Isadora Portelinha Moreira Carneiro. Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita

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1 Isadora Portelinha Moreira Carneiro Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita Brasília 2017

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3 Isadora Portelinha Moreira Carneiro Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Departamento de Odontologia da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília, como requisito parcial para a conclusão do curso de Graduação em Odontologia. Orientador: Profa. Dra. Ana Carolina de Acevedo- Poppe Co-orientador: Profa. Dra. Pollyanna Almeida Costa dos Santos Brasília 2017

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5 Àos meus pais Tânia e Ronaldo e ao Paulo Henrique.

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7 AGRADECIMENTOS Ao concluir este trabalho um turbilhão de emoções invadiu o meu sentir, recordei do que me motivou a cursar uma nova graduação e de todas as pessoas que me ajudaram nessa decisão. Agradeço especialmente ao Paulo Henrique que foi fundamental para realização desse sonho. Você soube dizer as palavras certas quando pensei em desistir de fazer o vestibular. Impossível não recordar desse momento, sempre confiante em mim, até mesmo quando me falta essa confiança. A distância esteve muitas vezes presente, mas ela nunca foi empecilho para nós. Essa foi apenas uma etapa das muitas que iremos conquistar juntos. Muito obrigada meu Amor por incentivar os meus sonhos e por me fazer feliz todos os dias. Agradeço minha mãe Tânia e meu pai Ronaldo por todo o incentivo e apoio que me deram durante a realização do curso, mesmo com toda dificuldade vocês fizeram de tudo para que eu conseguisse concluir e nos momentos de desespero me acalmava dizendo que tudo terminaria bem. Vocês não tinham nenhuma obrigação de me ajudar em uma nova graduação, mas agarraram a oportunidade como se fossem de vocês e fizeram desse sonho realidade. Vejo o orgulho que sentem de mim em seus olhos e poder proporcionar essa felicidade é o meu maior estímulo para ser cada dia uma pessoa e uma profissional melhor que faça diferença na vida das pessoas. Obrigada por serem exemplos de superação, amo vocês infinitamente. Aos meus irmãos Gustavo e César muito obrigada por me ajudarem, vocês foram fundamentais para a conclusão desse sonho. Amo vocês! Obrigada Cibele e Clarivaldo por me acolher como uma filha, vocês ocupam um lugar especial na minha vida e no meu coração, foram afetuosos e sempre presentes com pequenas atenções, lanchinhos gostosos para estudar, chá para dormir e até companhia durante a madrugada para fazer os provisórios de

8 prótese fixa. Agradeço a oportundade de poder fazer parte dessa família tão especial. Joyce, João Paulo, Ariela e a minha querida Clarinha muito obrigada pelos momentos felizes compartilhados. À minha família, tios, tias e primos obrigada por vocês serem parte da minha história. Obrigada especial ao meu padrinho Tio Chico que me incentivou e orientou a fazer odontologia e a Tia Débora de quem sempre irei recordar com alegria e carinho, você faz muita falta. Agradeço todos os meus professores pelos conhecimentos compartilhados. Aos professores Liliana e Rodrigo, vocês são exemplos para mim, são profissionais competentes com uma família linda, aprendi com vocês que é possível ter a vida profissional e a pessoal em harmonia. Ao professor Lucas Tabata por sempre estar disposto a ajudar no que precisei durante a graduação, até mesmo para conversar sobre a profissão. Aos professores Leandro Hilgert e Soraya Leal por me inspirarem através do exemplo de profissionais competentes que vocês são. Ao professor Paulo Galvão por todo encentivo e também por me mostrar que com a odontologia também podemos ajudar de uma forma diferente os que mais precisam. Em especial a minha querida orientadora Ana Carolina que me acolheu com muito carinho em um momento de desespero no meu primeiro ano de graduação, com quem criei um vínculo muito especial. Obrigada por sua paciência, por suas palavras docentes e por acreditar que eu seria capaz de um desafio tão grande como esse projeto. Dr. Paulo Yamagutti muito obrigada por compartilhar o seu conhecimento de uma forma tão especial. Você é exemplo de dedicação, de competência e de humanidade, um profissional em quem me espelho. Espero um dia ser um pouquinho do que você é para esses pacientes. Obrigada muito especial a minha co-orientadora e amiga Pollyanna pela ajuda em todos os momentos: tanto nas horas de realizar os experimentos, analisar os resultados e corrigir o

9 trabalho, como nas horas de conversas alegres. Que bom que tive a feliz oportunidade de conhecê-la. Agradeço aos componentes do laboratório de Histopatologia Bucal, nele pude aprender muito e fazer muitas amizades. São pessoas queridas que tive o privilégio de conviver durante 4 anos. Agradeço especialmente à Lídia e ao Luan pela participação nas extrações de DNA; a Thaís pelas conversas divertidas e a querida Ana Luiza pelo carinho, boa vontade e companhia na Clínica de Anomalias Dentárias. Agradeço aos pacientes com osteogênese imperfeita que aceitaram participar dessa pesquisa, sem eles este estudo não seria possível. A minha querida turma 65 de Odontologia agradeço por todos os momentos que compartilhamos nesses anos, vocês estiveram presente em todos os meus dias e contribuíram para ser uma jornada mais alegre e divertida. Sentirei falta de todos vocês. Muito obrigada Tainara, Jéssica, Lucas e Ygor, vocês são amigos que a odontologia me presenteou para a vida. A minha querida companheira de atendimentos clínicos Nathália Maria muito obrigada por ser minha parceira em tudo, você foi fundamental para que a graduação fosse alegre, divertida e leve. Sentirei saudade de tê-la todos os dias comigo. Você é uma pessoa muito especial, com um grande coração. Sou grata por tudo que compartilhamos e pela amizade que criamos. Agradeço aos meus amigos, aos que estão longe e aos que fiz em Brasília, vocês permitem que a vida não seja feita apenas de trabalho, mas também de felicidade e bem-estar. Por fim, agradeço a Deus por me permitir estar em constante evolução. Muito Obrigada!

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11 EPÍGRAFE Para tudo há soluções, mas é necessário encontrar as mais felizes. E as mais felizes não podem ser outras do que as que permitem a mudança em nós mesmos. Carlos Gonzáles Pecoche

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13 RESUMO CARNEIRO, Isadora Portelinha Moreira. Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Odontologia) Departamento de Odontologia da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília. A osteogênese imperfeita (OI) é um grupo de condições genéticas heterogêneas, caracterizadas principalmente pela fragilidade óssea. A OI é considerada um transtorno relacionado à síntese e estrutura do colágeno e a maioria dos casos (80-90%) está relacionada a mutações dominantes no COL1A1 e COL1A2, genes que codificam as cadeias de colágeno tipo 1 (COL1). Na última década, foram relatadas mutações em pelo menos 16 outros genes associados a casos de OI autossômico recessivo e um ligado ao cromossomo X. Clinicamente, a OI é caracterizada por apresentar alterações esqueléticas e extraesqueléticas. A dentinogênese imperfeita (DGI), uma alteração na formação da dentina dentinária, está presente em aproximadamente 50% dos casos de OI dos tipos I a IV. O objetivo desse estudo foi identificar, pelo método de sequenciamento de nova geração (NGS), mutações patológicas em 33 pacientes diagnosticados com OI e caracterizar as alterações dentárias clínicas e radiográficas dos pacientes diagnosticados com DGI, em tratamento com bisfosfonato e em atendimento na Clínica de Pacientes Portadores de Anomalias de Desenvolvimento Dentário do Hospital Universitário de Brasília. Com a finalidade de caracterizar as manifestações dentárias, os prontuários desses pacientes foram analisados. A avaliação genética foi realizada por meio do desenvolvimento de um painel de NGS, composto de 14 genes associados à OI e a sua análise foi realizada utilizando a plataforma Ion AmpliSeq.

