ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO E EM PATÊ DE FRANGO DE ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO NANOEMULSIONADO

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1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO E EM PATÊ DE FRANGO DE ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO NANOEMULSIONADO M. Moraes-Lovison, M. Ghiraldi, F.Y. Kojima, S.C. Pinho Departamento de Engenharia de Alimentos Universidade de São Paulo, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos CEP: Pirassununga SP Brasil, Telefone: 55 (19) (barimoraes@yahoo.com.br) RESUMO O óleo essencial de orégano (Origanum vulgare) apresenta um amplo espectro de atividade antimicrobiana, e por isso, pode ser considerado uma alternativa aos conservantes artificiais, como, por exemplo, o nitrito de sódio. Neste trabalho produziu-se nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano, pelo método da temperatura de inversão de fases (PIT), e avaliou-se seu potencial antibacteriano. Os resultados mostraram que as nanoemulsões permaneceram estáveis durante 90 dias de armazenamento, em relação ao tamanho médio de gota e ao baixo índice de polidispesidade, bem como apresentaram elevado potencial antibacteriano para S. aureus e E. coli, tanto in vitro quanto no patê de frango. ABSTRACT The essential oil of oregano (Origanum vulgare) has a broad antimicrobial activity spectrum, and therefore can be considered an alternative to artificial preservatives such as sodium nitrite. This work was produced nanoemulsions encapsulating the essential oil of oregano, the method of phase inversion temperature (PIT), and evaluated their antibacterial potential. The results showed that the nanoemulsions stable during 90 days of storage compared to the average droplet size and a low index polidispesidade and showed high antibacterial potential for S. aureus and E. coli, both in vitro and in chicken pâté. PALAVRAS-CHAVE: óleo essencial de orégano; nanoemulsificação ; atividade antibacteriana. KEYWORDS: oregano essential oil, nanoemulsification, antibacterial activity 1. INTRODUÇÃO O óleo essencial de orégano possui como principais compostos ativos o carvacrol, o timol, e o γ-terpineno, que conferem um amplo espectro de atividade antimicrobiana (Lambert et al., 2001). O crescente interesse do mercado consumidor por produtos contendo menos aditivos artificiais tem impulsionado a busca e pesquisa de produtos e extratos vegetais com propriedades antimicrobianas (Del Campo et al., 2003) e dentre as diferentes estratégias que podem ser aplicadas para controlar a contaminação de alimentos por microrganismos patogênicos, a utilização de óleos essenciais é uma alternativa segura e eficaz aos conservantes artificais. Entretanto, a utilização de óleos essenciais puros em alimentos é frequentemente limitada devido às mudanças que estes compostos podem impor às propriedades sensoriais (Lambert et al., 2001). Desta forma, a microencapsulação destes compostos se torna uma alternativa para contornar tal problema. As nanoemulsões são sistemas emulsionados que possuem gotas com tamanho médio na faixa de 20 a 200 nm, e, devido a esta característica, são

2 sistemas translúcidos a olho nu e possuem alta estabilidade cinética, o que os pode tornar estáveis por um longo tempo de armazenagem (Solans et al., 2005; Mason et al., 2006). O crescimento microbiano em produtos cárneos reduz a vida útil desses produtos possibilitando também a veiculação de patógenos, acarretando potenciais riscos à saúde do consumidor. Em relação aos produtos cárneos derivados de frango, as aves encaminhadas para o abate normalmente são a fonte inicial de contaminação (condições higiênicas de abate e processamento) (Carvalho et al., 2005). A manipulação dos alimentos com baixo padrão higiênico-sanitário permite a multiplicação bacteriana e o desenvolvimento de bactérias patogênicas como a E. coli (indicador de contaminação microbiana de origem fecal) e o S. aureus (indicador de contaminação pós-processo ou das condições de sanitização das superfícies que entram em contato com alimentos). De acordo com Oliveira et al. (2003), estas duas bactérias são as principais responsáveis por surtos de toxinfecção alimentar quando associados às condições higiênico-sanitárias insatisfatórias dos manipuladores e utensílios. Este trabalho teve como objetivos a produção e caracterização de nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano, bem como a avaliação da atividade antimicrobiana de tais nanodispersões in vitro, e finalmente, a avaliação da atividade antimicrobiana das nanoemulsões após incorporação em produto cárneo (patê de frango). 