VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO DENTRO DO CONTEXTO. DA INDÚSTRIA BRASILEIRA: análise crítica. Ronaldo Chan Fu Yi

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO DENTRO DO CONTEXTO DA INDÚSTRIA BRASILEIRA: análise crítica Ronaldo Chan Fu Yi Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Orientador(a): Prof.(a). Dr(a) Nádia Araci Bou-Chacra São Paulo 2017

2 2 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 4 2. OBJETIVO 5 3. MATERIAIS E MÉTODOS 5 4. DISCUSSÃO VALIDAÇÃO ANALÍTICA: aspectos gerais VALIDAÇÃO ANALÍTICA: parâmetros VALIDAÇÃO ANALÍTICA: desafios RESOLUÇÃO - RE Nº 475, DE 19 DE MARÇO DE RE Nº 475: aspectos gerais RE Nº 475: parâmetros RESOLUÇÃO - RE Nº 899, DE 29 DE MAIO DE RE Nº 899: aspectos gerais RE Nº 899: parâmetros RESOLUÇÃO DA DIRETORIA COLEGIADA - RDC Nº 166, DE 24 DE JULHO DE RDC Nº 166: aspectos gerais RDC Nº 166: parâmetros CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA 29

3 3 LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1. Cálculo de exatidão. (BRASIL, 2002) 14 Equação 2. Cálculo de limite de quantificação e limite de detecção. (BRASIL, 2002) 15 Equação 3. Cálculo de limite de detecção. (BRASIL, 2003) 19 Equação 4. Cálculo de limite de quantificação. (BRASIL, 2003) 19 Equação 5. Cálculo de exatidão. (BRASIL, 2003) 20 Equação 6. Cálculo de recuperação na exatidão. (BRASIL, 2017) 26 Equação 7. Cálculo de limite de detecção. (BRASIL, 2017) 26 Equação 8. Cálculo de limite de quantificação. (BRASIL, 2017) 27 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Cromatograma de clorpirifós. (ZALAT, 2013) 9 Figura 2. Espectro UV de succinato de solifenacina. (SINGH, 2011). 12 Figura 3. Cromatograma padrão de succinato de solifenacina. (REDDY, 2017) 12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Comparação entre as resoluções sobre intervalos. 6 Tabela 2. Exemplos de variações. (BRASIL, 2002) 16 Tabela 3. Classificação dos testes. (BRASIL, 2003) 17 Tabela 4. Parâmetros avaliados para cada categoria de teste. (BRASIL, 2003) 17 Tabela 5. Fatores avaliados na robustez. (BRASIL, 2003) 20 Tabela 6. Parâmetros a serem considerados na validação analítica. (BRASIL, 2017) 23 Tabela 7. Condições para a avaliação da robustez do método. (BRASIL, 2017) 28

4 4 RESUMO FU YI, Ronaldo Chan. ANÁLISE SOBRE A VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO DENTRO DO CONTEXTO DA INDÚSTRIA BRASILEIR A: análise crítica f. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica Faculdade de Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo, São Paulo, Palavras-chave: Validação analítica; ANVISA; Resolução. O objetivo da validação de determinado método analítico é demonstrar que esse é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos. A importância da qualidade analítica dos resultados constitui ferramenta de fundamental importância para a proteção e promoção da saúde da população. O avaliação da metodologia analítica, no Brasil, consiste em avaliar o histórico da qualidade e do rigor estabelecido pela ANVISA. A literatura avaliada para este trabalho teve como base principal a legislação brasileira, especificamente, normas produzidas pela autarquia especial ANVISA. A legislação de validação de métodos analíticos é bastante contundente nos parâmetros e critérios exigidos. O guia publicado pode ser considerado como desafiador para as indústrias farmacêuticas.

5 5 1. INTRODUÇÃO O objetivo da validação de determinado método analítico é demonstrar que esse é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos. A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. (BRASIL, 2003) A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) ressalta a importância da qualidade analítica dos resultados como um dos instrumentos fundamentais para a proteção e promoção da saúde da população. (BRASIL, 2005) Em 1994, o International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) criou o guia de validação de metodologia analítica Q2(R1). Esse guia foi criado em conjunto com as agências reguladoras European Medicines Agency (EMA), U.S. Food and Drug Administration (FDA) e Ministry of Health, Labour and Welfare (MHLW), sendo utilizado como modelo. O guia Q2(R1) foi concebido em 2005 pela junção dos guias Q2A e Q2B sem alterar o texto dos guias individuais, sendo o Q2A finalizado em 1994 e o Q2B, em A ANVISA, criada em 1999, publicou seu primeiro guia em 2002, oito anos após a primeira publicação do guia do ICH. A Resolução (RE) 475 estabeleceu parâmetros de validação para métodos bioanalíticos. Porém, tal guia, quando comparado ao guia do ICH, pode ser considerado bastante defasado. No ano seguinte, foi publicado a RE 899 revogando a RE 475, atualizando os parâmetros previamente estabelecidos e acrescentando os métodos analíticos ao escopo da resolução.

6 6 Desde então não houve qualquer atualização dos guias do ICH e da ANVISA. No final de 2013, havia sido estabelecido a revisão da RE 899, tendo previsão da disponibilização da consulta pública em julho de 2014 e a minuta ao final de Foi previsto, para essa revisão, o acréscimo de alguns parâmetros de avaliação estatísticos, entre outros aspectos. Porém, somente após dois anos da previsão, em 2016, a ANVISA publicou a consulta pública (RDC) nº166 para atualizar o guia. Em julho de 2017 foi publicada a resolução da diretoria colegiada (RDC) nº166 que dispõe sobre a validação de métodos analíticos e dá outras providências. Com a recém publicação os laboratórios das indústrias podem se adaptar a nova legislação e é esperado maior rigor do órgão regulatório brasileiro. 2. OBJETIVO O presente trabalho teve como objetivo a comparação e a análise crítica dos parâmetros dos guias para a validação de métodos analíticos do Brasil. 3. MATERIAIS E MÉTODOS A literatura avaliada para este trabalho teve como base principal a legislação brasileira, livros sobre validação analítica e artigos científicos. 4. DISCUSSÃO 4.1 VALIDAÇÃO ANALÍTICA: aspectos gerais Os guias referentes à validação analítica devem ser utilizados para demonstrar os requisitos mínimos aceitáveis para executar uma validação. Na prática, há tendência em utilizar esses guias como checklist para validação, podendo ser omitido algum parâmetro importante (ERMER, 2000).