14 Por meio do NGS foi possível identificar 22 mutações patológicas em 33 pacientes diagnosticados com OI, apresentando ou não DGI. Um total de 18 mutações em heterozigose nos genes COL1A1 e COL1A2 foram identificadas neste estudo, sendo 9 mutações em COL1A1 previamente relatadas na literatura (7 missense, 1 nonsense e 1 frameshift), e 9 mutações missense em COL1A2 (6 já descrita anteriormente na literatura e 4 não relatadas, mas consideradas patogênicas de acordo com as análises in silico). Em quatro pacientes com história de consanguinidade foram identificadas mutações missense homozigóticas nos genes SERPINF1, P3H1 e CRTAP. Não foram encontradas mutações patogênicas nos genes estudados em 11 pacientes. Dos pacientes estudados, 21 apresentaram DGI. Alterações nos genes COL1A1 e COLA1A2 foram as mais frequentes, concordando com a literatura. Sete mutações não foram previamente relatas na literatura sugerindo serem mutações novas. A caracterização clínica revelou que todos os pacientes com DGI foram do tipo moderada. O estudo permitiu aos participantes um diagnóstico molecular através da técnica de NGS, podendo proporcionar para esses pacientes um aconselhamento genético adequado assim como um acompanhamento terapêutico mais preciso.

15 ABSTRACT CARNEIRO, Isadora Portelinha Moreira. Use of gene panel for next generation sequencing in the molecular diagnosis of imperfect osteogenesis Undergraduate Course Final Monograph (Undergraduate Course in Dentistry) Department of Dentistry, School of Health Sciences, University of Brasília. Osteogenesis imperfecta (OI) is a group of heterogeneous genetic conditions characterized mainly by bone fragility. OI is considered an related disorder and collagen structure and most cases (80-90%) are related to dominant mutations in COL1A1 and COL1A2, the genes encoding the collagen chains type 1 (COL1). In the last decade, mutations have been reported in at least 16 other genes associated with cases of autosomal recessive OI and one associated with chromosome X. Clinically, OI is characterized by skeletal and extra-skeletal disorder. The dentinogenesis imperfecta (DGI) is characterize bay dentin formation anomaly, and it is present in approximately 50% of cases of OI of types I to IV. The objective of this study was to identify pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI and to characterize the clinical and radiographic dental alterations of the patients diagnosed with DGI in treatment with bisphosphonate and in the Clinical Patients with Dental Developmental Anomalies of the University Hospital of Brasília. In order to characterize the dental manifestations, the medical records of these patients were analyzed. Genetic evaluation was performed through the development of NGS panel composed of 14 OI associated genes and analyzed using the Ion AmpliSeq platform. Through the NGS it was possible to identify 22 pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI, presenting or not with DGI. A total of 18 heterozygous mutations in the COL1A1 and COL1A2 genes were identified in this study, with 9 mutations in COL1A1 previously reported in the literature

16 (7 missense, 1 nonsense and 1 frameshift), and 9 missense mutations in COL1A2 (6 previously described in the literature and 4 not reported but considered pathogenic according to in silico analyzes). In four patients with a history of consanguinity, homozygous missense mutations were identified in the SERPINF1, P3H1 and CRTAP genes. No pathogenic mutations were found in the genes studied in 11 patients. Of the patients studied, 21 presented with DGI. Changes in the COL1A1 and COL1A2 genes were the most frequent, in concordance with the literature. Seven mutations have not previously been reported in the literature suggesting they are new mutations. Clinical characterization revealed that all patients with DGI were of the moderate type. The study allowed the participants a molecular diagnosis through the NGS technique. Molecular diagnosis will allow adequate genetic counseling as well as more precise therapeutic follow-up.

17 SUMÁRIO Artigo Científico Folha de Título Lista de Abreviaturas Resumo Abstract Introdução Materiais e Métodos Resultados Discussão Conclusão Referências Anexos Termo de consentimento livre e esclarecido Normas da Revista... 59

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19 19 ARTIGO CIENTÍFICO Este trabalho de Conclusão de Curso é baseado no artigo científico: CARNEIRO, Isadora Portelinha Moreira; SANTOS, Pollyanna Almeida Costa; Acevedo-Poppe, Ana Carolina. Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita Apresentado sob as normas de publicação da revista BONE

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21 21 FOLHA DE TÍTULO Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita Use of gene panel for next generation sequencing in the molecular diagnosis of imperfect osteogenesis Isadora Portelinha Moreira Carneiro 1,4 Pollyanna Almeida Costa dos Santos 2 Ana Carolina Acevedo-Poppe 3,4 1 Aluna de Graduação em Odontologia da Universidade de Brasília (UnB). 2 Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas (UNCISAL) 3 Laboratório de Histopatologia Bucal, Departamento de Odontologia, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília (UnB). 4 Clínica de Atendimento a pacientes portadores de anomalias dentárias. Correspondência: Profa. Dra. Ana Carolina Acevedo Poppe Campus Universitário Darcy Ribeiro - UnB - Faculdade de Ciências da Saúde - Departamento de Odontologia - CEP: Asa Norte - Brasília - DF acevpoppe@gmail.com / Telefone: (61)

22 22 LISTA DE ABREVIATURAS AD AR Autossômico dominante Autossômico recessive BMP1 Proteína morfogenética óssea 1 COL1A1 Colágeno tipo 1 cadeia alfa 1 COL1A2 Colágeno tipo 1 cadeia alfa 1 CREB3L1 CRTAP Proteína de ligação ao elemento responsivo a camp 3 como 1 Proteína associada à cartilagem DGI FKBP10 HUB Dentinogênese imperfeita Proteína de ligação a FK206 Hospital universitário de Brasília IFITM5 Proteína transmembranar induzida por interferão 5 LEPRE1 Proteoglicano enriquecido com prolina de leucina 1 MBTPS2 NGS Fator de transcrição ligado à membrana peptidase local 2 Sequenciamento de nova geração OI Osteogênese imperfeita P3H1 Prolil 3-hidroxilase 1 P4HB Prolil 4-hidroxilase beta PLOD2 Procollagen-lisina, 2 oxoglutarato 5-dioxigenase 2 PLS3 Plastin 3

