Workshop de Validação de Metodologia Analítica

Transcrição

1 Workshop de Validação de Metodologia Analítica Ministrante: Professora Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira Dezembro

2 Objetivos da Palestra Apresentar a teoria de validação de métodos à luz da Anvisa, traçando paralelo com outras normas nacionais e internacionais; Estimular análise crítica a respeito do tema; Mostrar a importância da leitura de artigos científicos, pois nenhum tema é esgotado por si só em regulamentos técnicos; Na legislação encontramos o que deve ser feito e não o como fazer ; Refletir a respeito da construção do conhecimento em nossa prática diária e a contribuição desta para o regulatório.

3 Introdução à Validação

4 Validação Definição: Validação é um ato documentado que atesta que qualquer procedimento, processo, equipamento, material, atividade ou sistema realmente e consistentemente leva aos resultados esperados. (RDC nº 17/2010)

5 Validação Os estudos de validação são parte essencial das BPF e devem ser conduzidos de acordo com Protocolos prédefinidos e aprovados. Relatório (...) contendo os resultados e conclusões devem ser preparados e arquivados. (RDC nº 17/2010)

6 Plano Mestre de Validação Planejamento de todas as atividades de validação com os objetivos, procedimentos, prazos e responsabilidades definidos. Deve conter no mínimo: RDC nº 17/2010 I - uma política de validação; II - estrutura organizacional das atividades de validação; III - sumário (situação atual e programação); IV - modelos de documentos ou referência a eles; V - planejamento e cronograma; VI - controle de mudanças; e VII - referências a outros documentos existentes.

7 Protocolo de Validação É um plano escrito que descreve como a validação será conduzida, definindo os critérios de aceitação. Inclui: Lista de equipamentos Parâmetros de teste Desenho experimental Dados que devem ser coletados e medidos Documentos inerentes Pontos de decisão e responsabilidades

8 Relatório de Validação É um resumo ou sumário do processo de validação, contendo todos os dados e resultados obtidos. Deve concluir se os critérios de aceitação foram atingidos e relatar as não conformidades.

9 Validação da Metodologia Analítica

10 Validação de Metodologia Analítica Definição: É o processo pelo qual se estabelece, através de estudos laboratoriais, que as características de performance do método, também denominadas parâmetros de validação, apresentam os requisitos necessários para aplicação analítica pretendida. (USP 36).

11 Validação de Metodologia Analítica Objetivo: A validação dos procedimentos analíticos tem por objetivo demonstrar que os métodos de ensaio utilizados apresentam resultados que permitem avaliar objetivamente a qualidade dos medicamentos, conforme os parâmetros especificados.

12 Validação de Metodologia Analítica A Anvisa ressalta a importância da qualidade analítica dos resultados como um dos instrumentos fundamentais para a proteção e promoção da saúde da população. (Guia para qualidade em química analítica)

13 Validação de Metodologia Analítica Uma das ferramenta que garante a qualidade analítica dos resultados. Permite: Verificar adequação ao uso; Identificar fontes potenciais de erros; Conhecer as variáveis críticas; Apresentar prova de que o método pode ser usado para tomada de decisão; Satisfazer especificações / requisitos legais; EURACHEM, 1998

14 Definições Método Normalizado: É aquele desenvolvido por um organismo de normalização ou outras organizações, cujos métodos são aceitos pelo setor técnico em questão. (INMETRO - DOQ-CGRE-008/2011) Estão aqui incluídos os Métodos Farmacopéicos.

15 Definições Método Não Normalizado: É aquele desenvolvido pelo próprio laboratório ou outras partes (por exemplo: pelo laboratório produtor do medicamento), ou adaptados a partir de métodos normalizados e validados. (INMETRO - DOQ-CGRE- 008/2011)

16 Quando Efetuar a Validação do Método? Segundo INMETRO (DOQ-CGRE-008/2011). Método não normalizado Método criado/desenvolvido pelo próprio laboratório Método normalizado usado fora do escopo indicado Ampliações / Modificações dos métodos normalizados

17 Quando Efetuar a Validação do Método? Segundo a Anvisa (RE 899/2003). No caso de metodologia analítica não descrita em farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente reconhecido pela Anvisa, deverá ser validada.