7 7 Os parâmetros básicos para validação analítica completa são: seletividade, especificidade, linearidade, intervalo, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Nem toda validação exige todos os teste, assim depende do tipo de validação, se for completa ou parcial, além de também variar de acordo com a categoria do método a ser validado. A validação varia de acordo com as técnicas empregadas, sendo os métodos convencionais aqueles por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa (CG), titulometria, espectrofotometria UV-Vis e cromatografia de camada delgada (CCD). Para determinado medicamento ser comercializado é necessário, da parte do laboratório analítico, a validação dos métodos analíticos para a controle de qualidade da matéria-prima e do produto acabado. Para o controle de determinado fármaco (matéria-prima), por exemplo, são utilizados métodos de identificação desse, de quantificação, e de identificação de impurezas e solventes residuais. Sendo assim, são quatro validações analíticas somente para o fármaco. Para o produto acabado, as validações abrangem os métodos de teor, de dissolução e de produtos de degradação. Portanto, o total refere-se à sete métodos que devem ser validados e que serão exclusivos para cada matéria-prima ou produto acabado. 4.2 VALIDAÇÃO ANALÍTICA: parâmetros Quanto ao intervalo, essa característica é definida entre a maior e menor concentração do analito na amostra, sendo adequados para os testes de linearidade, precisão e exatidão. Os valores de limite superior e inferior variam conforme os teste a serem realizados e também variam de acordo com a literatura a ser seguida.

8 8 Tabela 1. Comparação entre as resoluções sobre intervalos. Método RE 475 RE 899 RDC 166 Teor* % % % Uniformidade de conteúdo* % % % Dissolução ± 20% além do intervalo especificado. ±20% sobre o valor especificado para o intervalo. Caso a especificação para a dissolução envolve mais que um tempo, o alcance do método deve incluir 20% sobre o menor valor e +20% sobre o maior valor. ±20% da menor e maior concentração esperada a partir do perfil de dissolução. Impurezas Do nível de impureza esperado até 120% do limite máximo especificado. Do nível de impureza esperado até 120% do limite máximo especificado. Do limite de Quantificação até 120% da concentração no limite da especificação de cada impureza individual. *tendo como referência a concentração teórica Para determinação simultânea de teor e impurezas pelo procedimento de normalização de área deve ser feito desde o limite de quantificação até 120% da concentração esperada da substância ativa. (BRASIL, 2017)

9 9 Os intervalos estabelecidos entre as resoluções (Tabela 1) apresenta a maior diferença em relação a forma de determinar o intervalo para dissolução. Para impurezas, o texto da RDC 166 é apenas uma releitura do texto presente nas resoluções publicadas anteriormente. No caso da dissolução, para a RE 475, foi considerado apenas um tempo de coleta enquanto que na RE 899, essa foi atualizada para abranger os medicamentos de liberação modificada. A regulamentação mais recente considera o intervalo a partir do perfil de dissolução. De acordo com a RDC 31 de 2010 que dispõe sobre a realização dos estudos de equivalência farmacêutica e de perfil de dissolução comparativo, observa-se que não há necessidade de realizar o limite de quantificação para o teste de dissolução. Porém, ao considerar perfil de dissolução para fármaco classe I, de acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutico (SCB), com perfil de dissolução, por exemplo, de 20, 60 e 80% em 5, 20 e 30 minutos, respectivamente, a menor concentração a ser avaliada seria de 0%. Portanto, quando ocorrer casos em que concentrações muito baixas de fármaco devem ser determinadas, o teste de limite de quantificação deve ser realizado. A nova resolução revoga o texto referente à validação parcial da RDC 31 (Brasil, 2017) e permite o entendimento da possível realização do teste de quantificação, como no caso do ensaio de dissolução. Porém cabe aos laboratórios a interpretação e o entendimento de determinar a realização do teste. A especificidade é a capacidade de detectar o analito na presença de outros componentes esperados, sejam impurezas, produtos de degradação ou excipientes. A especificidade mede o analito na ausência de interferência dos outros componentes.

10 10 A seletividade refere-se à capacidade do método em avaliar, de forma inequívoca, a resposta produzida por determinado analito na presença de outros componentes de comportamento similar presentes na amostra, potencialmente relacionados ao fármaco, tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz. (ANVISA, 2017) As características de seletividade e de especificidade muitas vezes são consideradas com uma só, por apresentarem conceitos similares. A RDC 166 considera apenas o parâmetro de seletividade, mas ao ser seletivo, o método também será específico. Para a quantificação do inseticida clorpirifós, foram validados método por CLAE e por espectrofotometria UV-Vis. Ambos os métodos foram bem sucedidos na validação, mas o método por UV-Vis é considerado mais simples, enquanto que o método por CLAE é complexo e sensível. O método por UV-Vis gera um espectro que permite avaliar a absorbância do composto na presença de outros componentes, enquanto que o cromatograma (Figura 1) foi capaz de separar o diluente do ativo. O primeiro pico é referente ao clorofórmio enquanto que o segundo pico é do inseticida clorpirifós. (ZALAT, 2013) Figura 1. Cromatograma de clorpirifós. (ZALAT, 2013)