23 23 PPIB Peptidilprolyl isomerase B SCN9A Subunidade alfa de canal de tensão de sódio 9 SEC24D SEC24 homólogo D, COPII componente de revestimento complexo SERPINF1 Serpin família F membro 1 SERPINH1 Serpin família H membro 1 SLC2A2 Família transportadora de soluto 2 SP7 Fator de transcrição 7 SPARC TMEM38B UnB proteína secretada ácida rica em cisteína Proteína transmembrana 38B Universidade de Brasília WNT1 Família de sítios de integração MMTV, membro 1

24 24 RESUMO Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita A osteogênese imperfeita (OI) é um grupo de condições genéticas heterogêneas e caracterizadas principalmente pela fragilidade óssea. A OI é considerada um transtorno relacionado à síntese e estrutura do colágeno e a maioria dos casos (80-90%) está relacionada a mutações dominantes no COL1A1 e COL1A2, genes que codificam as cadeias de colágeno tipo 1 (COL1). Na última década, foram relatadas mutações em pelo menos 16 outros genes associados a casos de OI autossômico recessivo e um ligado ao cromossomo X. Clinicamente, a OI é caracterizada por apresentar alterações esqueléticas e extraesqueléticas. A dentinogênese imperfeita (DGI), uma alteração na formação da dentina dentinária, está presente em aproximadamente 50% dos casos de OI dos tipos I a IV. O objetivo desse estudo foi identificar, pelo método de sequenciamento de nova geração (NGS), mutações patológicas em 33 pacientes diagnosticados com OI e caracterizar as alterações dentárias clínicas e radiográficas dos pacientes diagnosticados com DGI, em tratamento com bisfosfonato e em atendimento na Clínica de Pacientes Portadores de Anomalias de Desenvolvimento Dentário do Hospital Universitário de Brasília. Com a finalidade de caracterizar as manifestações dentárias, os prontuários desses pacientes foram analisados. A avaliação genética foi realizada por meio do desenvolvimento de um painel de NGS, composto de 14 genes associados à OI e a sua análise foi realizada utilizando a plataforma Ion AmpliSeq. Por meio do NGS foi possível identificar 22 mutações patológicas em 33 pacientes diagnosticados com OI, apresentando ou não DGI. Um total de 18 mutações em heterozigose nos genes

25 25 COL1A1 e COL1A2 foram identificadas neste estudo, sendo 9 mutações em COL1A1 previamente relatadas na literatura (7 missense, 1 nonsense e 1 frameshift), e 9 mutações missense em COL1A2 (6 já descrita anteriormente na literatura e 4 não relatadas, mas consideradas patogênicas de acordo com as análises in silico). Em quatro pacientes com história de consanguinidade foram identificadas mutações missense homozigóticas nos genes SERPINF1, P3H1 e CRTAP. Não foram encontradas mutações patogênicas nos genes estudados em 11 pacientes. Dos pacientes estudados, 21 apresentaram DGI. Alterações nos genes COL1A1 e COLA1A2 foram as mais frequentes, concordando com a literatura. Sete mutações não foram previamente relatas na literatura sugerindo serem mutações novas. A caracterização clínica revelou que todos os pacientes com DGI foram do tipo moderada. O estudo permitiu aos participantes um diagnóstico molecular através da técnica de NGS, podendo proporcionar para esses pacientes um aconselhamento genético adequado assim como um acompanhamento terapêutico mais preciso. Palavras-chave Osteogênese Imperfeita; Dentinogênese Imperfeita; COL1A1; COL1A2; Sequenciamento de Nova Geração. Relevância Clínica Apesar dos avanços nos estudos de biologia molecular, o diagnóstico de OI ainda é eminentemente clínico. Entretanto, os dados moleculares são de suma importância para permitir a classificação do tipo de OI dos pacientes com mais precisão. O conhecimento do gene envolvido na doença pode auxiliar na indicação do melhor acompanhamento odontológico. Além disso, o conhecimento das bases moleculares permite um maior

26 entendimento do padrão de herança da OI na população e melhor aconselhamento genético à família. 26

27 27 ABSTRACT Use of gene panel for next generation sequencing in the molecular diagnosis of imperfect osteogenesis Osteogenesis imperfecta (OI) is a group of heterogeneous genetic conditions characterized mainly by bone fragility. OI is considered an related disorder and collagen structure and most cases (80-90%) are related to dominant mutations in COL1A1 and COL1A2, the genes encoding the collagen chains type 1 (COL1). In the last decade, mutations have been reported in at least 16 other genes associated with cases of autosomal recessive OI and one associated with chromosome X. Clinically, OI is characterized by skeletal and extra-skeletal disorder. The dentinogenesis imperfecta (DGI) is characterize bay dentin formation anomaly, and it is present in approximately 50% of cases of OI of types I to IV. The objective of this study was to identify pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI and to characterize the clinical and radiographic dental alterations of the patients diagnosed with DGI in treatment with bisphosphonate and in the Clinical Patients with Dental Developmental Anomalies of the University Hospital of Brasília. In order to characterize the dental manifestations, the medical records of these patients were analyzed. Genetic evaluation was performed through the development of NGS panel composed of 14 OI associated genes and analyzed using the Ion AmpliSeq platform. Through the NGS it was possible to identify 22 pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI, presenting or not with DGI. A total of 18 heterozygous mutations in the COL1A1 and COL1A2 genes were identified in this study, with 9 mutations in COL1A1 previously reported in the literature (7 missense, 1 nonsense and 1 frameshift), and 9 missense mutations in COL1A2 (6 previously described in the literature and

28 28 4 not reported but considered pathogenic according to in silico analyzes). In four patients with a history of consanguinity, homozygous missense mutations were identified in the SERPINF1, P3H1 and CRTAP genes. No pathogenic mutations were found in the genes studied in 11 patients. Of the patients studied, 21 presented with DGI. Changes in the COL1A1 and COL1A2 genes were the most frequent, in concordance with the literature. Seven mutations have not previously been reported in the literature suggesting they are new mutations. Clinical characterization revealed that all patients with DGI were of the moderate type. The study allowed the participants a molecular diagnosis through the NGS technique. Molecular diagnosis will allow adequate genetic counseling as well as more precise therapeutic follow-up. Keywords Osteogenesis Imperfecta; Dentinogenesis Imperfecta; COL1A1; COL1A2; New Generation Sequencing. Clinical Relevance: Despite advances in molecular biology, the diagnosis of OI and DGI is still eminently clinical. However, molecular data are of great importance in order to better classify patients OI type. Knowledge of the molecular alterations involved in the disease can assist in the indication of the best dental management. In addition, knowledge of the molecular basis allows a better understanding of the inheritance pattern of OI in the population and better genetic counseling to the family.