18 Quando Efetuar a Revalidação do Método? Segundo a RE 899/2003. A metodologia analítica deverá ser revalidada: Mudanças na síntese da substância ativa; Mudanças na composição do produto acabado; Mudanças no procedimento analítico. Determinadas outras mudanças podem requerer validação.

19 Modificação x Ajuste Revisão: Pharmacopeial Forum 31(3), pag ph da fase móvel (CLAE) + 0,2 unidades, Concentração de sais no tampão (CLAE) + 10% (absoluto), Relação de componentes da fase móvel (CLAE) + 30% (relativo), Nenhum componente pode ser reduzido a zero (CLAE), Comprimento de onda (CLAE) + 3 nm, Comprimento da coluna (CLAE, CG) + 70%, Diâmetro interno da coluna (CLAE) + 50%, (CG) + 25%, Velocidade de fluxo + 50%,

20 Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados? No caso de metodologias analítica descrita em farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será considerada validada. (RE 899/2003)

21 Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados? O laboratório deve confirmar que tem competência para aplicar o método de modo apropriado e que atinge o pretendido e que opera bem sob as condições normais de uso.(doq-cgcre-008-inmetro/2011)

22 Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados? Para usar metodologia analítica descrita na USP-NF é necessário verificar sua adequação nas condições atuais de uso.

23 Estratégia para Validação de Métodos Normalizados Definir escopo da aplicação O método atende? N Validação completa S Verificar competência do laboratório Documentar resultados

24 O que é Verificação? Definição: Evidência documentada que um método previamente validado desempenha como pretendido, no ambiente em que está sendo aplicado.

25 Verificação da competência analítica. Segundo a RDC Nº. 31, DE 11 DE AGOSTO DE 2010 Validação parcial para método de teor. Especificidade, linearidade, exatidão, precisão (repetibiliddae e intermediária) e intervalo. Segundo o FDA. Verificar a especificidade, a estabilidade da solução da amostra e a precisão intermediária.

26 Estratégia para Validação de Métodos Não Normalizados Validação Otimização Desenvolvimento

27 Desenvolvimento/Otimização Resultado obtido com colunas cromatográficas diferentes. Coluna T k N cromatográfica C18 1,63 8, C8 1,27 9, T=Fator de cauda ou assimetria; k = Fator de capacidade; N - Número de pratos teóricos.

28 Desenvolvimento/Otimização Resultados referentes à variação proporção da fase móvel. Proporção da fase móvel Rt T k N 75:25 2,93 1,51 4, :20 3,79 1,39 6, :15 5,32 1,27 9, Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k = Fator de capacidade; N - Número de pratos teóricos.

29 Desenvolvimento/Otimização Resultados referentes à variação de ph da fase móvel (85:15). ph Rt T k N 5,0 5,44 1,29 9, ,0 5,45 1,28 9, ,5 5,38 1,28 9, Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k = Fator de capacidade; N - Número de pratos teóricos.

30 Validação de Metodologia Analítica Segundo a RE 899. No caso de metodologia analítica não descrita em farmacopéias ou formulários oficiais. Especificidade e Seletividade Linearidade Intervalo Exatidão Repetibilidade Precisão Precisão intermediária Reprodutibilidade LQ e LD De acordo com a classificação do teste segundo sua finalidade. Robustez

31 Classificação dos testes segundo sua finalidade Categoria Finalidade do teste I Testes quantitativos para determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias-primas. II Testes quantitativos ou ensaio limite para determinação de impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos ou matérias-primas. III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo) IV Testes de identificação.

32 Planejamento (passos) da Validação. Definir o objetivo do método; Definir os parâmetros de desempenho e critérios de aceitação; Desenvolver o PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO; Definir os experimentos de validação conhecer bem o método antes de iniciar a validação; Executar os experimentos preliminares (definição dos testes de conformidades do sistema); Ajustar os parâmetros do método se necessário; Realizar os experimentos completos de validação - Executar o protocolo de validação; Desenvolva POP para a execução do método, na rotina; Prepare o RELATÓRIO DE VALIDAÇÃO.

33 Ensaios necessários para a validação do método. Parâmetro Categoria I Categoria II Categoria III Categoria IV Quantitativo Ensaio limite Especificidade SIM SIM SIM * SIM Linearidade SIM SIM NÃO * NÃO Intervalo SIM SIM * * NÃO Precisão Repe Inter SIM SIM ** ** NÃO NÃO SIM ** NÃO NÃO LD NÃO NÃO SIM * NÃO LQ NÃO SIM NÃO * NÃO Exatidão SIM SIM * * NÃO Robustez SIM SIM SIM NÃO NÃO * pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico. ** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária.