11 11 Ambos os métodos foram capazes de quantificar o inseticida clorpirifós, portanto ambos são considerados específicos e apenas o método por CLAE é considerado seletivo pela capacidade separar o clorpirifós do diluente. A linearidade qualifica o procedimento analítico em obter resposta que seja diretamente proporcional a concentração do analito na amostra. Se o método for considerado linear, os resultados são proporcionais à concentração da amostra no intervalo determinado analisado. Preferencialmente, respeita-se intervalos estabelecidos, como por exemplo, para o teor, a linearidade deve ser realizada empregando cinco concentrações abrangendo 80 a 120% da concentração do analito e, geralmente, com distância entre as concentrações padronizadas. (BRASIL, 2017). Precisão inclui a repetibilidade, a precisão intermediária e a reprodutibilidade. A repetibilidade é a variação intra-corrida avaliada de um mesmo analista em um equipamento. A precisão intermediária avalia variação inter-corrida, então deve ser realizada em dias diferentes, com outro equipamento e por outro analista. A reprodutibilidade é a avaliação inter-laboratorial, realizado por outro laboratório. (BRASIL, 2017) A precisão, dependendo do método a ser validado, deve ser feita com amostras da matéria-prima ou com o produto acabado. O critério de aceitação consiste na avaliação do desvio padrão relativo. As análises podem ser feitas em três níveis de concentração, baixa, média e alta ou também seis vezes no nível 100% da concentração teste (BRASIL, 2017). A exatidão é a proximidade do valor mensurado ao valor nominal, isto é, a exatidão é determinada pela recuperação do princípio ativo presente na matriz do medicamento. Conforme o método, a exatidão deve ser realizada com amostras da matéria-prima, amostra simulada ou produto acabado. As análises podem ser feitas em três níveis de concentração, baixa, média e alta. (BRASIL, 2017)

12 12 O limite de detecção (LD) é a menor concentração do analito detectável numa amostra, mas não necessariamente quantificável. O limite de quantificação (LQ) é a menor concentração do analito a ser quantificado com precisão e exatidão. Este teste geralmente é realizado para avaliar compostos presentes com baixa concentração como impurezas e produtos de degradação. (BRASIL, 2017) A robustez é a capacidade do método analítico suportar pequenas variações deliberadas nos parâmetros, por exemplo, ph, composição da fase móvel e temperatura. (BRASIL, 2017) 4.3 VALIDAÇÃO ANALÍTICA: desafios O desenvolvimento e a validação de métodos analíticos são atividades essenciais para o registro de um novo medicamento junto a ANVISA. Constitui desafio para a indústria farmacêutica otimizar as validações e os métodos analíticos no que concerne ao gerenciamento de tempo, de custo e de eficácia. A dinâmica de um laboratório farmacêutico é frenética, sempre havendo testes a serem feitos e com insumos limitados. A vertente tempo é bastante valiosa no âmbito profissional e poder aproveitar melhor o tempo com menor custo hora/analista é a ambição dos laboratórios. Conforme analisado anteriormente, realizar análise empregando CLAE pode trazer resultados mais sensíveis em relação a outras técnicas. CLAE é uma técnica bastante cara, exigindo equipamentos e insumos mais caros. Além do fator preço, o tempo gasto em uma corrida por CLAE pode ser muito maior quando comparado a outras técnicas, como por espectrofotometria UV-Vis. Para um projeto de um novo medicamento deve ser considerado vários aspectos, como por exemplo, quantas validações devem ser feitas, se é possível analisar dois ou mais testes numa corrida, se o método é adequado para estabilidade e para o controle de qualidade, entre outros parâmetros.

13 13 No caso do insumo farmacêutico ativo (IFA) cloridrato de oxibutinina, temos um método para teor e outro para impurezas de acordo com a United States Pharmacopeia. Caso o método farmacopeico for seguido, será preciso de duas validações parciais, com isso mais tempo de preparo e de corrida, tanto na validação quanto nas análises de rotina da estabilidade e de controle de qualidade. Se o laboratório decidir que seja melhor criar método para analisar teor e impurezas juntos, poderá diminuir o tempo gasto, porém há o empecilho do tempo de resposta da ANVISA. Métodos não compendiais geralmente demoram dois anos para serem analisados e até a resposta do órgão não pode ser utilizado na rotina laboratorial, enquanto que métodos compendiais são de implementação imediata. Em outra comparação, para a analisar o teor de succinato de solifenacina em comprimidos foram desenvolvidos dois métodos por UV-Vis. Ambos os métodos foram desenvolvidos e validados com sucesso. A análise de teor pode ser feita com concentrações maiores, no caso foi utilizado o intervalo de 10 a 60 µ g/ml. (SINGH, 2011) O espectro do ativo (Figura 2) nos mostra o perfil de absorbância do ativo, não havendo a possibilidade de identificar outros compostos, insumos ou impurezas presentes nas amostras. Pelo método ser apenas de doseamento, não há necessidade de ser seletivo para impurezas, sendo assim o método por espectrofotometria UV-Vis compatível e viável como teste de teor. (SINGH, 2011)

14 14 Figura 2. Espectro UV de succinato de solifenacina. (SINGH, 2011). Em contraste, o método para a determinação do teor de succinato de solifenacina foi aquele empregando espectrofotometria, para a quantificação das impurezas, foi validado método por CLAE. Esse método foi capaz de separar as impurezas conhecidas. (REDDY, 2017) Figura 3. Cromatograma padrão de succinato de solifenacina. (REDDY, 2017)

