FUNGITOXICIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL DE ALFAVACA NO CONTROLE DE Alternaria solani EM TOMATE

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1 FUNGITOXICIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL DE ALFAVACA NO CONTROLE DE Alternaria solani EM TOMATE Isadora Rodrigues Garcia 1, Kaique dos Santos Alves¹, Matheus Ricardo da Rocha¹, Adilson Vidal Costa², Vagner Tebaldi de Queiroz², Willian Bucker Moraes 1. 1 Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Agrárias e Engenharias, Alto Universitário, s/n, Guararema, Alegre, ES, Brasil, isadorargz@hotmail.com¹, willian.moraes@ufes.br ¹. 2² Universidade Federal do Espírito Santo/ Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde/ Departamento de Química e Física, Alto Universitário, s/n, Guararema Alegre- ES, Brasil, vagnertq@gmail.com², avcosta@hotmail.com². Resumo - A pinta-preta (Alternaria solani) é uma das principais doenças do tomateiro, causando importantes perdas ao produtor. Diante disto, objetivou-se com este trabalho avaliar o potencial antifúngico do óleo essencial de alfavaca (Ocimum gratissimum L.) sobre o desenvolvimento in vitro e in vivo de A. solani em tomate. Na fase in vitro, o óleo essencial e o fungicida foram adicionados ao meio de cultura V8, adicionando-se posteriormente discos de micélio do patógeno em placas de Petri. Realizou-se a mensuração diária do crescimento radial (cm) das colônias. Na fase in vivo, imergiramse os frutos em solução contendo o óleo essencial e posteriormente realizou-se a inoculação. Avaliouse a severidade da doença e calculou-se a Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença. Na fase in vitro, o óleo essencial, na sua menor concentração, reduziu em 42,67% o crescimento micelial do patógeno. Em 500 mg/l, obteve-se a inibição do desenvolvimento do patógeno. Na fase in vivo, o óleo essencial apenas reduziu a severidade da doença nos frutos. Desta forma, conclui-se que o óleo essencial de alfavaca possui efeito antifúngico sobre o desenvolvimento in vitro e in vivo de A. solani. Palavras-chave: pinta-preta, controle alternativo, Ocimum gratissimum L., Solanum lycopersicum Área do Conhecimento: Engenharia Agronômica. Introdução O tomate está entre as principais hortaliças comercializadas no mundo, sendo o Brasil um dos dez maiores produtores mundiais da hortaliça. Em 2017, a produção nacional alcançou cerca de toneladas de tomate, com uma produtividade média de kg/ha (IBGE, 2017). Apesar de sua grande produção nacional, alguns entraves ao cultivo ainda são persistentes, como a ocorrência de doenças, sendo fator limitante ao cultivo do tomateiro. A cultura pode ser atacada por uma ampla gama de patógenos, como fungos, vírus, bactérias e nematoides, causando diversos danos e, consequentemente, gerando perdas ao produtor. Dentre as principais doenças, a pinta-preta (Alternaria solani) pode ocorrer sobre todas as partes da planta, incluindo os frutos. A ocorrência da doença durante o período de colheita e pós-colheita, além de afetar a aparência, qualidade e nutrição dos frutos, desvaloriza o produto comercialmente (RIBEIRO, 2016). O controle químico com fungicidas é o método mais comum para o controle da pinta-preta no tomateiro, entretanto, a sua utilização indiscriminada e sem orientação vêm acarretando sérios problemas à saúde humana e ambiental. O não seguimento das orientações encontradas na bula dos fungicidas sintéticos aliado à tentativa de enviar ao mercado um produto isento de doenças, colocam no mercado um produto com resíduos de agrotóxicos, devido ao não cumprimento do período de carência dos mesmos. A utilização de produtos alternativos à utilização de fungicidas sintéticos é uma opção viável para a redução do uso de agrotóxicos na agricultura, contribuindo assim, para a conservação do meio ambiente (DE MORAIS, 2009). 1