34 Teste de Adequação do Sistema Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da adequação do sistema (SHABIR, 2003) Parâmetros Fator de capacidade (k') Recomendações O pico deve estar bem resolvido de outros picos e do volume morto k' 2,0. Repetitividade É desejável um DPR 1% para N 5 Tempo de retenção relativo Resolução (R) Não é essencial se a resolução é declarada R 2 entre o pico de interesse e o potencial interferente que elui mais próximo Fator de cauda (T) T 2 Número de pratos teóricos (N) Em geral deve ser 2000

35 Definição dos Parâmetros de Validação

36 Especificidade Definição dos Parâmetros de Validação É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz. Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário demonstrar a capacidade de discriminação do método. Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas comparação dos resultados obtidos de amostras contaminadas (impurezas ou excipientes) com amostras não contaminadas demonstrar que o resultado do teste não é afetado.

37 Especificidade Definição dos Parâmetros de Validação Impureza ou produto de degradação não disponíveis Utilizar amostras armazenadas sob condições de estresse (Ex: luz, calor umidade, hidrólise ácida/básica, oxidação). Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos. Detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas.

38 Plano Experimental Especificidade Análise Qualitativa Identificação Preparar um placebo (matriz), Contaminar o placebo com o material de referência, Comprovar o resultado positivo para o placebo contaminado com o material de referência e o resultado negativo para a matriz em branco.

39 Intensity(mV) 5.28, Didanosina Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma do Padrão 100% HO O N N O N NH RetentionTime(min)

40 3.29 Intensity(mV) Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma do Placebo RetentionTime(min)

41 Intensity(mV) 5.29, Didanosina Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma do Placebo contaminado O HO O N N N NH RetentionTime(min)

42 Plano Experimental Especificidade Impurezas e produtos de degradação não disponíveis, submeter amostras a condições de estresse: exposição a temperatura, exposição a luz, hidrólise ácida (HCl 0,1N), hidrólise alcalina (NaOH 0,1N) e Oxidação (H 2 O 2 3%). Comparar os resultados obtidos com as amostras degradadas e não degradadas. Resolução entre picos adjacentes, do componente principal e outros componentes (Rs) > 2.

43 Intensity(mV) 5.48, Didanosina Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma obtido após exposição à temperatura de C RetentionTime(min)

44 3.26 Intensity(mV) 2.49 Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma obtido após exposição à solução de ácido clorídrico 0,1N RetentionTime(min)

45 , Didanosina Intensity(mV) Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma obtido após exposição à solução de peróxido de hidrogênio 3 % RetentionTime(min)

46 Intensity(mV) 2.54, Hipoxantina Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma após injeção da solução de hipoxantina RetentionTime(min)

47 3.34 Intensity(mV) 2.51, Hipoxantina 5.79, Didanosina Exemplo de um estudo de Especificidade. Cromatograma obtido após injeção da solução de Didanosina contaminada com hipoxantina, R= 13, RetentionTime(min)

48 Linearidade Definição dos Parâmetros de Validação É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, 5 concentrações diferentes. Estas concentrações devem seguir os intervalos da tabela a seguir:

49 Limites percentuais do teor do analito que devem estar contidos no intervalo de linearidade para alguns métodos analíticos. Ensaio Determinação quantitativa do analito em matérias-primas ou em formas farmacêuticas Alcance De 80% a 120% da concentração teórica do teste. Determinação de impurezas Do nível de impureza esperado até 120% do limite máximo especificado. Quando apresentarem importância toxicológica ou efeitos farmacológicos inesperados, os limites de quantificação e detecção devem ser adequados às quantidades de impurezas a serem controladas. Uniformidade de conteúdo Ensaio de dissolução De 70% a 130% da concentração teórica do teste. De ± 20% sobre o valor especificado para o intervalo. Caso a especificação para a dissolução envolva mais de um tempo, o alcance do método deve incluir 20% sobre o menor valor e +20% sobre o maior valor.

50 Plano Experimental Linearidade Preparar uma solução mãe da substância química de referência e a partir desta, diluições a fim de obtermos soluções em cinco níveis de concentração. Por exemplo: 50 %, 75 %, 100 %, 125 % e 150 %, do valor rotulado.