15 15 Como já mencionado, as análises por CLAE são mais complexas. Por ser capaz de obter resultados mais sensíveis (Figura 3), o equipamento e o preparo também são requerem maiores cuidados. A primeira dificuldade decorre do equipamento ser bastante delicado, então soluções com sais em concentrações altas podem obstruir os canais do equipamento, os detectores ou até mesmo a coluna a ser utilizada. No caso, foi utilizado o intervalo das concentrações de 0,08 a 2,522 µ g/ml para o succinato de solifenacina (Reddy, 2017). Por serem concentrações baixas, a resposta analítica do equipamento também será menor e isso nos leva a outra dificuldade: a capacidade de processar os resultados e obter respostas adequadas. Considerando um equipamento qualificado e calibrado, com preparos corretos, nos resta processar os dados do cromatograma e, caso seja obtido um resultado não ideal, pode ser devido a dificuldade de integrar a área do pico por apresentar baixa resposta. Apesar de todas essas dificuldades, o método de impurezas foi validado para as três impurezas com tempo de corrida de 60 minutos. Agora considerando que ambos os métodos de Reddy (2017) e de Singh (2011) sejam utilizados na rotina, será necessário preparo isolado da amostra para o teor e outro para impurezas, com consequente maior custo (tempo e recursos). Se fosse realizada validação única para os dois métodos, seria necessário validar o intervalo de 0,08 a 60 µ g/ml de succinato de solifenacina (Brasil, 2017). Tal abordagem pode gerar novas adversidades como quantos pontos na curva de calibração deve ser estabelecidos caso seja uma única curva e, provavelmente, aumentaria o desvio entre as amostras, dificultando a obtenção dos critérios de aceitação dos parâmetros de validação.

16 16 5. RESOLUÇÃO - RE Nº 475, DE 19 DE MARÇO DE RE Nº 475: aspectos gerais O primeiro guia para validação de métodos da ANVISA abrangeu os métodos analíticos e bioanalíticos, com considerações para estabilidade de medicamentos e líquidos biológicos. A resolução é bastante superficial, com um grande escopo. As considerações gerais não discriminam os testes analíticos em quatro categorias, não define se é preciso validar métodos compendiais ou comprovar sua adequabilidade ao laboratório e não define a necessidade de revalidação de métodos. 5.2 RE Nº 475: parâmetros Os parâmetros considerados pela resolução são: linearidade, precisão, exatidão, especificidade/seletividade, limite de quantificação, limite de detecção e robustez. (BRASIL, 2002) Como mencionado anteriormente, a linearidade deve ser realizada com no mínimo cinco concentrações diferentes e os resultados devem ter tratamento estatístico adequado. Os únicos critérios obrigatórios a se apresentar foram coeficiente de correlação linear e o intercepto da reta. Não foram definidos os números de replicatas necessários. (BRASIL, 2002) O parâmetro de precisão não define a precisão inter-corridas, isto é, não esclarece o intervalo de tempo que deve ser respeitado, o local onde deve ser realizado ou se pode ser o mesmo operador da precisão intracorridas. De acordo com a resolução, a precisão pode ser feita pela repetibilidade com nove determinações, com três réplicas em concentrações, baixa, média e alta ou por seis determinações a 100%. Foi considerado como critério de aceitação do

17 17 parâmetro o desvio padrão relativo (DPR) menor ou igual a 15% independente da concentração das amostras. (BRASIL, 2002) No caso da exatidão, também foi seguido a execução do parâmetro com nove determinações, com três réplicas em concentrações, baixa, média e alta, mas foi exigido realizar exatidão intradia, no mesmo dia, e interdias, em dias diferentes. A legislação determinou a fórmula do cálculo do parâmetro (Equação 1), porém não determina os critérios de recuperação. (BRASIL, 2002) Equação 1. Cálculo de exatidão. (BRASIL, 2002) Concentração média experimental E xatidão = Concentração teórica x 100 A forma de preparar as amostras para parâmetros de linearidade, precisão e exatidão não foram determinados. Portanto, seria possível realizar os três parâmetros com apenas uma corrida, otimizando tempo e recursos. Especificidade do método deve ser feito com a solução padrão do mesmo contaminado com possíveis interferentes e comparar os resultados com soluções semelhantes isentas do fármaco. Para testes de impurezas, deve mostrar que o método é seletivo. Na ausência de padrão do produto de degradação, subproduto ou impureza, a especificidade do método pode ser determinada comparando-se os resultados de análise das amostras contendo tais componentes com os resultados de análise das mesmas amostras utilizando-se outro método bem caracterizado e validado. Quando apropriado, nesses casos, deve-se submeter as amostras a condições de estresse: luz, calor, umidade, hidrólise e oxidação. (BRASIL, 2002) O limite de quantificação e de detecção são estabelecidos por meio da análise de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até a razão de 5:1 para LQ e deve ser de 2 a 3 vezes superior ao ruído da linha de base para LD. O LQ deve apresentar precisão e exatidão. Os parâmetros também podem ser expressos pelas equações: Equação 2. Cálculo de limite de quantificação e limite de detecção. (BRASIL, 2002) DP x 10 DP x 3,3 L Q = IC LD = IC onde :

18 18 DP é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de várias curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação. O desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da análise de um apropriado número de amostras do branco; IC é a inclinação da curva de calibração. (BRASIL, 2002) As condições (Tabela 2) para a avaliação da robustez devem ser consideradas durante a fase de desenvolvimento do método. Tabela 2. Exemplos de variações. (BRASIL, 2002) Robustez RE 475 Preparo das Amostras Estabilidade das soluções analíticas Tempo de extração Cromatografia Líquida Variação do ph da fase móvel Variação na composição da fase móvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel Cromatografia Gasosa Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Velocidade do gás de arraste 6. RESOLUÇÃO - RE Nº 899, DE 29 DE MAIO DE RE Nº 899: aspectos gerais Um ano após a publicação da RE 475, a RE 899 foi aprovada, sendo revogada a RE 475. Essa resolução contempla tanto métodos bioanalíticos quanto métodos analíticos. Os métodos bioanalíticos foram desassociados dos métodos