2 Os óleos essenciais são substâncias naturais produzidas no metabolismo secundário de algumas espécies vegetais e que possuem potencial ação antifúngica, podendo ser utilizados para o controle de fitopatógenos. Além disso, os óleos essenciais podem atrair diversos polinizadores e atuar como repelente de insetos e fitopatógenos para as plantas (NUNES et al., 2005). Na busca por uma agricultura mais sustentável e visando uma produção de frutos com menor utilização de agrotóxicos, objetivou-se avaliar o potencial antifúngico do óleo essencial de alfavaca sobre o desenvolvimento in vitro e in vivo de A. solani em tomateiro. Material e Métodos O estudo foi conduzido no Laboratório de Epidemiologia e Manejo de Doenças de Plantas Agrícolas e Florestais (LEMP), do Núcleo de Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Manejo Fitossanitário de Pragas e Doenças (NUDEMAFI), situado no Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo, localizada na cidade de Alegre, ao Sul do estado do Espírito Santo. O óleo essencial de alfavaca foi sintetizado e disponibilizado pelo Grupo de Estudos Aplicados em Produtos Naturais e Síntese Orgânica (GEAPS), da Universidade Federal do Espírito Santo. Os isolados do patógeno foram obtidos por meio do isolamento indireto de lesões características de pinta-preta encontradas em frutos de tomate naturalmente infectados. As estruturas do patógeno foram transferidas para placas de Petri (90 mm) contendo meio de cultura Ágar-Água, para a obtenção da cultura pura. Posteriormente, as placas foram vedadas com filme do tipo PVC e acondicionadas em Câmara de Demanda Bioquímica de Oxigênio (BOD) sob temperatura de 25 ± 1 C, com fotoperíodo de 12 horas, durante 7 dias. Na fase in vitro do experimento, utilizou-se o Delineamento Experimental Inteiramente Casualizado (DIC) com 6 tratamentos, sendo quatro concentrações do óleo essencial de alfavaca (250, 500, 750 e 1000 mg/l) e duas testemunhas, uma contendo apenas o meio de cultura BDA (0 mg/l) e outra contendo o princípio ativo tiofanato-metílico (200 g/kg) + clorotalonil (500 g/kg) (2400 mg/ml), com 4 repetições cada. O óleo essencial e o princípio ativo foram adicionados ao meio de cultura V8 de acordo com a concentração de cada tratamento. Em cada solução de óleo essencial, adicionou-se o surfactante Twenn 80, na concentração de 2%, para facilitar a dispersão das partículas. A solução foi mantida sob agitação manual por 30 segundos, e posteriormente, adicionou-se 20 ml de solução em cada placa de Petri (LORENZETTI, 2011). Após a solidificação do meio de cultura, transferiu-se um disco de micélio (5 mm), contendo as estruturas fúngicas do patógeno, para o centro de cada placa de Petri. As placas foram vedadas com filme do tipo PVC e acondicionadas em câmara do tipo BOD sob temperatura de 25 ± 1 C, com fotoperíodo de 12 horas (LORENZETTI, 2011). A avaliação do experimento iniciou-se após 24 horas de sua instalação, medindo-se diariamente o crescimento micelial radial do patógeno, em dois sentidos perpendiculares, adotando-se a média como valor de crescimento e descartando-se o valor do diâmetro do disco central. As avaliações foram cessadas ao final de sete dias, calculando-se a porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) (EDGINGTON; KHEW; BARRON, 1971). Para o cálculo do PIC, utilizou-se a fórmula: PIC = CM testemunha CM tratamento CM testemunha 100 Em que, CM testemunha: valor do crescimento micelial da testemunha negativa; e CM tratamento: valor do crescimento micelial de cada tratamento Os dados de crescimento micelial obtidos foram submetidos à análise de variância e comparação de médias pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade, com o auxílio do programa estatístico R, na versão 3.4 (R CORE TEAM, 2018). 2

3 Na fase in vivo do experimento, utilizou-se o Delineamento Experimental Inteiramente Casualizado (DIC), com 4 tratamentos, sendo: T0 (testemunha sem inoculação), T1 (testemunha inoculada), T2 (óleo essencial de alfavaca (500 mg/l)) e T3 (tiofanato-metílico (200 g/kg) + clorotalonil (500 g/kg) (2.400 mg/l)), com 4 repetições cada. A concentração escolhida para o óleo essencial de alfavaca baseou-se nos resultados obtidos na fase in vitro do experimento. Os frutos foram obtidos no comércio local da cidade de Alegre (ES) e selecionados de acordo com o tamanho, grau de maturação e isenção de doenças. Após a seleção, os frutos passaram por um processo de sanitização com álcool 70% e hipoclorito de sódio (1%), durante um minuto para cada produto (AQUINO, 2012). Posteriormente, os frutos foram acondicionados em bancadas assépticas para a sua secagem. Após a