51 Cálculos Estatísticos Linearidade Calcular a Média, Variância o DP e o DPR. Prosseguir com os seguintes cálculos. Elaborar Curva de Calibração Calcular coeficiente angular (b) Calcular coeficiente linear (a) Cálculo do coeficiente de correlação linear (r) Cálculo do erro padrão da estimativa (desvio padrão residual), (S e ) Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE)

52 Cálculos Estatísticos Determinação de Valores Aberrantes. Um resultado analítico afetado por erro grosseiro difere, quase sempre de modo visível, dos demais resultados do conjunto das determinações executadas (replicatas) em paralelo na mesma amostra. Tais resultados são denominados aberrantes, comprometendo a precisão e a exatidão do resultado final. Portanto o tratamento estatístico dos dados inicia-se pela detecção de valores aberrantes, que pode ser realizado através do teste de Grubbs. Este teste estatístico pode ser aplicado quando se deseja verificar se o menor valor ou o maior valor é aberrante, denominado teste de Grubbs para um valor aberrante, onde n 3.

53 Teste de Grubbs. Onde : Cálculos Estatísticos G x i s x x i x = valor suspeito de ser aberrante. = média dos valores obtidos. s = desvio padrão dos valores obtidos. Em função do número de replicatas (n) e um nível de significância. Se G calculado > G tabelado valor suspeito é considerado aberrante, e então descartado. Se G calculado < G tabelado valor suspeito não é considerado aberrante.

54 Estudo de caso. Cálculos Estatísticos Determinação de valor aberrante. Teste de Grubbs x x i G G s = 74,76 s = 0,75 x Padrão 50 % Padrão 75 % Padrão 100 % Padrão 125 % Padrão 150 % Replicata 1 49,94 75,10 100,18 124,35 148,43 Replicata 2 49,88 75,00 100,07 124,31 148,44 Replicata 3 49,99 75,14 99,78 124,15 148,25 Replicata 4 49,96 73,23 99,95 124,04 148,26 Replicata 5 49,99 75,00 99,93 124,43 148,23 Replicata 6 49,99 75,09 100,10 124,30 148,19 73,23 74,76 0,75 G tab = 1,89 2,04 G calc > G tab Aberrante, portanto, é descartado.

55 Desvio padrão (s ou DP). Desvio padrão é igual a raiz quadrada positiva da variância. Deve ser expresso com dois algarismos significativos. s Variância (s 2 ou V). A variância é calculada dividindo o somatório dos quadrados dos desvios de cada valor em relação à média, pelo número de graus de liberdade (n-1). s 2 x x x i n 1 i n 1 x 2 2 Cálculos Estatísticos

56 Cálculos Estatísticos Homocedasticidade Verificar a homocedasticidade, ou seja, a independência da variância das respostas do método com as concentrações das amostras analisadas (homogeneidade da variância dos resíduos) pelo teste de Cochran, aplicando a fórmula que se segue. C cal s 2 maior s 2 Onde: s 2 maior = maior variância s 2 = somatório das variâncias

57 Cálculos Estatísticos Homocedasticidade: Se C calculado < C tabelado Homocedasticidade Se C calculado > C tabelado Heterocedasticidade Se o critério de homocedasticidade for aceito, a regressão linear é executada pelo método dos mínimos quadrados, que estima qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente a partir da curva de calibração. Se não houver relação linear, realizar transformação matemática

58 Cálculos Estatísticos Homocedasticidade C cal s 2 maior s 2 Como C calculado 0,344 é menor que C tabelado 0,506. s 2 maior s 2 = 0,020 = 0,058 O critério de homocedasticidade foi aceito. Aplicando a fórmula, C calculado = 0,344.

59 Cálculos Estatísticos Curva de calibração: Realizada análise de regressão deve-se apresentar o coeficiente de correlação linear (r), a inclinação (coeficiente angular), o intercepto da reta (coeficiente linear), soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão. A regressão linear é representada por uma equação do tipo: yˆ a bx Onde, analito. ŷ é o valor da resposta para uma dada concentração x do

60 Cálculos Estatísticos Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE). SSE ˆ i 2 y i y Onde, SSE = soma dos quadrados dos resíduos. y i ŷ i = valor observado experimentalmente (valor medido). = valor previsto pela reta (valor projetado).