19 19 analíticos pela Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 899, de 29 de maio de As considerações gerais deste novo guia considera métodos descritos em farmacopeias como método validado e para transferência de método requer que seja feita a validação parcial com os parâmetros de precisão, especificidade e linearidade. Ainda nas considerações gerais definem quando deve ser refeita a validação de um método e também apresentam a classificação dos testes (Tabela 3) e quais os parâmetros a serem avaliados para cada categoria de teste (Tabela 4). (BRASIL, 2003) Apesar do avanço apresentado, em apenas um ano, a questão do padrão de trabalho ainda não foi definida neste documento. A legislação aceita o uso de padrões de trabalho, na ausência de substâncias de referência, desde que seja determinada a identidade e o teor do mesmo (Brasil, 2003). Porém, não define quais os parâmetros a serem definidos para avaliar a identidade e o teor. O custo de uma substância de referência é muito alta, portanto, poder cortar custos utilizando a própria matéria-prima caracterizada pode render muita economia ao laboratório. Tabela 3. Classificação dos testes. (BRASIL, 2003) Categoria I II III IV Finalidade do teste Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias-primas Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias primas Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo) Testes de identificação

20 20 Tabela 4. Parâmetros avaliados para cada categoria de teste. (BRASIL, 2003) Parâmetro Categoria I Categoria II Categoria Quantitativo Ensaio III limite Categoria IV Especificidade Sim Sim Sim * Sim Linearidade Sim Sim Não * Não Intervalo Sim Sim * * Não Precisão Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não Intermediária ** ** Não ** Não Limite de detecção Não Não Sim * Não Limite de quantificação Não Sim Não * Não Exatidão Sim Sim * * Não * pode ser necessário dependendo da natureza do este específico **se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a comprovação da Precisão Intermediária. A RE 899 apresenta poucos aspectos estatísticos para o tratamento de dados, porém vários testes estatísticos foram abordados em workshop realizado pela ANVISA com o intuito de esclarecer dúvidas e orientar a realização da validação analítica. No workshop realizado, o escopo abordado é mais amplo do que o conteúdo da própria RE º 899, sendo assim ficou clara a necessidade de atualizar a resolução com os critérios já exigidos pelo órgão regulador, oficializando esses critérios, além do objetivo de complementar a resolução. 6.1 RE Nº 899: parâmetros Os parâmetros considerados pela resolução são: especificidade e seletividade linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação, limite de detecção e robustez. (BRASIL, 2003) O parâmetro de especificidade e seletividade, como na resolução anterior, considera como um parâmetro a ser avaliado como único. A nova resolução diferencia parâmetro para testes qualitativos e quantitativos.

21 21 Para análise qualitativa é necessário validar utilizando compostos com estruturas relacionadas. O resultado positivo deve provir da amostra contendo o fármaco e o resultado negativo deve ser proveniente das amostras que não contém o fármaco, mas compostos estruturalmente semelhantes. (BRASIL, 2003) Para análise quantitativa, pode ser feito a análise com amostras do fármaco ou produto acabado contaminada com impurezas ou excipientes em comparação com amostras não contaminadas. Para métodos cromatográficos, a RE 899 requer pureza de picos cromatográficos, sendo realizados por detectores de arranjo de fotodiodo ou espectrometria de massas. (BRASIL, 2003) A linearidade deve ser realizada com, no mínimo, cinco concentrações diferentes e devem seguir os intervalos determinados para o tipo de teste. Deve ser aplicado método estatístico apropriado para a determinação do coeficiente de correlação, intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Ainda se não houver relação linear, o guia permite realizar transformação matemática. Estabelece que o coeficiente de correlação (r) seja de 0,99. A precisão é feita pela repetibilidade com três replicatas em três concentrações, baixa, média e alta ou seis determinações a 100% da concentração teste. Também exige a realização da precisão intermediária com no mínimo dois dias de diferença com analistas diferentes. O critério de aceitação é baseado no DPR, não admitindo valores acima de 5%. (BRASIL, 2003) No caso do limite de detecção, para métodos não instrumentais, o guia indica que o limite pode ser visual, considerando a menor concentração capaz de produzir mudança desejada. Para métodos instrumentais, pode ser feita como três vezes o ruído da linha de base ou pela equação: Equação 3. Cálculo de limite de detecção. (BRASIL, 2003) DP a x 3 L D = IC

22 22 Em que: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação. Este desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de calibração proveniente da análise de um número apropriado de amostras do branco. IC é a inclinação da curva de calibração. (BRASIL, 2003) Como na resolução anterior o limite de quantificação deve ser avaliado quanto a precisão e a exatidão, contudo pode ser definido como a concentração que produza sinal-ruído superior a 10:1 ou também pode ser definido por uma equação: Equação 4. Cálculo de limite de quantificação. (BRASIL, 2003) DP a x 10 L D = IC Em que: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação. Esse desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de calibração proveniente da análise de um número apropriado de amostras do branco. IC é a inclinação da curva de calibração. (BRASIL, 2003) A exatidão deve ser feita com nove determinações, em concentrações baixa, média e alta, com três replicatas de cada concentração. Para IFA, o teste é realizado com padrão de referência. Para forma farmacêutica, o teste é realizado com placebo contaminado com padrão referência. Para impureza, é adicionada ao medicamento ou IFA. Não foi estabelecido o critério de aceitação mínimo para o teste. (BRASIL, 2003) A exatidão é calculada da seguinte forma: Equação 5. Cálculo de exatidão. (BRASIL, 2003) Concentração média experimental E xatidão = Concentração teórica Para uma validação completa, o guia exige que seja feita a robustez do método. O guia traz uma tabela com os fatores a serem considerados:

