação a 7ºC durante 7 dias. 6,00 5,26 4,00 2,00 0,00 0,10 2,76 3,15 3,15 Log ufc/ml Em concordância com este estudo, Rogiers et al. (2017) citam o óleo essencial de canela como potencial antimicrobiano natural visando aplicação em alimentos e o trans cinamaldeído como componente majoritário deste óleo essencial. O cinamaldeído possui diferentes formas de ação sobre os microrganismos, interferindo na dupla camada fosfolipídica da membrana citoplasmática, levando ao aumento da permeabilidade e perda dos constituintes celulares e por alteração de uma variedade de sistemas enzimáticos, como os envolvidos na produção de energia celular e síntese de componentes estruturais (Gonçalves et al., 2016). Ghabraie et al. (2016) mostraram que a utilização de concentrações entre % e 0.05 % de OES, em combinação com baixas concentrações de nitrito (100 ppm), sais orgânicos (1.55 %) e nisina (12.5 ppm) reduziram respectivamente 1.5 ou 2.6 log UFC/g de L. monocytogenes em embutidos após 7 dias de estocagem em comparação com a amostra controle. A avaliação sensorial de salsichas cozidas de suínos e bovinos demonstrou que as formulações adicionadas destes antimicrobianos foram organolepticamente aceitáveis. No presente trabalho os resultados da CIM e CBM mostraram inibição de L. monocytogenes com até 486 μg ml -1. Mith et al. (2014), ao testar 15 OES com potencial de uso para conservação de alimentos frente a L. monocytogenes, Salmonella Typhimurium e Escherichia coli O157: H7 mostraram ação inibitória dos OES de canela, orégano e cravo, com CIM µl/ml e CBM 0.25 µl/ml, indicando estes compostos como uma importante alternativa para prevenção da multiplicação destes microrganismos em alimentos. 4. CONCLUSÕES O óleo essencial comercial de canela avaliado mostrou potencial com concentrações tão baixas quanto 2% para utilização como antimicrobiano natural para controle de L. monocytogenes em produtos cárneos processados.

5 5. AGRADECIMENTOS A CAPES, pela concessão de Bolsa no Programa Estágio Sênior no Exterior, Processo / , para Luciana Ruschel dos Santos. Ao financiamento pelo Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Agroalimentaria (INIA) e pela Junta de Extremadura através dos projetos RTA C03-03 e IB1649 y FEDER GR15108 (Espanha). Alberto Alía é beneficiário de uma bolsa de doutorado financiada pela Junta de Extremadura (PD16023) e Irene Martín de uma bolsa de doutorado FPU ( ). 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bakkali, F., Averbeck, S. Averbeck, D. Idaomar, M. (2008). Biological effects of essential oils - A review. Food Chemistry and Toxicology, 46, Brasil, Ministério da Agricultura e do Abastecimento. (2000). Aprova os Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade de Salame (Instrução Normativa nº 22, de 31 de julho de 2000). Diário Oficial da República Federativa do Brasil. CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved Standard-Ninth Edition, M07-A9, vol. 32, n. 2. Disponível em Ghabraie, M., Vu, K.D., Huq, T., Khan, A., Lacroix, M. (2016). Antilisterial effects of antibacterial formulations containing essential oils, nisin, nitrite and organic acid salts in a sausage model. Journal of Food Science and Technology, 53 (6), Gonçalves, M. C., Pagnossa, J. P., Sousa, T. R., Picolli, R.H. (2016). Determinação da concentração mínima bactericida de cinamaldeído sobre Escherichia coli enteropatogênica e enterotoxigênica. In I Congresso Brasileiro de Microbiologia Agropecuária, Agrícola e Ambiental (CBMAAA), Jaboticabal, Brasil. Lambert, R. J. W., Skandamis, P. N., Coote, P. J., Nychas, G. J. E. (2001). A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, 91, Disponível em: /j x/abstract Mith, H., Dure, R. Delcenserie, V., Zhiri, A., Daube1, G., Clinquart, A. (2014). Antimicrobial activities of commercial essential oils and their components against food-borne pathogens and food spoilage bacteria. Food Science & Nutrition, 2(4), Rodríguez, A., Medina, Á., Córdoba, J.J., Magan, N. (2014). The influence of salt (NaCl) on ochratoxin A biosynthetic genes, growth and ochratoxin A production by three strains of Penicillium nordicum on a dry-cured ham-based medium. International Journal of Food Microbiology, 178, Rogiers, G., Biniam, T., Kebede, A., Van Loey, C., Michiel, W. (2017). Membrane fatty acid composition as a determinant of Listeria monocytogenes sensitivity to trans-cinnamaldehyde. Research in Microbiology, 168 (6), Santurio, D. F., Costa, M. M., Maboni, G. Cavalheiro, C., Pasqualin, S., Dal Pozzo, M. F., Alves, M., Hartz, S., Fries, L. L. M. (2011). Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de condimentos frente a amostras de Escherichia coli isoladas de aves e bovinos. Ciência Rural, 41(6), Shao, S., Zhou, T., Tsao, R. (2011). Antimicrobials from plants - food preservation and shelf-life (Second Edition). Waterloo, Canada. Simões, C.M.O.; Spitzer, V. Óleos voláteis. (2000). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS/UFSC.