29 INTRODUÇÃO A Osteogênese Imperfeita (OI) é um grupo de desordens genéticas raras (1: a 1: nascimentos) com grau variável de alterações congênitas no tecido conjuntivo resultando em fragilidade e deformidades óssea. As alterações esqueléticas incluem fragilidade ósseas, deformidades esqueléticas e ossos wormianos. Além disso, alterações extra-esqueléticas tais como esclera azulada, frouxidão ligamentar, hipotonia muscular, surdez precoce e dentinogênese imperfeita (DGI) são observadas em pacientes com OI. As manifestações clínicas da OI variam de casos leves com poucas fraturas e estatura normal a casos graves com letalidade perinatal. Os padrões de herança autossômico dominante (AD) e recessivo (AR) tem sido relatados, e mais recentemente herança ligada ao X, sendo o modo de herança autossômico dominante o mais frequente (90% AD, 10% AR) [1 3]. Em 1979 Sillence propôs uma classificação baseada nas características clínicas, radiológicas, hereditárias e na gravidade da doença em quatro tipos: o tipo I (OMIM # ) de OI é a forma mais leve e a mais comum da doença, geralmente não é detectada no nascimento, possui deformidades esqueléticas leves, pode apresentar esclera azulada e perda auditiva. O tipo II (OMIM # ) é letal no período perinatal ou sobrevivem por alguns meses. O tipo III (OMIM # ) é a forma mais grave dos que sobrevivem o período neonatal, é progressivamente deformante, possuem múltiplas fraturas, baixa estatura, face triangular, pode apresentar esclera azulada e DGI. O tipo IV (OMIM # 16620) apresenta deformidades de moderada a grave, a DGI pode ou não estar associada, e a esclera azulada podem estar presentes na infância desaparecendo com o decorrer dos anos [4]. A classificação de Sillence incluía apenas os casos com modo de herança autossômico dominante. Dessa forma, Em

30 Rauch e Glorieux diagnosticaram novos tipos de OI e adicionaram os tipos V (OMIM # ), VI (OMIM # ) e VII (OMIM # ) à classificação. A partir desses achados, outros estudos moleculares foram realizados e novos genes com modo de herança AR foram descobertos e incluídos na classificação da OI. Esses novos tipos não são causados por mutações nos genes COL1A1 (OMIM # ) e COL1A2 (OMIM # ). Na tabela 1 encontram-se todas as formas descritas, até o momento, de OI, com a forma de herança, genes envolvidos, fenótipo e características clínicas [5 7]. As evidências dos estudos moleculares tem demonstrado que os tipos de I a IV estão relacionados a mutações AD em genes que codificam as cadeias alfa 1 e alfa 2 do colágeno tipo 1 (COL1A1 e COL1A2) [8]. Variantes dominantes em IFITM5 (OMIM # ) e P4HB (OMIM # ) também foram descritas em alguns indivíduos afetados com herança autossômica dominante [1,9,10]. Na última década, foram relatadas mutações AR nos genes CRTAP (OMIM # ), LEPRE1 (OMIM # ), PPIB (OMIM # ), FKBP10 (OMIM # ), SERPINH1 (OMIM # ), PLOD2 (OMIM # ), SEC24D (OMIM # ), BMP1 (OMIM # ) e TMEM38B (OMIM # ) cujos produtos proteicos interagem e interferem na síntese do colágeno tipo 1 e no desenvolvimento ósseo, predispondo a distintos padrões de fragilidade óssea e evolução clínica [5,11]. Foram descritas também alterações em outros genes que não estão diretamente ligados à síntese do colágeno tipo 1, mas atuam na mineralização ou no desenvolvimento dos osteoblastos, entre esse grupo de genes estão CREB3L1 (OMIM # ), SERPINF1 (OMIM # ), SP7 (OMIM # ), SPARC (OMIM # ) e WNT1 (OMIM # ). Recentemente, um estudo identificou mais três mutações relacionadas à OI nos genes SCN9A (OMIM # ), NTRK1 (OMIM # ) e

31 31 SLC2A2 (OMIM # ) [2]. Variantes patológicas em PLS3 (OMIM # ) e MBTPS2 (OMIM # ) com modo de herança ligada ao X também foram relacionadas à OI [12]. Tabela 1. Tipos de OI, modo de herança, genes afetados características clínicas e presença de DGI. Tipo de OI I II III IV Herança AD AD AD AD Gene afetado COL1A1/ COL1A2 COL1A1/ COL1A2 COL1A1/ COL1A2 COL1A1/ COL1A2 DGI Fenótipo ósseo +/- Leve Característica clínica Poucas deformidades, esclera azul, perda auditiva - Grave Letal no período neonatal + +/- Moderado a grave Moderado/ grave Deformação óssea progressiva, esclera azul na infância Estatura baixa, deformações ósseas V AD IFITM5 - Moderado Calo ósseo, esclera azul VI AR SERPINF1 - Moderado/ grave VII AR CRTAP - Grave VIII AR LEPRE1/ P3H1 - Grave IX AR PPIB - Grave X AR SERPINH1 +/- Grave XI AR FKBP10 - Grave XII AR BMP1 - XIII AR SP7 - XIV AR WNT1 - Moderado/ grave Moderado/ grave Moderado/ grave Alteração no osso lamelar Osteocondrodisplasia, rizomelia, alteração no crescimento Displasia óssea grave, rizomelia Displasia óssea moderada a grave Macrocefalia, esclera azul, hipotonia generalizada Ossos wormianos, cifoescoliose, esclera azul, Coxa vara Alta quantidade de massa óssea, ossos wormianos Micrognatia, curvatura dos membros superiores e inferiores Escoliose, curvatura de ossos longos e wormiano

32 32 XV AR TMEM38B - Moderado Costelas finas, ossos wormianos XVI AR CREB3L1 - Grave Costelas frisadas, múltiplas fraturas no período neonatal Adaptado de Forlino e Marini AR: Autossômico recessivo; AD: Autossômico dominante; (+): presente; (-): ausente Manifestações extra-esqueléticas são relatadas nos estudos da OI, entre essas manifestações, a dentinogênese imperfeita (DGI) é uma das principais, estando presente em 50% dos pacientes que possuem OI dos tipos I a IV [13]. A DGI é um grupo de condições hereditárias, caracterizadas por uma estrutura anormal da dentina devido a distúrbios na formação, composição ou organização da matriz dentinária, apresenta modo de herança autossômico dominante e pode estar ou não associada à OI. A classificação de Shields (1979) estratificava as condições hereditárias da dentina em DGI tipo I, II, e III, e displasia dentinária em tipo I e II. Atualmente, uma classificação mais utilizada propõe que a DGI seja classificada em forma sindrômica e não-sindrômica [13,14]. A forma sindrômica de DGI está associada à OI, e pode manifestar-se de forma leve, moderada ou grave. As formas nãosindrômicas também se manifestam de forma leve a grave e correspondem, respectivamente, à displasia dentinária tipo II, DGI tipos II e III de Shields. Apesar dos tipos sindrômicos e nãosindrômicos de DGI serem geneticamente distintos as manifestações clínicas observadas na dentina são similares [14 16]. As dentições decídua e permanente podem ser afetadas, sendo a dentição decídua mais gravemente atingida. Alguns estudos mostram que mesmo que a dentição decídua tenha sido afetada, a permanente pode não apresentar DGI [13,14].