23 23 Tabela 5. Fatores avaliados na robustez. (BRASIL, 2003) Robustez RE 899 Preparo das Amostras Estabilidade das soluções analíticas Tempo de extração Espectrofotometría Variação do ph da solução Temperatura Diferentes fabricantes de solventes Cromatografia Líquida Variação do ph da fase móvel Variação na composição da fase móvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel Cromatografia Gasosa Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Velocidade do gás de arraste 7. RESOLUÇÃO DA DIRETORIA COLEGIADA - RDC Nº 166, DE 24 DE JULHO DE RDC Nº 166: aspectos gerais Em contraste as resoluções anteriores, foi aprovada uma RDC em vez de uma RE. Nas resoluções anteriores, o escopo de validação analítica estava anexado como guia, em contrapartida a RDC consiste em estabelecer os critérios mínimos de aceitação. Assim, o conteúdo de validação seria parte integrante da RDC e não um guia anexado. Todas as resoluções são de caráter normativa, então todo conteúdo tem característica de norma, inclusive os guias em anexo, então a mudança não afetaria em nada no âmbito jurídico. Por ser uma proposta de RDC, a Diretoria Colegiada elabora o draft da RDC e submete o esboço a

24 24 consulta pública, enquanto que se fosse uma RE, seria elaborada e a aprovada pelo Diretor-Presidente. A questão dos padrões foi abordado de forma a proibir o uso de padrões secundários ou substâncias químicas de trabalho (SQT), permitidas nas resoluções anteriores, na ausência do padrão primário. A proposta é tornar obrigatório o uso de substância química de referência (SQR), essa podendo ser substância química de referência farmacopeica (SQF) ou substância química de referência caracterizada (SQC). Para poder utilizar SQC, deve ser comprovado a indisponibilidade do SQF e apresentar a caracterização da substância química a ser padrão. (BRASIL, 2017) Em 2013, a ANVISA apresentou algumas definições preliminares, como apresentar um laudo da caracterização da SQC, apresentando dados no que se refere a sua identidade, qualidade, pureza, teor e potência. As técnicas utilizadas para caracterizar são inúmeras, sendo que devem ser utilizadas um número de técnicas suficientes para responder aos parâmetros solicitados. Algumas técnicas aplicáveis são termogravimetria, ponto de fusão, calorimetria exploratória diferencial, espectrometria no infravermelho, espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear, análise elementar (Carbono/Hidrogênio/Nitrogênio), difração de raio X, rotação óptica, métodos cromatográficos, entre outras. (BRASIL, 2013) A RE 899 considera que métodos farmacopeicos são validados. Para essa nova resolução foi definido que métodos farmacopeicos devem ser validados parcialmente, analisando os parâmetros de precisão, exatidão, seletividade e, apenas para impurezas, limite de quantificação. (BRASIL, 2017) Para fins de pós-registro, é descrito as circunstâncias para a revalidação de método analítico tais como alterações na síntese ou obtenção do insumo

25 25 farmacêutico ativo, alterações na composição do produto acabado, alterações no método analítico ou outras alterações que possam impactar. (BRASIL, 2017) É de grande importância estabelecer quando revalidar um método. Para uma indústria que compra IFA de apenas um fabricante, será necessário validação para inclusão de fabricante ou mudança de rota de síntese. A inclusão de fabricante é importante para evitar a falta de matéria-prima de um dos fabricantes, podendo acarretar na falta do medicamento. Outro ponto importante são as alterações no método analítico, por exemplo, pode ser decorrente da atualização de um método farmacopeico requerendo revalidação parcial da metodologia. As Tabelas 3 e 4 da antiga resolução foram atualizadas e sumarizadas na Tabela 6, simplificando a visualização dos das categorias dos testes (Brasil, 2017). Como já ressaltado no caso do limite de quantificação para perfil de dissolução, ainda há a flexibilidade para avaliar e determinar os parâmetros a serem seguidos. Tabela 6. Parâmetros a serem considerados na validação analítica. (BRASIL, 2017) Parâmetro Avaliado Identificaçã o Teste de impurezas Quantitativo Ensaio limite Doseamento -dissolução (quantificação) - uniformidade de conteúdo - potência Exatidão Não Sim Não Sim Precisão Não Sim Não Sim Repetibilidade Precisão intermediária Não Sim (1) Não Sim (1) Seletividade (2) Sim Sim Sim Sim Limite de detecção Não Não (3) Sim Não

26 26 Limite de quantificação Não Sim Não Não (3) Linearidade Não Sim Não Sim Intervalo Não Sim Não Sim (1) Nos casos em que foi conduzida a reprodutibilidade, não é necessário conduzir a precisão intermediária. (2) Nos casos de ensaios de identificação, pode ser necessária a combinação de dois ou mais procedimentos analíticos para atingir o nível necessário de discriminação. (3) pode ser necessário em alguns casos. 7.2 RDC Nº 166: parâmetros Os parâmetros considerados pela resolução são: seletividade, linearidade, efeito matriz, faixa de trabalho, precisão, exatidão, limite de quantificação, limite de detecção e robustez. (BRASIL, 2017) Essa seção estabelece para o teste de seletividade nos métodos de identificação o uso de compostos estruturalmente semelhantes, obtendo resultado positivo de amostra com o fármaco e resultado negativo para outras substâncias presentes na amostra. No caso de insumos farmacêuticos ativos de origem vegetal ou medicamento fitoterápico, o método deve ser capaz de distinguir de outras espécies vegetais semelhantes, principalmente as que possam ser utilizadas para substituir ou adulterar o produto. (BRASIL, 2017) Para a avaliação de métodos quantitativos, deve ser demonstrada a resposta analítica sem interferência de diluente, matriz, impurezas ou produtos de degradação. Visando comprovar a ausência de interferência por produto de degradação, deve ser realizado o estudo de estresse em condições de degradação em ampla faixa de ph, de oxidação, de calor e de luz. (BRASIL, 2017) Nesse teste, foi mantido o número mínimo de 5 concentrações e acrescido a realização do teste em triplicata no mínimo. Para avaliar o teste é exigido representação gráfica das respostas em função da concentração do analito, gráfico de dispersão dos resíduos, acompanhado de sua avaliação estatística,