secagem, realizou-se a imersão dos frutos nas soluções de cada tratamento, durante um minuto e posteriormente, os mesmos foram novamente acondicionados em bancadas assépticas para sua secagem. A inoculação foi realizada por meio de 3 discos de micélio, contendo as estruturas do patógeno, dispostos sob a superfície do fruto. Os frutos foram mantidos em câmara do tipo BOD sob temperatura de 25 ± 1 C, com fotoperíodo de 12 horas (LORENZETTI, 2011). A avaliação do experimento iniciou-se 24 horas após a sua instalação realizando-se a mensuração do diâmetro (mm) das lesões nos frutos a cada dois dias. As avaliações cessaram-se ao final de 20 dias, calculando-se a Área abaixo da Curva de Progresso da Severidade da Doença (AACPD), conforme a equação apresentada por SHANER e FINNEY (1977), por meio da expressão: Em que, AACPD = { n 1 [ y i+ y i+2 i=1 ] (t 2 i+1 t i )} Yi e Yi+2 correspondem às porcentagens de área do fruto lesionada nas avaliações i e i+2; ti e ti+1 correspondem ao tempo considerado nos dias i e (i+1); e n ao número total de avaliações. Os dados de severidade e progresso da doença obtidos foram submetidos à análise de variância e comparação das médias pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de significância, com o auxílio do programa estatístico R, na versão 3.4 (R CORE TEAM, 2018) Resultados Na fase in vitro, o óleo essencial de alfavaca apresentou atividade antifúngica sobre o fungo A. solani a partir da concentração de 250 mg/l, reduzindo 42,67% do seu crescimento micelial (Tabela 1). Com o aumento da concentração para 500 mg/l, observa-se a inibição completa do crescimento micelial de A. solani (Figura 1). Tabela 1 Porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) de A. solani submetida ao óleo essencial de alfavaca (250, 500, 750 e 1000 mg/l) e ao princípio ativo Tiofanato-metílico + clorotalonil (2.400 mg/l) Tratamento PIC (%) Testemunha (0 mg/l) 0 Alfavaca 250 mg/l 42,67 Alfavaca 500 mg/l 100 Alfavaca 750 mg/l 100 Alfavaca 1000 mg/l 100 Tiofanato-metílico + clorotalonil (2.400 mg/l) 94,7 3

4 Crescimento (cm) Figura 1 Efeito in vitro do óleo essencial de alfavaca (250, 500, 750 e 1000 mg/l) sobre o crescimento micelial de A. solani. 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ŷ = 3,1825-0,0040x R² = 0, Concentração Fonte: Isadora Rodrigues Garcia (2018). Todos os tratamentos diferiram estatisticamente da testemunha (0 mg/l), dessa forma, houve efeito do óleo essencial de alfavaca em todas as concentrações sobre o crescimento micelial de A. solani. Entretanto, a concentração de 250 mg/l além de não inibir completamente o crescimento do patógeno, diferiu estatisticamente das outras concentrações. As demais concentrações (500, 750 e 1000 mg/l) não diferiram estatisticamente do fungicida Tiofanato-metílico + clorotalonil (2.400 mg/l), portanto, o óleo essencial de alfavaca nestas concentrações possuí o mesmo efeito antifúngico que o fungicida comercial (Tabela 2). Tabela 2 Efeito in vitro do óleo essencial de alfavaca (250, 500, 750 e mg/l) e tiofanatometílico + clorotalonil (2.400 mg/l) sobre o crescimento micelial de A. solani. Tratamento Testemunha (0 mg/l) Alfavaca 250 mg/l Tiofanato-metílico + clorotalonil (2.400 mg/l) Crescimento micelial (cm) 3,8375 a 2,2000 b 0,2000 c Alfavaca 500 mg/l Alfavaca 750 mg/l Alfavaca 1000 mg/l 0,0000 c 0,0000 c 0,0000 c As médias seguidas por uma mesma letra não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Na fase in vivo, ao analisar a Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD), observa-se que não houve diferença estatística significativa entre o óleo essencial de alfavaca e o fungicida tiofanato-metílico + clorotalonil, apresentando 96,78% de eficiência no controle do desenvolvimento de lesões em relação à frutos inoculados sem tratamento (Tabela 3 e 4). Portanto, o óleo essencial de alfavaca foi eficiente no controle de pinta-preta em frutos de tomate. 4