33 33 Clinicamente a DGI é caracterizada por apresentar coloração coronária opalescente variando entre cinza, marrom e amarelo, geralmente com atrições e desprendimento de esmalte. Radiograficamente, as coroas podem apresentar constrição cervical, coroas bulbosas, dismorfia da câmara pulpar (calcificação pulpar, obliteração ou câmara pulpar ampla), alterações na morfologia radicular (calcificação dos condutos radiculares, obliteração dos canais ou condutos radiculares amplos), sendo essas características consideradas patognomônicas para o diagnóstico de DGI. Essas características clínicas e radiográficas da DGI podem manifestarse de forma leve à grave [13,14]. Na maioria dos casos, a DGI é diagnosticada através de exames clínicos e radiográficos, entretanto, a ausência de manifestações clínicas e radiográficas não exclui a sua presença. Nestes casos, estudos demonstraram que a DGI pode ser diagnosticada por exames histológicos [17]. Variações no metabolismo do colágeno podem interferir no desenvolvimento dos ossos faciais alterando o desenvolvimento craniofacial desses pacientes, podendo apresentar desde face triangular com testa alargada a macrocefalia, bem como alterações no tamanho dos maxilares, resultando em maloclusões como mordida aberta anterior e posterior, mordida cruzada anterior e posterior, erupção ectópica e dentes impactados [15,18]. Um estudo realizado por O'Connell e Marini (1999) relatou que 70% de seus pacientes apresentaram maloclusão de classe III de Angle, provavelmente uma combinação de alterações esqueléticas com dentoalveolares. Dentre os pacientes, 32,5% apresentaram erupção ectópica de molares e 10% agenesia dentária. Recentemente Malmgres e colaboradores (2017) identificaram em 179 pacientes com OI

34 34 uma prevalência de 17% de agenesia dentária, sendo os prémolares os dentes mais acometidos em 91% dos casos [19]. As abordagens terapêuticas para a OI devem envolver um tratamento multidisciplinar que possibilite uma melhor inserção do paciente na sociedade. O ideal é combinar tratamentos não cirúrgicos para fortalecer a musculatura; cirúrgicos quando necessários para corrigir posicionamentos ósseos e prevenir fraturas; e a administração farmacológica de bisfosfonatos para aumentar a resistência mecânica dos ossos e diminuir o número de fraturas. O tratamento farmacológico da OI está relacionado com a gravidade da doença. Pacientes que apresentam a forma leve, na maioria dos casos, não necessitam realizar a infusão cíclica intravenosa de bisfosfonatos. Entretanto, nos casos de moderado a grave o tratamento padrão é a administração intravenosa de pamidronato dissódico, uma droga da classe dos bisfosfonatos introduzido na década de 90 como abordagem terapêutica para a OI. Este fármaco promove a inibição da reabsorção óssea, induzindo a apoptose dos osteoclastos. Esta terapia auxilia no aumento da densidade mineral óssea, reduzindo o número de fraturas e também melhora a força muscular, além de diminuir as dores ósseas e aumentar a resistência desses pacientes [3,8]. A portaria 2305/GM de 19 de dezembro de 2001, do Ministério da Saúde do Brasil (BRASIL, M. D. S. D. Portaria n 2305/GM), em 19 de dezembro de 2001 ( htm) designou à Fundação Universidade de Brasília/ Hospital Universitário de Brasília (FUB/HUB) como um dos Centros Nacionais de Referência para o tratamento da OI com administração do pamidronato dissódico. A partir de então, a equipe médica do Setor de Endocrinologia Pediátrica da Área da Medicina da Criança e do Adolescente da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília (FM/UnB/HUB), com o suporte das

35 35 equipes de genética, otorrinolaringologia e odontologia do HUB e as equipes de genética e ortopedia da Rede Sarah Kubitschek de Hospitais, vêm acompanhando crianças e adolescentes portadores de OI que residem no Distrito Federal e em outros Estados da Federação referidos para este centro. Desde 2002, todos os pacientes tratados com infusão cíclica intravenosa de pamidronato são encaminhados para o Projeto de Extensão de Ação Continuada "Atendimento a Pacientes Portadores de Anomalias de Desenvolvimento Dentário", na Divisão de Odontologia do HUB. Apesar dos avanços nos estudos moleculares, o diagnóstico de OI e DGI ainda é eminentemente clínico. Entretanto, os dados moleculares são de suma importância para permitir a classificação do tipo de OI dos pacientes com maior precisão. O conhecimento do gene envolvido na doença pode influenciar sobremaneira, na indicação do melhor acompanhamento odontológico, assim como na previsibilidade de sua evolução. Além disso, o conhecimento das bases moleculares permite saber o padrão de herança da OI em cada população e permite também, um melhor aconselhamento genético à família. O objetivo do estudo foi identificar, pelo método de sequenciamento de nova geração, variantes patológicas em pacientes diagnosticados com OI e caracterizar as alterações dentárias clínicas e radiográficas dos pacientes diagnosticados com dentinogênese imperfeita (DGI), em tratamento com bisfosfonato e em atendimento no Clinica de Anomalias Dentárias do Hospital Universitário de Brasília. 1.2 MATERIAIS E MÉTODOS Este estudo foi aprovado pelo comitê de Ética de Pesquisa em seres humanos (CEP/FS ). O Termo de

36 36 Consentimento Livre e Esclarecido foi apresentado a todos os sujeitos da pesquisa e assinado por seus responsáveis legais. Entre os anos de foram acompanhados 128 pacientes com OI no HUB. Atualmente 63 desses pacientes com diagnóstico de osteogênese imperfeita, apresentando ou não dentinogênese imperfeita, em tratamento com pamidronato dissódico no Serviço de Endocrinologia Pediátrica do HUB são acompanhados pelo Projeto de Extensão de Ação Continuada Atendimento a Pacientes Portadores de Anomalias de Desenvolvimento Dentário, na unidade de Saúde Bucal do HUB. O acompanhamento odontológico é realizado no período da internação desses pacientes no HUB para o tratamento com bisfosfonato, que ocorre regularmente a cada 2, 3 ou 4 meses de acordo com a idade. Informações referentes ao exame físico (extra e intrabucal), exames complementares (fotografias e radiografias panorâmicas e periapicais) foram coletadas de seus prontuários. Dados referentes à idade do paciente, sexo, tipo de OI, e manifestações bucais que caracterizam a DGI como: alterações de cor coronária, atrição, dismorfia da câmara pulpar, alterações morfológicas radiculares e lesões periapicais foram registradas a fim de caracterizar o fenótipo dentário daqueles pacientes com DGI. Durante a internação para infusão do pamidronato dissódico amostras de sangue venoso periférico de 63 pacientes foram coletadas e armazenadas em tubos contendo EDTA e encaminhadas para o Laboratório de Histopatologia Bucal, onde foi realizada a extração de DNA genômico pelo método salting out Método Puregene, seguida da sua quantificação no Nanovue Plus (GE ). Para extração de DNA, as células sanguíneas foram submetidas à centrifugação e incubadas com dois tampões de