61 Cálculos Estatísticos Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE). O critério da reta de regressão é encontrar os coeficientes a e b, que minimizem a soma dos quadrados dos resíduos, procedimento denominado método dos quadrados mínimos. Se os pares de valores estiverem contidos na reta ajustada a soma dos quadrados dos resíduos será igual a zero e a explicação da reta ajustada será completa (reta ideal), portanto o objetivo é que a soma dos quadrados dos resíduos seja mais próxima de zero possível.

62 Cálculos Estatísticos Cálculo do erro padrão da estimativa (S e ). s e y Onde, i n 2 yˆ i 2 s e y i ŷ i = erro padrão da estimativa (desvio padrão residual) = valor observado experimentalmente (valor medido) = valor previsto pela reta (valor projetado) = n -2 graus de liberdade

63 Cálculos Estatísticos Cálculo do erro padrão da estimativa (S e ). O erro padrão da estimativa mede a dispersão dos desvios, denominados resíduos, ao redor da reta de regressão. O conceito do erro padrão da estimativa ou desvio padrão residual, é equivalente ao do desvio padrão que mede a variabilidade dos valores da amostra ao redor da média aritmética desses valores. Atendidas as premissas de regressão linear, se espera que aproximadamente 95 % dos valores da amostra y se encontrem no intervalo de + 2 x s e de seus respectivos valores projetados pela reta de regressão, ou seja, que os valores dos resíduos se encontrem neste intervalo (+ 2 x s e ).

64 Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.

65 Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.

66 Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.

67 Estudo de caso. Cálculos Estatísticos Resultado: Erro Padrão da Estimativa ou Desvio Padrão Residual (S e ) Analista 1: Estatística de regressão R múltiplo 0, R-Quadrado 0, R-quadrado ajustado 0, Erro padrão 0, Observações 15 Critério de Aceitação: Os valores dos resíduos devem-se encontrar no intervalo (+ 2 x S e ).

68 Resultado dos resíduos. Cálculos Estatísticos Analista 1: Identificação da amostra: Padrão Lamivudina INCQS Concentração Y previsto Resíduos 1 50,32-0, ,32-0, ,32-0, ,95 0, ,95 0, ,95 0, ,59 0, ,59 0, ,59 0, ,22-0, ,22-0, ,22-0, ,85 0, ,85-0, ,85-0,05 Como pode ser observado na tabela o resultado dos resíduos foi satisfatório. Encontram-se dentro do intervalo de + 2 x 0,28 = + 0,56.

69 Y Resíduos Estudo dos resíduos e dos valores medido e previsto para y. Variável X 1 Plotagem de resíduos 0,50 0,00-0, Variável X 1 PLOTAGEM DE AJUSTE DE LINHA Y Y previsto Variável X 1

70 Exatidão. A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro. Para o Fármaco: Definição dos Parâmetros de Validação Aplica-se a metodologia analítica proposta, na análise de uma substância de pureza conhecida (padrão de referência). Ou compara-se os resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda metodologia bem caracterizada, cuja exatidão tenha sido estabelecida.

71 Exatidão. Definição dos Parâmetros de Validação Para o Produto (Forma Farmacêutica). Analisa-se uma amostra, na qual foi adicionada uma quantidade conhecida do fármaco a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo contaminado). No caso de todos os componentes do medicamento não estarem disponíveis, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao medicamento.

72 Exatidão. Para Impurezas. Definição dos Parâmetros de Validação Utiliza-se o método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradação ao medicamento ou ao fármaco. No caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de degradação, aceita-se a comparação dos resultados obtidos com um segundo método bem caracterizado (metodologia farmacopéica ou outro procedimento analítico validado).

73 Exatidão. Definição dos Parâmetros de Validação A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de: no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada. A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, acrescida do intervalo de confiança.

74 Plano Experimental Exatidão. Preparar uma solução mãe concentrada e efetuar as diluições na matriz a fim de obter três concentrações diferentes. Partir da solução mãe também para a calibração, para evitar erros de pesagem. Efetuar nove determinações, em três concentrações diferentes, com três réplicas cada, por exemplo: 75%, 100% e 125% do valor rotulado, em triplicata de injeção. Realizar as análises no mesmo dia usando o mesmo analista.