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 MATERIAL Na produção das nanoemulsões empregou-se óleo essencial de orégano (Ferquima, Cotia, SP, Brasil), óleo de girassol (Cargill, Mairinque, SP, Brasil), Cremophor RH40 (BASF, Ludwigshafen, Alemanha), Brij30 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Para os ensaios de atividade antibacteriana utilizou-se cepas-padrão de S. aureus (ATCC 25923) e E. coli (ATCC 25922), corante cloreto iodonitrotetrazólio (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, EUA), placas esterilizadas (J. Prolab, São José dos Pinhais, PR, BR), Petrifilm Staph Express (3M Microbiology, Saint Paul, MN, EUA), placas de Petri com ágar E. coli cromogênico e cloranfenicol (Laborclin, Pinhais, PR, Brazil). A água peptonada estéril 0,1% p/v, o ágar Nutriente, o caldo nutriente e o caldo Brain Heart Infusion (BHI), foram obtidos da Acumédia (Leasing, MI, EUA). Para a produção de patê de frango utilizou-se gordura subcutânea, carne magra e fígado de frango, margarina sem sal, sal refinado, maltodextrina (MOR- REX 1920, Ingredion, Mogi-Guaçu, SP, Brasil), goma xantana (Grindsted 80, Du Pont, Cotia, SP, Brasil ), cebola desidratada e alho desidratado, BHT, nitrito de sódio e ácido lático (Synth, Diadema, SP, Brasil). 2.2 MÉTODOS Produção das nanoemulsões: Foram produzidas pelo método PIT (phase inversion temperature). Em um béquer foram adicionados os tensoativos (Cremophor RH40 9,75% e Brij 30 3,25%), o óleo essencial de orégano (3,25%), o óleo de girassol (3,25%) e água deionizada (80,5%)Em seguida, foram submetidos à agitação magnética a 1350 rpm e aquecimento até 65º C. A mistura foi então resfriada até 20º C, sob agitação magnética com velocidade de 585 rpm. As amostras foram submetidas a dois ciclos de aquecimento e resfriamento. Após a produção foram armazenadas sob refrigeração.

3 Determinação de diâmetro médio e polidispersidade: Espalhamento de luz quasi-elástico em equipamento ZetaPlus (Brookhaven Instruments Company, Holtsville, NY, EUA). O laser empregado foi de He-Ne com comprimento de onda de 627 nm e com ângulo de incidência de 90. Determinação de concentração inibitória minima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM): A CIM foi determinada por macrodiluição, na qual foram adicionados em cada tubo de ensaio 2,5 ml de caldo nutriente, 0,5 ml do inoculo de S. aureus e E. coli (aproximadamente 1-2 x 10 8 ufc/ml), separadamente, e 2 ml das concentrações de nanoemulsões diluídas em água deionizada estéril. Após esta etapa, os tubos foram agitados e incubados a 37º C por 24 horas. Então, 40 µl de uma solução de corante cloreto iodonitrotetrazólio (2 mg/ml) foram adicionados aos tubos de ensaio, e incubados a 37º C por mais 24 horas. Após este período, verificou-se a CIM pela diferença de coloração entre as concentrações. A CBM foi obtida inserindo 100 µl da mistura, contida nos tubos de ensaio com concentrações superiores a CIM, em placas de Petri com ágar nutriente e incubadas a 37º C, por 24 horas. Cinética de crescimento bacteriano: Para obter a curva de crescimento bacteriano, as misturas foram preparadas contendo 5 ml de caldo nutriente, 1 ml de uma suspensão bacteriana de S. aureus ou E. coli, em uma concentração de 7 log UFC/ml e 4 ml de nanoemulsão na CIM. No controle negativo: 4 ml de água estéril e controle positivo: 4 ml de solução cloranfenicol 1 mg/ml. Estas misturas foram agitadas durante 30 segundos e incubadas a 37 C. Após 0, 6, 12, 24, 48 e 72 horas de incubação foram realizadas a contagem das bactérias. Produção de patê de frango: Inicialmente a carne magra (40%), o fígado (10%) e a gordura (10%) foram picados em cubos pequenos e submetidos ao cozimento. Após esta etapa, foram adicionados os demais ingredientes: água fria filtrada (21%), margarina (10%), maltodextrina (5%), sal cloreto de sódio (2%), goma xantana (1%), cebola desidratada (0,8%) e alho desidratado (0,2%). Após a preparação desta base de patê, esta mistura foi homogeineizada e divida em 5 lotes: (1) patê sem aditivos (controle negativo), (2) adição de óleo de orégano puro, (3) adição de óleo de orégano nanoemulsionado, (4) adição de BHT (100 mg/kg) e nitrito de sódio (150 mg/kg). Em