37 37 lise celular. Após a incubação, as proteínas foram removidas por precipitação com 7.5M de acetato de amônia. O DNA foi precipitado com isopropanol, secado ao ar livre e ressuspendido em tampão de TE (10 mm Tris ph 7.8 e 1 mm EDTA). A concentração de DNA de cada amostra foi determinada, invidualmente, por espectrofotômetro (Nanovue Plus, GE Healthcare Life Sciences, USA). Um painel de genes por meio de sequenciamento de nova geração (NGS) foi feito para 14 genes associados à OI até o momento inicial da pesquisa. (Ion Personal Machine, Life Technologies) (Tabela 2). Tabela 2. Genes presentes no NGS, sua localização genômica. Gene Localização genômica COL1A1 17q21.33 COL1A2 7q21.3 CRTAP 3p22.3 LEPRE1 1p34.2 PPIB 15q22.31 FKBP10 17q21.2 SERPINF1 17p13.3 SERPINH1 11q13.5 SP7 12q13.13 IFITM5 11p12.5 BMP1 8p21.3 TMEM38B 9q31.2 WNT1 12q13.12 DSPP 4q22.1

38 38 Um total de 10 ng de DNA por amostra foi usado para enriquecimento por PCR multiplex. Os amplicons foram ligados aos adaptadores de sequenciamento com barcodes que permitem misturar as amostras para as etapas subsequentes. As bibliotecas das amostras com código de barras equalizadas foram reunidas. O pool de bibliotecas e o sequenciamento seguiram o protocolo do fabricante. Utilizou-se um Chip Ion 316v2 para sequenciamento das amostras. A realização deste experimento ocorreu na Universidade Católica de Brasília. Os dados do sequenciamento do painel foram analisados usando o programa Torrent Suite (version 5.0.4; Life Technologies) para as chamadas, alinhamentos e variantes usando a sequência genômica de referência (hg19) para os genes alvo. As chamadas de variantes foram anotadas usando Ion Reporter (version 4.0), que mostrou alterações de acordo com a localização, tipo de variante, dbsnps e resultados de programas in silico (Polyphen and SIFT). As variantes foram filtradas de acordo com os critérios: baixa qualidade da corrida, regiões homopolímeras de inserções/deleções, e desbalanço alélico na proporção maior que 80:20. Mutações patogênicas foram também testadas pelas análises in silico MutationTaster, Poyphen e SIFT. As regiões sequenciadas tiveram uma cobertura de 98%. 1.3 RESULTADOS O sequenciamento de nova geração (NGS) foi realizado em 33 pacientes, em virtude de ser um experimento com alto custo e não dispormos de financiamento, no momento, para realizar em todos os pacientes. A distribuição de acordo com idade, tipo de OI e presença de DGI dos pacientes que participaram do NGS está resumida na Tabela 3.

39 39 Tabela 3. Distribuição dos pacientes de acordo com tipo de OI, idade e presença de DGI. Tipo de OI Faixa etária (anos) DGI Total >18 I II NR 1 III IV Total NR: dado não relatado As análises das amostras foram divididas em três experimentos separados. No primeiro experimento foram sequenciadas 16 amostras, no segundo foram dez amostras, e no terceiro experimento foram analisadas 12 amostras, totalizando 38 amostras. O número maior de amostras enviadas para análise foi devido ao fato de que cinco pacientes tiveram suas análises repetidas. Alterações no gene COLA1 foram identificadas em nove pacientes, sendo oito mutações já relatadas na literatura e uma alteração frameshift não relatada na literatura, mas considerada patogênica de acordo com SIFT, POLYPHEN 2 e Mutation Taster. (Tabela 4) No gene COL1A2 foram identificadas nove alterações, sendo que seis possuem relatos na literatura e três não foram relatadas, mas consideradas patogênicas de acordo com as análises in silico nos programas SIFT, POLYPHEN 2 e Mutation Taster. (Tabela 5) Nos genes com modo de herança AR foram identificadas quatro alterações das quais duas não apresentam relatos na literatura, mas foram consideradas patogênicas de acordo com

40 40 as análises in silico nos programas SIFT, POLYPHEN 2 e Mutation Taster. (Tabela 6) Em onze pacientes não foram encontradas mutações patogênicas envolvidas com OI, ou por falha técnica ou por limitações do painel de genes. Desses, em sete pacientes não foi possível identificar a mutação causadora da doença por falha da técnica, uma vez que as mesmas impediram a análise dos dados por apresentarem baixa cobertura, e em quatro pacientes não foram encontradas alterações nos genes estudados. Do total de 33 pacientes testados, 21 apresentaram características clínicas e radiográficas de DGI, e uma paciente que foi a óbito aos três meses de idade não foi possível avaliar a presença de DGI. As alterações dentinárias clínicas e radiográficas da dentição decídua e permanente dos pacientes com OI/DGI que participaram do estudo molecular estão resumida na Tabela 7A e 7B respectivamente.

41 Tabela 4. Mutações identificadas de pacientes com alterações no gene COL1A1 atendidos na Clínica de Pacientes Portadores de Anomalias Dentárias do HUB. Paciente Tipo OI DGI Exon DNA dbsnp Proteína Referência 1 III + 17 c.1121g>c NR p.gly374ala [5] 2 III + 45 c.3226g>a rs p.gly1076ser [6,9,20 23] 3 III + 45 c.3226g>a rs p.gly1076ser [6,9,20 23] 4 I + 45 c.3226g>a rs p.gly1076ser [6,9,20 23] 5 I - 11 c.757c>t rs p.arg253ter [6,24 26] 6 III - 8 c.642+1g>a rs NR [20,27,28] 7 III + 33 c.2299g>a rs p.gly767ser [20,24,26,29,30] 8 IV - 26 c g>a rs NR [6,20,31 33] 9* III - 3 C.299_300delAG Rs p.glu100fs NR *paciente com efeito da mutação frameshift. (-) ausência de DGI; (+) presença de DGI; NR: não relatado 41

42 42 Tabela 5. Mutações identificadas de pacientes com alterações no gene COL1A2 atendidos na Clínica de Pacientes Portadores de Anomalias Dentárias do HUB. Paciente Tipo OI DGI Exon DNA dbsnp Proteína Referências 10 III + 49 c.3269g>a rs p.gly1090asp [34] 11 IV + 26 c.1549g>a rs p.gly517ser [20] 12 III + 20 c.1072g>a rs p.gly358ser [9,20,35 37] 13 III + 20 c.1072g>a rs p.gly358ser [9,20,35 37] 14 III + 28 c.1657g>t NR p.gly553cys NR 15 III + 46 c.3034g>a rs p.gly1012ser [5,6,20,35,38 40] 16 III + 47 c.3142g>a NR p.gly1048ser NR 17 IV + 28 c.1612g>a NR p.gly538ser NR 18 I - 12 c.577g>c NR p.gly193arg NR (-) ausência de DGI; (+) presença de DGI; NR: não relatado.