75 Cálculos Estatísticos Exatidão. É geralmente expressa como porcentagem de recuperação (R%) da substância de interesse, calculada segundo a fórmula, acrescida dos intervalos de confiança. R % x 100 x Onde, R % x x = porcentagem de recuperação. = média dos resultados (valor determinado experimentalmente). = concentração teórica correspondente (valor esperado).

76 Exatidão. R R x ca Quando não há possibilidade de preparar matriz limpa da amostra, adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao medicamento, para determinar a Exatidão, que é calculada segundo a fórmula. x sa % % 100 x x ca a x sa Onde, = porcentagem de recuperação Cálculos Estatísticos = conc. medida na amostra com adição do analito ou padrão = conc. medida na amostra sem adição do analito ou padrão x a = concentração adicionada

77 Cálculos Estatísticos Exatidão. Calcular a Média, Calcular o Desvio padrão (DP), Calcular o Desvio padrão relativo (DPR), Calcular o percentual de Recuperação, Calcular o Intervalo de confiança. Critérios de Aceitação - Exatidão Para ensaios de teor (maior componente) a recuperação média deve ser de 100% + 2% para cada concentração na faixa de 80 a 120% da concentração alvo ou de estudo.

78 Cálculos Estatísticos Intervalo de confiança (IC). É o intervalo dentro do qual o valor verdadeiro se encontra. x ts n Portanto: = valor verdadeiro x = média dos valores obtidos IC ts n Onde, s = desvio padrão n t = tamanho da amostra (número de replicatas) = valor tabelado, em função de: n 0 de graus de liberdade, = n 1 nível de significância ( ).

79 Exatidão. Cálculos Estatísticos Analista 1: Identificação das amostras: Placebo contaminado - Lamivudina comprimido revestido Concentração da amostra 75% 100% 125% Replicata A1 98,02 99,34 99,26 Replicata A2 98,31 99,48 99,18 Replicata A3 98,35 99,51 99,14 Replicata B1 100,71 98,32 99,44 Replicata B2 100,51 98,40 99,36 Replicata B3 100,56 98,39 99,42 Replicata C1 98,63 99,12 99,36 Replicata C2 98,68 99,38 99,38 Replicata C3 99,18 99,21 99,46 Média 99,22 99,02 99,33 DP 1,08 0,50 0,11 DPR 1,09 0,51 0,12 % Recuperação 99,22 99,02 99,33 IC +0,83 +0,38 +0,08

80 Cálculos Estatísticos Exatidão. Nível de 75%. % R = 99,22 + 0,83% IC ts n IC 2,306 1,08 9 0,83 t tab = 2,306. = n 1 = 8 IC Nível de 100%. 2,306 0,50 0,38 9 % R = 99,02 + 0,38 % Nível de 125%. % R = 99,33 + 0,08 % IC 2,306 0,11 9 0,08

81 Critérios de Aceitação - Exatidão Critério De Aceitação : AOAC, 2000 Concentração 100 % 10 % 1 % 0,1 % 0,01 % 1 ppm 10 ppb Concentração Fracional 1,0 0,1 0,01 0,001 0, , , Recuperação média %

82 Precisão. Definição dos Parâmetros de Validação A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta é considerada em três níveis. Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação. Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

83 Precisão. Definição dos Parâmetros de Validação Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias. Estes dados não precisam ser apresentados para a concessão de registro.

84 Precisão. Definição dos Parâmetros de Validação A repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9 (nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração do teste. Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.

85 Plano Experimental Precisão. Verificar a precisão nos níveis repetibilidade e precisão intermediária. Efetuar seis determinações, a 100% do valor rotulado, através da analise de três amostras diferentes. No nível repetibilidade realizar as seis análises, de cada uma das amostras, no mesmo dia e com o mesmo analista. Para o parâmetro precisão intermediária, com as mesmas amostras descritas acima, executar três tipos de comparação: Repetir as análises, usando um analista diferente. Repetir as analises, utilizando um equipamento diferente.

86 Cálculos Estatísticos Precisão. Repetibilidade Calcular a Média, Calcular o DP, Calcular o DPR. Precisão Intermediária Teste de F Calcular as variâncias (s 2 ), Calcular o valor de F para cada uma das comparações utilizadas para avaliação da precisão intermediária.