5 Tabela 3 Área Abaixo da Curva de Progresso da severidade de pinta-preta (A. solani) (AACPD) em frutos de tomate, submetidos ao tratamento com óleo essencial de alfavaca (T2) e tiofanatometílico + clorotalonil (T3), após 20 dias de avaliações. Tratamento AACPD T0 T1 T2 3, a b c T3 0, c As médias seguidas por uma mesma letra não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Tabela 4 Eficiência relativa de controle (%) de A. solani com o óleo essencial de alfavaca e tiofanato-metílico + clorotalonil (T3) em relação a frutos de tomate sem tratamento. Eficiência de controle Tratamento (%) Sem tratamento 0 Óleo essencial de alfavaca (500 mg/l) 96,78 Tiofanato-metílico + clorotalonil (2.400 mg/l) 100 Discussão O óleo essencial de alfavaca possui como componente majoritário o eugenol, sendo que este composto altera a permeabilidade da membrana dos fungos, gerando a sua degradação (LEE et al., 2007). Desta forma, a inibição completa do crescimento micelial de A. solani quando submetido ao óleo essencial de alfavaca, na fase in vitro, pode ser explicado devido à degradação das membranas do fungo pelo eugenol presente no óleo. A alteração na permeabilidade da membrana permite a entrada de partículas fungicidas para dentro da célula, causando a degradação da membrana e consequente morte do fungo. Faria et al (2006), relatou a inibição do crescimento micelial de A. solani pelo óleo essencial de alfavaca, inibindo em 61,11% o crescimento micelial, na concentração de 7,5 mg/disco de papel filtro, atribuindo-se o efeito fungicida ao eugenol. Esse resultado corrobora com os resultados obtidos no presente trabalho, sendo o eugenol o provável responsável pelo efeito antifúngico contra o desenvolvimento de A. solani. Os óleos essenciais são compostos muito voláteis e que podem perder o seu efeito antifúngico após a sua aplicação quando utilizados sem algum mecanismo capaz de reter suas moléculas voláteis (SÁNCHEZ-GONZALEZ et al., 2010). Entretanto, quando aplicado nos frutos de tomate, o óleo essencial de alfavaca manteve o seu efeito fungicida, não permitindo o desenvolvimento inicial e atrasando o desenvolvimento de lesões causadas por A. solani ao final das avaliações. Conclusão O óleo essencial de alfavaca possui efeito antifúngico sobre o desenvolvimento in vitro e in vivo de A. solani. Referências AQUINO, C.F. Ação e caracterização química de óleos essenciais no manejo da antracnose do maracujá. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 34, n. 4, p ,

6 DE MORAIS, L.A.S. Influência dos fatores abióticos na composição química dos óleos essenciais. Horticultura Brasileira, v. 27, n. 2, EDGINGTON, L.V.; KHEW, K.L.; BARRON, G.L. Fungitoxic spectrum of benzimidazoles compounds. Phytopathology, v. 61, n. 1, p , FARIA, T.J; FERREIRA, R.F.; YASSUMOTO, L.; DE SOUZA, J.R.P; ISHIKAWA, N.K; BARBOSA, A.M. Antifungal Activity of Essential Oil Isolated from Ocimum gratissimum L. (eugenol chemotype) against Phytopathogenic Fungi. Brazilian Archives of Biology and Technology, V.49, n. 6, p , INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE). Levantamento Sistemático da Produção Agrícola (2017). Disponível em: < Acessado em: 23 ago LEE, S. J.; HAN, J. I.; LEE, G. S.; PARK, M. J.; CHOI, I. G.; NA, K. J.; JEUNG, E. B. Antifungal effect of eugenol and nerolidol against Microsporum gypseum in a guinea pig model. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 30, n. 1, p , LORENZETTI, E.R.; MONTEIRO, F.P.; SOUZA, P.E.; SOUZA, R.J.; SCALICE, H.K.; DIOGO JR, R.; PIRES, M.S.O. Bioatividade de óleos essenciais no controle de Botrytis cinerea isolado de morangueiro. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 13, p , 2011 NUNES, X.P.; MAIA, G.L.A.; ALMEIDA, JR. G.S.; PEREIRA, F.O.; LIMA, E.O. Antimicrobial activity of the essential oil of Sida cordifolia L. Revista Brasileira Farmacognosia, v. 16, p , R CORE TEAM (2018). R: A language and environment for statistical compuntig. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. RIBEIRO, J.G.; SERRA, I.M.R.S.; ARAÚJO, M.U.P. Uso de produtos naturais no controle de antracnose causado por Colletotrichum gloeosporioides em mamão. Summa Phytopathologica, v.42, n.2, p , SÁNCHEZ-GONZÁLEZ, L.; CHÁFER, M.; CHIRALT, A.; GONZÁLEZ-MARTÍNEZ, C. Physical properties of edible chitosan films containing bergamot essential oil and their inhibitory action on Penicillium italicum. Carbohydrate polymers, v. 82, n. 2, p , SHANER, G.; FINNEY, R. E. The effect of nitrogen fertilization on the expression of slow - mildewing resistance in Knox wheat. Phytopathology, v.67, n.8, p ,