43 Tabela 6. Mutações AR identificadas nos pacientes com OI atendidos na Clínica de Pacientes Portadores de Anomalias Dentárias do HUB. Tipo Paciente DGI Gene Exon DNA dbsnp Proteína Referências OI 19 III - P3H1 5 c g>t rs NR [45-47] 20 I - SERPINF1 3 c.283+2t>c NR NR NR 21 III - CRTAP 1 c.471+2c>a rs NR [41, 47] 22 III - CRTAP 1 c.452t>c NR p.leu151pro NR (-) ausência de DGI; (+) presença de DGI; NR não relatado 43

44 Tabela 7A: Avalição das características clínicas e radiográficas da dentição decídua dos pacientes com OI/DGI que participaram do estudo molecular. 44 Paciente Idade Alteração da cor coronária Coroa bulbosa/ constrição cervical Atrição Dismorfia da camara pulpar Alteração na morfologia radicular Lesão periapical NR - NR NR NR + NR NR NR: não relatado, paciente na dentição decídua. (+) presença; (-) Ausência

45 Tabela 7B: Avalição das características clínicas e radiográficas da dentição permanente dos pacientes com OI/DGI que participaram do estudo molecular. Paciente Idade Alteração da cor coronária Coroa bulbosa/ constrição cervical Atrição Dismorfia da camara pulpar Alteração na morfologia radicular Lesão periapical 1 6 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR 11 4 NR NR NR NR NR NR 12 2 NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR: não relatado, paciente na dentição decídua. (+) presença; (-) Ausência 45

46 DISCUSSÃO No presente trabalho foram analisados, por meio do sequenciamento de nova geração, amostras de 33 pacientes diagnosticados com OI em acompanhamento no Projeto de Extensão de Ação Continuada Atendimento a Pacientes Portadores de Anomalias de Desenvolvimento Dentário, na divisão de Odontologia do HUB entre os anos de No HUB, todos os pacientes com OI em tratamento com bisfosfonato, são encaminhados do serviço de endocrinologia pediátrica para acompanhamento na clínica de odontologia. O acompanhamento odontológico acontece durante o período de internação para administração do bisfosfonato, que geralmente ocorre a cada dois, três ou quadro meses de acordo com a idade dos paciente. Os atendimentos foram realizados em função da necessidade desses pacientes, os procedimentos mais realizados foram: profilaxias, orientações sobre a dieta e higiene oral, adequação do meio bucal e restaurações. A amostra desse estudo é principalmente de pacientes com OI do tipo grave ou moderado (tipo III ou IV), isso ocorre por serem os tipos que mais necessitam de tratamento com o bisfosfonato. Nesse estudo, 21 dos pacientes possuem DGI, entretanto, alguns autores sugerem que a falta de alterações clínicas e radiográficas da DGI não determina a sua ausência, pois exames histológicos podem diagnosticar a presença da DGI. [17]. Para esse estudo, a avaliação foi exclusivamente clínica e radiográfica e revelou que os pacientes com DGI possuíam alterações do tipo moderada, com coloração coronária opalescente, coroas bulbosas e curtas, atrição com

47 47 desprendimento de esmalte, raízes mais curtas e finas com obliteração parcial ou total da polpa. Não foi observada presença de lesões periapicais descritas anteriormente nos casos de DGI do tipo grave [16]. Os resultados revelaram também que a dentição decídua dos pacientes foi mais gravemente afetada em relação à dentição permanente, os dentes decíduos apresentaram características clínicas e radiográficas com alterações de moderada a grave, enquanto que os dentes permanentes apresentaram alterações de leve a grave, concordando com o descrito na literatura [14 16]. Os casos leves apresentaram uma discreta alteração na coloração dos dentes, pouca ou nenhuma atrição e radiograficamente apresentaram alterações leves ou ausentes. Numerosos estudos tem demonstrado que diversos genes estão envolvidos na patogênese da OI. Até o momento, variantes patogênicas em COL1A1, COL1A2, CRTAP, LEPRE1, PPIB, FKBP10, SERPINF1, SERPINH1, SP7, IFITM5, BMP1, TMEM38B e WNT1 tem sido relatados na literatura. Mutações nos genes COL1A1 e COL1A2 estão associadas a 85-90% dos casos de OI, sendo estas de herança autossômica dominante [10]. Variantes dominantes em IFITM5 também têm sido descritas em alguns indivíduos afetados [1,9,10]. Outro grupo de genes que não estão implicados diretamente na biossíntese de colágeno tipo 1, no entanto, são genes importantes nas vias de mineralização ou desenvolvimento de osteoblastos, como CREB3L1 e SPARC foram recentemente associados à OI [12, 41]. Mutações em PLS3 e MBTPS2 têm sido associadas a formas distantes de herança ligada ao X [12,41]. Um estudo recente ainda identificou mais três mutações relacionadas à OI, sendo elas nos genes SCN9A, NTRK1 e SLC2A2 [2]. Essas novas variações foram relatadas na literatura após a elaboração do painel de genes utilizado nesse estudo.

48 48 O colágeno tipo 1 consiste em duas cadeias α1 e uma cadeia α2. Após a tradução, as cadeias pro-α1 e as cadeias proα2 são processadas no retículo endoplasmático rugoso. Estas cadeias têm de se alinhar para iniciar o processo de dobragem do pro-colágeno tipo I numa tripla hélice, seguindo do alinhamento das três cadeias para iniciar a conformação em uma estrutura helicoidal tripla. Cada cadeia α contém pro-peptídeos N- (amino) e C- (carboxi) terminais e um domínio central constituído por 338 repetições. A glicina, como o menor aminoácido, é o único resíduo que pode ocupar a posição axial da tripla hélice, de modo que qualquer alteração num resíduo de glicina resultará na ruptura da estrutura helicoidal do colágeno. Mutações nos genes COL1A1 e COL1A2 alteram a estrutura ou a quantidade de colágeno tipo 1, resultando em um fenótipo esquelético que varia de leve a letal. Quando há uma substituição da glicina na cadeia α1, o fenótipo dependerá da posição da substituição: as substituições C-terminais resultam em fenótipo de doença grave, e as substituições N-terminais produzem fenótipos mais leves [1,3,42]. As mutações em CO1A1 e COLIA2 encontradas nesse estudo são quase todas, substituição do aminoácido glicina por outro, sendo a serina a mais frequente (Tabela 4 e 5). Segundo Marini (2007) a substituição do aminoácido glicina por outro aminoácido geralmente causam OI grave ou moderada resultando em efeito qualitativo. Os resultados desse estudo estão de acordo com o relatado na literatura, 10 pacientes apresentaram substituição de glicina por serina, sendo pacientes portadores dos tipos mais graves de OI (tipo III e IV). Recentemente, dois estudos foram publicados relatando os genes SERPINF1, seguido do CRTAP como os genes mais frequentemente alterados em OI com modo de herança AR. Nesse estudo foram encontradas mutações AR nos genes CRTAP (exon1 c.452t>c; exon1 c.471+2c>a) e SERPINF1