27 27 método dos mínimos quadrados para estimar a reta, avaliação dos coeficientes de correlação (r) e de determinação (r 2 ) e avaliação da significância do coeficiente angular. Também determina que a homocedasticidade deve ser avaliada, utilizar nível de significância de 5%, o coeficiente de correlação deve estar acima de 0,990 e o coeficiente angular deve ser significativamente diferente de zero. Os critérios de avaliação são mais extensos em relação à antiga RE 899. Muitos critérios estatísticos propostos já são utilizados pelas empresas, mas como forma de formalizar e realmente exigir que sejam cumpridos estes parâmetros, é de grande importância que seja implementada. O efeito matriz é um novo parâmetro a ser avaliado e vai consumir mais tempo e mais recursos do laboratório. Deve ser determinado por meio da comparação entre os coeficientes angulares das curvas de calibração construídas com a SQR do analito em solvente e com a amostra fortificada com a SQR do analito. Deve ser feito, no mínimo, em triplicata e ambas as curvas devem utilizar as mesmas cinco concentrações. O teste de paralelismo das retas indica a ausência de interferência e deve ser considerado o nível de significância de 5% no teste de hipótese. A precisão exige a realização dos três tipos de precisão: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. O teste exige que seja feito com amostras preparadas de maneira independente desde o início do procedimento, isto é, deve ser feito com produto acabado ou IFA. Para avaliar impurezas, a amostra deve ser fortificada com concentrações conhecidas da impureza. Para a repetibilidade deve ser feito com nove determinações, com três replicatas em três concentrações, baixa, média e alta ou seis determinações a 100% da concentração teste. A precisão intermediária deve ser realizada de uma

28 28 mesma amostra, em pelo menos dois dias diferentes, por operadores distintos no mesmo laboratório. Os critérios de aceitação devem ser definidos de acordo com o objetivo do método, variabilidade intrínseca do método, concentração de trabalho e concentração do analito na amostra. A seção VI trata da exatidão e no início da seção determina que deve ser feito com nove determinações, com três replicatas em três concentrações, baixa, média e alta. A exatidão deve ser determinada para IFA aplicando a metodologia proposta utilizando SQR. No caso de matriz, deve ser realizado a adição de SQR à amostra. A exatidão deve ser determinada para produto terminado aplicando a metodologia proposta utilizando adição de SQR ao placebo. No caso de matriz complexa em que os componentes individuais estejam indisponíveis, deve ser realizado a adição de SQR à do produto acabado. Tanto para IFA quanto para produto acabado, a legislação permite avaliar a exatidão por meio da comparação de resultados obtidos resultantes de um segundo método validado. No caso de impurezas deve ser determinada aplicando a metodologia proposta utilizando adição de padrão ao medicamento ou ao IFA. Na ausência de certas impurezas, pode ser realizada a comparação dos resultados com um segundo método validado e a utilizar fator resposta do IFA. A exatidão deve ser expressa pelo DPR para cada concentração e pela recuperação do analito: Equação 6. Cálculo de recuperação na exatidão. (BRASIL, 2017) Concentração média experiemental E xatidão = Concentração teórica x 100 ou CA (amostra adicionada) CA (amostra) Exatidão = CT A x 100

29 29 Em que CA é a concentração experimental do analito e CTA é a concentração teórica do analito adicionado. Os critérios de aceitação para exatidão envolve a avaliação da recuperação e do DPR pelos mesmos critérios preconizados para a precisão. O limite de detecção pode ser determinado por meio do método visual, da razão sinal-ruído, baseado na determinação do branco ou em parâmetro da curva de calibração. No método visual, é realizado pela análise de amostras de menor concentração em que possa avaliar o efeito esperado. Para métodos instrumentais, a razão por sinal-ruído deve ser maior ou igual a 2:1 ou baseada em parâmetros da curva analítica: Equação 7. Cálculo de limite de detecção. (BRASIL, 2017) L D 3,3 σ = IC Em que: IC é a inclinação da curva de calibração, σ é o desvio padrão e podem ser obtidos de três formas: I o desvio padrão do intercepto com o eixo Y, de no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações do analito próximas ao suposto limite de quantificação; II o desvio padrão residual da linha de regressão III a partir da curva de calibração proveniente da análise de um apropriado número de amostra do branco. Agora, para limite de quantificação, o valor deve ser coerente com o limite de especificação da impureza e caso o produto tenha limite de notificação, o limite de quantificação deve ser menor ou igual ao limite de notificação. Como em todas as resoluções anteriores, o limite de quantificação deve ser testado quanto a precisão e a exatidão. (BRASIL, 2017)

30 30 Conforme o parâmetro anterior, o limite de quantificação pode ser avaliado pela razão do sinal-ruído, devendo ser maior ou igual a 10:1 ou baseada em parâmetros da curva analítica: Equação 8. Cálculo de limite de quantificação. (BRASIL, 2017) 10 σ L Q = IC Em que: IC é a inclinação da curva de calibração, σ é o desvio padrão e pode ser obtidos de três formas: I o desvio padrão do intercepto com o eixo Y, de no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações do analito próximas ao suposto limite de quantificação; II o desvio padrão residual da linha de regressão III a partir da curva de calibração proveniente da análise de um apropriado número de amostra do branco. Por fim, a robustez deve ser realizada conforme Tabela 6. As variações devem ser avaliadas com o mesmo critério utilizado para a exatidão. Em contraste, as resoluções anteriores, todas as condições devem ser testadas obrigatoriamente. Tabela 7. Condições para a avaliação da robustez do método. (BRASIL, 2017) Robustez RDC 166 Preparo das Amostras Estabilidade das soluções analíticas Tempo de extração Compatibilidade de filtros Espectrofotometría Variação do ph da solução Diferentes fabricantes de solventes ou lotes Cromatografia Líquida Variação do ph da fase móvel Variação na composição da fase móvel