87 Cálculos Estatísticos Precisão. Repetibilidade Calcular a Média, Calcular o DP, Calcular o DPR. Amostra Laboratório A Laboratório B Laboratório C A1 101,84 100,16 96,97 A2 102,61 100,52 97,32 B1 101,54 98,05 96,55 B2 101,71 98,26 96,78 C1 100,58 99,27 98,27 C2 100,57 99,31 98,46 D1 101,85 98,56 96,41 D2 101,74 98,72 95,80 E1 101,18 98,52 96,35 E2 101,19 98,78 96,15 F1 100,54 99,00 96,83 Média 101,33 99,02 96,89 DP 0,67 0,73 0,79 DPR 0,66 0,74 0,82

88 Cálculos Estatísticos Precisão. Repetibilidade Critério de Aceitação segundo a RE 899/2003: O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, do tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores superiores a 5% (RE 899).

89 Critérios de Aceitação - Precisão Fórmula empírica de Horwitz RSD r 2 (1-0,5 log c). 0,67 Analito % Horwitz Calculado DPR r % ,3 10 2,8 1, ,7 0,1 5,6 3,7 0,01 8 5,3 0, ,3 0, , , , c concentração fracional: representa a concentração percentual dividida por cem.

90 Cálculos Estatísticos Precisão Intermediária Teste de F Calcular as variâncias (s 2 ), Calcular o valor de F para cada uma das comparações utilizadas para avaliação da precisão intermediária.

91 Cálculos Estatísticos Comparação de variâncias (s 2 ): Teste de F. Para comparação de variâncias pelo Teste-F, partimos da hipótese nula de que não há diferença significativa entre as variâncias comparadas, ou seja: H 0 : s 2 2 s 1 2 H 1 : s 2 2 s 1 2 O teste de hipótese aqui realizado, ou seja para comparação de variâncias, é um teste em duas caudas, portanto a tabela de F utilizada é a bicaudal.

92 Cálculos Estatísticos Comparação de variâncias (s 2 ): Teste de F. F calc s s s 2 2 s 1 2 O F tab é encontrado na tabela de F, para: o (nível de significância) definido; para os graus liberdade (para o numerador) n e para os graus liberdade (para o denominador) n 2 2 1

93 Cálculos Estatísticos Comparação de variâncias (s 2 ): Teste de F. F calc s s s 2 2 s 1 2 Para que a hipótese nula seja aceita, F calc < F tab ou F crit. O valor de F calc é sempre maior que a unidade.

94 Precisão Intermediária H 0 : s 2 2 s 1 2 H 1 : s 2 2 s 1 2 Identificação das amostras: Amostras do laboratório A analisadas por analistas diferentes. Amostras Laboratório A Analista 1 Equip. 2 Analista 2 Equip. 2 A1 101,84 100,36 A2 102,61 100,54 B1 101,54 99,46 F calc. = 0,45/0,34 F calc = 1,32 F tab = 3,43 B2 101,71 99,55 C1 100,58 101,53 C2 100,57 99,89 D1 101,85 100,24 D2 101,74 100,39 E1 101,18 100,05 E2 101,19 100,02 F calc < F tab H 0 é aceita. Analistas diferentes: satisfatória F1 100,54 100,85 F2 100,58 100,84 Média 101,33 100,31 DP 0,67 0,58 DPR 0,66 0,58 s 2 0,45 0,34

95 Precisão Intermediária Identificação das amostras: Amostras do laboratório A analisadas com equipamentos diferentes. Amostras Laboratório A Analista 2 Equip.2 Analista 2 Equip.1 H 0 : s 2 2 s 1 2 H 1 : s 2 2 s 1 2 A1 100,36 99,21 A2 100,54 98,80 B1 99,46 100,41 F calc = 0,49/0,34 F calc = 1,44 F tab = 3,43 B2 99,55 100,83 C1 101,53 99,50 C2 99,89 99,64 D1 100,24 100,41 D2 100,39 100,07 E1 100,05 99,02 E2 100,02 99,03 F calc < F tab H 0 é aceita. Equip. diferentes: satisfatória F1 100,85 99,02 F2 100,84 98,80 Média 100,31 99,56 DP 0,58 0,70 DPR 0,58 0,70 S 2 0,34 0,49

96 Precisão Intermediária Cálculos Estatísticos A ANOVA (análise de variância) é utilizada para comparação de duas ou mais análises, a partir da distribuição F, utilizada para realizar o teste de hipótese, onde a hipótese nula é de que não há diferenças estatisticamente significativas entre as análises, se F calc < F tab aceita-se a hipótese nula ( H 0 : ). F tab para o nível de significância adotado.