seguida, o patê foi submetido a tratamento térmico (80º C por 30 minutos) e posteriormente armazenado a 4º C. Quantificação de S. aureus e E. coli no patê de frango após contaminaçãobacteriana: 10 g da amostra de cada tratamento foram pesadas assepticamente, e em seguida foram adicionados 2 ml dos inóculos de S. aureus e E. coli, separadamente, em concentrações em torno de ufc/ml. Em seguida estas amostras foram armazenadas sob refrigeração, em temperatura de aproximadamente 4 C, e após um período de 0, 1, 2,3, 6 e 8 dias foram realizadas a quantificação das bactérias. Para quantificar S. aureus foram utilizadas placas Petrifilm TM Staph e para E. coli, placas de Petri com ágar E. coli cromogênico. Após a inoculação, as placas foram incubadas a 35±1 C por 24 horas e em seguida, foram realizadas as contagens nas placas e os resultados forma expressos em em log de ufc.ml -1. Análises estatísticas: Nas análises estatísticas dos resultados, utilizou-se o software estatístico SAS 9.2, o qual foi aplicado o teste de médias (Tukey) ao nível de 5% de significância. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Estabilidade das nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano A avaliação de estabilidade das nanoemulsões foi realizada durante 90 dias de armazenamento, foi realizada pelas medidas de diâmetro hidrodinâmico médio e pelos índices de polidispersidade (PDI). Os valores de diâmetro hidrodinâmico médio das nanoemulsões não variaram

4 significativamente entre o início (25,5±0,21 nm) e no fim do armazenamento (23,8±0,85 nm). Os índices de polidispersidade também não apresentaram diferença significativa durante o armazenamento, sendo que após 90 dias de estocagem o índice de polidispersidade foi de 0,043±0,004, indicando que as nanodispersões permaneceram estáveis durante este período. A estabilidade cinética das nanoemulsões foi relacionada com o tamanho reduzido de gota, que torna o sistema resistente à desestabilização física, a qual pode ocorre pela separação gravitacional, floculação e/ou coalescência (Tadros et al., 2004; Solans et al., 2005). 3.2 Determinação da atividade antimicrobiana das nanoemulsões O potencial antimicrobiano das nanoemulsões foi avaliado pela determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) e das concentrações bactericidas mínimas (CBM). Conforme a Tabela 1, a CBM foi significativamente maior do que a CIM para ambas as bactérias, indicando que são necessárias concentrações significativamente maiores de óleo essencial de orégano nanoemulsionado para eliminar a bactéria do que para inibir o seu crescimento. Também foi possível observar que não houve diferença significativa entre as CIM e CBM, para S. aureus e E. coli, indicando que a capacidade inibitória, assim como a capacidade bactericida foram semelhantes para ambas as bactérias. Durante o armazenamento das nanoemulsões, as CIM e CBM não apresentaram variação, e com isso, pode-se considerar que o potencial antibacteriano in vitro das nanoemulsões não foi alterado durante o período de 90 dias de estocagem. Tabela 1. Valores de concentração inibitória minima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM), em mg de oleo essencial de oregano nanoencapsulado/ml, para S.aureus e E. coli. Bactéria Dia 0 Dia 30 Dia 60 Dia 90 CIM S. aureus 1,30±0,00 C 1,95±0,65 C 1,51±0,37 C 1,08±0,37 C CBM S. aureus 3,67±0,37 A 3,24±0,00 A,B 3,67±0,37 A 3,46±0,37 A CIM E. coli 1,73±0,37 C 1,73±0,37 C 2,16±0,37 B, C 1,30±0,00 C CBM E. coli 3,46±0,37 A 3,67±0,37 A 3,89±0,65 A 3,67±0,37 A Médias seguidas com a mesma letra não se diferenciam ao nível de significância de 5%, pelo teste de Tukey. 3.3 Cinética de crescimento bacteriano A cinética de crescimento bacteriano foi realizada para verificar o comportamento do crescimento das bactérias na presença das nanoemulsões durante um período de 72 horas. A Figura 2 mostra que para E. coli houve uma redução de 3 ciclos log após 6 horas de análise, porém, após 24 horas, houve um amento de 1 ciclo log e no final do período de incubação (72 oras), a redução foi de 2 ciclos log em relação a contaminação no tempo 0 horas. Para S. aureus, após 6 horas de incubação, houve uma redução de 3 ciclos log do crescimento da bactéria, que manteve-se constante até 72 horas. Com isso, foi possível observar que, nas CIM, a nanoemulsão foi mais eficiente na redução de crescimento para S. aureus do que para a E. coli na análise in vitro.