31 31 Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel Cromatografia Gasosa Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Outras técnicas analíticas Temperatura Velocidade do gás de arraste As variações a serem testadas deverão ser avaliadas criticamente e seus resultados deverão ser apresentados Teste importante considerado no escopo da robustez, foi o teste de filtro. No mercado há inúmeros filtros que variam de acordo com o diâmetro, tamanho do poro e tipo de material. O filtro pode ser o detalhe que modifica o seu resultado, por exemplo, a primeira análise realizada com filtro tamanho de poro 0,22 µ m, o teor de determinado ativo foi de 80% e a segunda, com filtro 0,45 µ m, 100%. Isso significa que o filtro está retendo o ativo de interesse. Dessa forma, está se obtendo resultado fora do esperado. 8. CONCLUSÃO A ANVISA, como novo membro do ICH, revelou o potencial do Brasil no âmbito regulatório. Espera-se avançar na harmonização, na área de medicamentos. Com a publicação do novo guia de validação, os especialistas brasileiros podem contribuir com a atualização do guia de validação do ICH. Dessa forma, será possível contribuir ativamente com a evolução desses guias. A legislação de validação de métodos analíticos é bastante contundente nos parâmetros e critérios exigidos. Após longo tempo, sem oficialmente atualizar a legislação, a ANVISA publicou a nova resolução e guia de tratamento estatístico para estabelecer novos parâmetros e critérios de aceitação para validação de métodos analíticos.

32 32 Apesar dos desafios, a legislação exige das indústrias profissional cada vez mais qualificado na aplicação de ferramentas estatísticas para enfrentar os novos desafios e cumprirem com a missão de oferecer medicamentos eficazes e seguros para a população.

33 33 9. BIBLIOGRAFIA BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Consulta Pública nº166, de 12 de fevereiro de Dispõe sobre a validação de métodos analíticos de ensaios biológicos, microbiológicos, imunológicos, de identificação, quantitativos para a determinação de impurezas, ensaios limite para o controle de impurezas, ensaios quantitativos para a determinação de insumos farmacêuticos em amostras de matérias-primas ou de medicamentos em todas as suas fases de produção, e dá outras providências. Disponível em: BMinuta.pdf/10f472b4-b58b a-9c6cdbe3b40a Acesso em: 25/09/2016. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução nº 166, de 25 de julho de Dispõe sobre a validação de métodos analíticos e dá outras providências ''. Disponível em: d5fb92b3-6c6b e Acesso em: 18/09/2017. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução nº 899, de 29 de maio de Determinar a publicação do ''Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos''. Disponível em: -ab7f-473c-ab4e-6827dd5f4d42 Acesso em: 25/09/2016. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução nº 475, de 19 de março de Determinar a publicação do "Guia para Validação de Métodos Analíticos". Disponível em: Acesso em: 25/09/2016.

34 34 BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução nº 31, de 11 de agosto de Dispõe sobre a realização dos Estudos de Equivalência Farmacêutica e de Perfil de Dissolução Comparativo. Disponível em: 157d15-d3d5-4bb9-98db-5667e4d9e0c8 Acesso em: 25/09/2016. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Perspectivas da Revisão da RE nº 899/2003. Disponível em: %2BPerpectivas%2Bda%2BRevisa%25C3%25A3o%2Bda%2BRE%2B p df/7719ca29-4a92-4ba9-985e-54e7a45cbf04 Acesso em: 25/09/2016. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Principais motivos de reprovação da metodologia analítica pela Anvisa. Disponível em: rincipais%2bmotivos%2bde%2breprova%25c3%25a7%25c3%25a3o%2bda%2 Bmetodologia%2Banal%25C3%25ADtica%2B.pdf/7449f252-e4df-4e bb Acesso em: 25/09/2016. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Perguntas e respostas Workshop validação de métodos analíticos. Disponível em: %2BValida%25C3%25A7%25C3%25A3o%2Bde%2Bm%25C3%25A9todo%2Ban al%25c3%25adticos%2b-perguntas%2be%2brespostas.pdf/ ca87-4d1 e-8881-a0c0caddf0ff Acesso em: 25/09/2016. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Workshop de Validação de Metodologia Analítica. Disponível em: Acesso em: 25/09/2016.

35 35 BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma Assistência à Habilitação. Brasília: Eurachem Nederland., BLIESNER, David M.. Validating Chromatographic Methods: A practical guide. New Jersey: Wiley, ERMER, Joachim. Validation in pharmaceutical analysis. Part I: An integrated approach. Journal Of Pharmaceutical And Biomedical Analysis, [s.l.], v. 24, n. 5-6, p , mar Elsevier BV. GANTHI, Hari Kishan Reddy et al. Stability Indicating HPLC Method for Quantification of Solifenacin Succinate & Tamsulosin Hydrochloride along with Its Impurities in Tablet Dosage Form. American Journal Of Analytical Chemistry, [s.l.], v. 07, n. 11, p , Scientific Research Publishing, Inc,. SINGH, Lokesh; NANDA, Sanju. Spectrophotometric estimation of solifenacin succinate in tablet formulations. Pharmaceutical Methods, [s.l.], v. 2, n. 1, p.21-24, jan EManuscript Services. SWARTZ, Michael E.; KRULL, Ira S.. Handbook of Analytical validation. New York: Crc Press, SNYDER, Lloyd R.; KIRKLAND, Joseph J.; L.GLAJCH, Joseph. Practical HPLC methods development. 2. ed. New York: Wiley, STORPIRTIS, SÍlvia et al. A EQUIVALÊNCIA FARMACÊUTICA NO CONTEXTO DA INTERCAMBIALIDADE ENTRE MEDICAMENTOS GENÉRICOS E DE REFERÊNCIA: BASES TÉCNICAS E CIENTÍFICAS. São Paulo: ANVISA, 2004.

36 36 Disponível em: Acesso em: 25/09/2016. ZALAT, O.a. et al. Validation of UV Spectrophotometric and HPLC Methods for Quantitative Determination of Chlorpyrifos. International Letters Of Chemistry, Physics And Astronomy, [s.l.], v. 21, p.58-63, nov SciPress Ltd.