97 Intervalo Definição dos Parâmetros de Validação Intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método analítico. É estabelecido pela confirmação de que o método apresenta: Exatidão, Precisão, Linearidade... adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades de substâncias dentro do intervalo especificado. O intervalo depende da aplicação pretendida.

98 Definição dos Parâmetros de Validação Limite de Detecção (LD). O Limite de Detecção é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável.

99 Definição dos Parâmetros de Validação A avaliação do limite de detecção (LD) pode ser: Visual, Relação sinal/ruído - 3:1, Desvio Padrão da resposta e inclinação. LD = 3 x DP DP = Desvio padrão IC IC = Inclinação da curva de calibração A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito. A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita : Desvio padrão do Branco. Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado como DP.

100 Definição dos Parâmetros de Validação Limite de Quantificação (LQ). O Limite de Quantificação é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser determinada com exatidão e precisão aceitáveis, sob as condições experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis.

101 Definição dos Parâmetros de Validação Limite de Quantificação (LQ). Relação sinal/ruído - 10:1, Desvio Padrão da resposta e inclinação. LD = 10 x DP DP = Desvio padrão IC IC = Inclinação da curva de calibração A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito. A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita : Desvio padrão do Branco. Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado como DP.

102 Robustez. Definição dos Parâmetros de Validação A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal. Caso haja susceptibilidade do método à variações nas condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento.

103 Robustez. Definição dos Parâmetros de Validação Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método analítico: Preparo das Amostras: Espectrofotometria: Estabilidade das soluções analíticas Tempo de extração Variação do ph da solução Diferentes fabricantes de solventes Cromatografia Líquida: Variação do ph da fase móvel Variação na composição da fase móvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel

104 Definição dos Parâmetros de Validação Robustez. Cromatografia Gasosa. Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Velocidade do gás de arraste

105 Avaliação da Robustez A verificação da robustez deve ser realizada após a validação do método; Planejamento experimental para avaliar a robustez pelo método de Youden matriz de experimento; Avaliar qual o impacto das variações teor (exatidão)

106 Bibliografia ANVISA, Habilitação de Laboratórios Analíticos em saúde segundo os requisitos da ISO/IEC Procedimento GGLAS 02/17025, 2. ed, Brasília, ANVISA, Guia para Qualidade em Química Analítica Uma Assistência a Acreditação, v. 1, 1. ed, Brasília, ANVISA, Informe Técnico nº 1 de 15 de julho de 2008 Esclarecimento sobre o item 2.9 do anexo da Resolução RE nº 1 de 29/07/2005, que trata do Guia para Realização dos Estudos de Estabilidade. BRASIL, Resolução (RE) nº 899, de 29 de maio de Determina a publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos". Diário Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 de junho de 2003.

107 Bibliografia BRASIL, Resolução (RDC) nº 210, de 04 de agosto de Atualiza as Boas Práticas de Fabricação de medicamentos com o objetivo de acompanhar o desenvolvimento de novas tecnologias. Diário Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 14 de agosto de BRITO, N.M. Avaliação da Exatidão e da Precisão de Métodos de Análise de Resíduos de Pesticidas Mediante Ensaios de Recuperação. Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, p , jan./dez CDER (Center for Drug Evaluation and Research). Validation of Chromatografic Methods, nov FURMAN,W. B. Pharm.Techn. 22, (6), 1998, INMETRO DOQ-CGCRE-008 Orientações sobre Validações de Métodos de Ensaios Químicos. RJ, Brasil, LAPPONI, J.C. Estatística usando Excel. São Paulo: Lapponi treinamento e editora, 2000.

108 Bibliografia NBR ISO/IEC 17025, Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Calibração e de Ensaios. ABNT, RJ, Brasil, PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. Verification of Compendial Procedures, 31(2), Mar-Abr, 2005, p PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. 31(3), May-June, 2005, p SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopoeia and the International Conference on Harmonization. Journal of Chromatography A, 987, p , Disponível em Acesso em: 16 de abril de USP (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA). Chromatography, 27 ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2004, p

109 Obrigada! Contato: Tel: (21)