5 (A) (B) Figura 1. Cinética de crescimento para E. coli (A) e S. aureus (B): ( ) controle negativo ( ) nanoemulsão (CIM: 1,30 mg de oleo essencial de orégano nanoemulsionado/ml para S. aureus e 1,73 mg de oleo essencial de orégano nanoemulsionado/ml para E. coli), ( ) controle positivo (antibiótico cloranfenicol: 1 mg/ml). 3.4 Avaliação do potencial antibacteriano no patê de frango após contaminação por E. coli e S. aureus A contaminação das amostras com as bactérias E.coli e S. aureus foi realizada para simular a contaminação do patê após aberto, visto que após abrir a embalagem, a vida de prateleira deste produto é muito curta, de aproximadamente até 4 dias. Para E. coli (Figura 3), o tratamento contendo as nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano (tratamento 3), apresentou uma redução significativamente maior do que os demais tratamentos, inclusive o tratamento com o nitrito de sódio, o qual é comumente empregado na indústria de alimentos como conservante de produtos cárneos. Em relação a S. aureus, os tratamentos com as nanoemulsões e com o nitrito (tratamentos 3 e 4, respectivamente), foram mais eficientes na redução de crescimento bacteriano do que os demais tratamentos, e além disso, não apresentaram diferença significativa entre si. Com isso, foi possível observar que as nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano apresentaram boa eficiência de inibição de crescimento das bactérias quando aplicado no patê de frango. (A) (B) Figura 2. Curva de inibição de crescimento da bactéria E. coli (A) e S. aureus (B) durante o período de 8 dias após a contaminação inicial das amostras de patê de frango: ( ) tratamento1; ( ) tratamento 2; ( ) tratamento 3 e ( ) tratamento 4.

6 4. CONCLUSÕES As nanoemulsões, produzidas pelo método PIT apresentaram estabilidade cinética por 90 dias de armazenamento, pois o tamanho de diâmetro médio das gotas e os índices de polidispersidade não apresentaram diferença significativa durante este período. As análises microbiológicas in vitro e no patê de frango permitiram concluir que as o óleo essencial de orégano nanoemulsionado apresentou um elevado potencial antimicrobiano para E. coli e S. aureus, podendo ser considerado um potencial substituto para agentes conservantes sintéticos. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio financeiro (processos 2011/ , 2012/ e 2013/ ). 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Del Campo, J., Nguyen-The, C., Sergent, M., & Amiot, M. J. (2003). Determination of the most bioactive phenolic compounds from rosemary against Listeria monocytogenes: influence of concentration, ph and NaCl. Journal of Food Science, 68, Carvalho, A. C. F. B., Cortez, A. L. L., Salotti, B. M., Bürger, K. P., &Vidal-Martins, A. M. C. (2005). Presença de microrganismos mesófilos, psicrotróficos e coliformes em diferentes amostras de produtos avícolas. Arquivos do Instituto Biológico, 72, Lambert, R. J. W., Skandamis, P. N., Coote, P., & Nychas, G. (2001). A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, 91, Mason, T. G., Wilking, J. N., Meleson, K., Chang, C. B., & Graves, S.M. (2006). Nanoemulsions: Formation, Structure, and Physical Properties. Journal of Physics: Condensed Matter, 18, R635-R666. Oliveira, A. M., Gonçalves, M. O., Shinohara, N. K. S., & Stamford, T. L. M. (2003). Manipuladores de alimentos: um fator de risco. Higiene Alimentar, 17, Solans, C., Izquierdo, P., Nolla, J., Azemar, N., & Garcia-Celma, M. J. (2005). Nano-emulsions. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 10, Tadros, T., Izquierdo, R., Esquena, J., & Solans, C. (2004). Formation and stability of nano-emulsions. Advanced in Colloid and Interface Science, ,