49 49 (exon3 c T>C) em três pacientes com histórico de consanguinidade (Tabela 6), corroborando com os achados da literatura [2,43]. Inicialmente esses casos foram classificados em tipo I e III de acordo Sillence. O NGS permitiu redefinir o diagnóstico para esses pacientes de acordo com Forlino e Marini (2016) em tipo VII para as alterações em CRTAP e tipo VI para a variação em SERPINF1. Devido ao experimento ter um alto custo, não foi possível analisar os 63 pacientes, os outros 30 pacientes serão analisados no âmbito do mestrado. Uma vez que a cobertura do painel de genes para sequenciamento de nova geração possuiu uma cobertura de 98%, os pacientes que ficaram sem diagnóstico molecular podem ter alguma alteração nesta região que não foi contemplada pela técnica utilizada. Uma estratégia para resolver esta questão seria sequenciar por Sanger apenas as regiões não cobertas (2%), e verificar a presença ou não de mutação de ponto. Outra hipótese seria de que esses pacientes apresentam mutações em outros genes não investigados nesse estudo e associados recentemente na literatura a mutações potencialmente causadoras da OI. 1.5 CONCLUSÃO O presente estudo mostrou que a maioria dos pacientes atendidos na Clínica de Portadores de Anomalias do desenvolvimento Dentário entre os anos de possuíam OI do tipo III. Por meio do sequenciamento de nova geração foi possível identificar vinte e duas mutações patológicas em trinta e três pacientes diagnosticados com OI, sendo que para seis mutações não foram encontrados relatos na literatura sugerindo serem mutações novas, entretanto, as outras mutações encontradas estão de acordo com o relatado na literatura. Foi possível também caracterizar as alterações clínicas e

50 radiográficas dos pacientes que participaram do NGS mostrando que 21 pacientes possuíam manifestações clínicas e radiográficas de DGI e em um paciente não foi possível identificar clinicamente devido ao seu óbito precoce. A caracterização revelou também que a amostra estudada é predominantemente de DGI do tipo moderada, sendo a dentição decídua mais gravemente afetada em relação a dentição permanente. A importância de descobrir essas variantes possibilita tornar o diagnóstico molecular um método mais sensível e preciso para esses pacientes. Será necessário investigar as regiões não sequenciadas no painel pelo método Sanger assim como serão relacionados os sequenciamentos dos pacientes sem diagnóstico molecular até o presente. 50

51 51 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] A. Forlino, J.C. Marini, Osteogenesis imperfecta, Lancet. 387 (2016) doi: /s (15)00728-x. [2] J.A. Caparros-Martin, M.S. Aglan, S. Temtamy, G.A. Otaify, M. Valencia, J. Nevado, E. Vallespin, A. Del Pozo, C. Prior de Castro, L. Calatrava-Ferreras, P. Gutierrez, A.M. Bueno, B. Sagastizabal, E. Guillen-Navarro, M. Ballesta-Martinez, V. Gonzalez, S.Y. Basaran, R. Buyukoglan, B. Sarikepe, C. Espinoza-Valdez, F. Cammarata-Scalisi, V. Martinez-Glez, K.E. Heath, P. Lapunzina, V.L. Ruiz-Perez, Molecular spectrum and differential diagnosis in patients referred with sporadic or autosomal recessive osteogenesis imperfecta, Mol. Genet. Genomic Med. 5 (2017) doi: /mgg [3] J.C. Marini, A. Reich, S.M. Smith, Osteogenesis imperfecta due to mutations in non-collagenous genes: lessons in the biology of bone formation., Curr. Opin. Pediatr. 26 (2014) doi: /mop [4] D.O. Sillence, A. Senn, D.M. Danks, Genetic heterogeneity in osteogenesis imperfecta., J. Med. Genet. 16 (1979) doi: /jmg [5] J. Stephen, K.M. Girisha, A. Dalal, A. Shukla, H. Shah, P. Srivastava, U. Kornak, S.R. Phadke, Mutations in patients with osteogenesis imperfecta from consanguineous Indian families, Eur. J. Med. Genet. 58 (2015) doi: /j.ejmg [6] K. Lindahl, E. Åström, C.-J. Rubin, G. Grigelioniene, B. Malmgren, Ö. Ljunggren, A. Kindmark, Genetic epidemiology, prevalence, and genotype-phenotype correlations in the Swedish population with osteogenesis imperfecta., Eur. J. Hum. Genet. 23 (2015) doi: /ejhg [7] F. Rauch, F.H. Glorieux, Osteogenesis imperfecta., Lancet (London, England). 363 (2004) doi: /s (04)

52 52 [8] F.S. Van Dijk, J.M. Cobben, A. Kariminejad, A. Maugeri, P.G.J. Nikkels, R.R. Van Rijn, G. Pals, Osteogenesis imperfecta: A review with clinical examples, Mol. Syndromol. 2 (2011) doi: / [9] F. Rauch, L. Lalic, F.H. Glorieux, P. Moffatt, P. Roughley, Targeted sequencing of a pediatric metabolic bone gene panel using a desktop semiconductor next-generation sequencer., Calcif. Tissue Int. 95 (2014) doi: /s [10] H. Kang, S. Aryal A.C., J.C. Marini, Osteogenesis imperfecta: new genes reveal novel mechanisms in bone dysplasia, Transl. Res. (2016). doi: /j.trsl [11] J.C. Marini, A.R. Blissett, New Genes in Bone Development: What s New in Osteogenesis Imperfecta, J. Clin. Endocrinol. Metab. 98 (2013) doi: /jc [12] U. Lindert, W.A. Cabral, S. Ausavarat, S. Tongkobpetch, K. Ludin, A.M. Barnes, P. Yeetong, M. Weis, B. Krabichler, C. Srichomthong, E.N. Makareeva, A.R. Janecke, S. Leikin, B. Röthlisberger, M. Rohrbach, I. Kennerknecht, D.R. Eyre, K. Suphapeetiporn, C. Giunta, J.C. Marini, V. Shotelersuk, MBTPS2 mutations cause defective regulated intramembrane proteolysis in X-linked osteogenesis imperfecta., Nat. Commun. 7 (2016) doi: /ncomms [13] M. Chetty, T. Roberts, L.X.G. Stephen, P. Beighton, Hereditary dentine dysplasias: terminology in the context of osteogenesis imperfecta, Bdj. 221 (2016) doi: /sj.bdj [14] M. de La Dure-Molla, B. Philippe Fournier, A. Berdal, Isolated dentinogenesis imperfecta and dentin dysplasia: revision of the classification., Eur. J. Hum. Genet. 23 (2014) doi: /ejhg [15] a C. O Connell, J.C. Marini, A.C.O. Connell, B. Sc, J.C. Marini, Evaluation of oral problems in an osteogenesis imperfecta population., Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral

53 53 Radiol. Endod. 87 (1999) doi: /s (99) [16] E.D. Shields, D. Bixler, A.M. El-Kafrawy, A proposed classification for heritable human dentine defects with a description of a new entity, Arch. Oral Biol. 18 (1973) doi: / (73) [17] J. Waltimo, A. Ojanotko-Harri, P.L. Lukinmaa, Mild forms of dentinogenesis imperfecta in association with osteogenesis imperfecta as characterized by light and transmission electron microscopy, J. Oral Pathol. Med. 25 (1996) [18] J. Rizkallah, S. Schwartz, F. Rauch, F. Glorieux, D.D. Vu, K. Muller, J.M. Retrouvey, Evaluation of the severity of malocclusions in children affected by osteogenesis imperfecta with the peer assessment rating and discrepancy indexes, Am. J. Orthod. Dentofac. Orthop. 143 (2013) doi: /j.ajodo [19] B. Malmgren, K. Andersson, K. Lindahl, A. Kindmark, G. Grigelioniene, V. Zachariadis, G. Dahllöf, E. Åström, Tooth agenesis in osteogenesis imperfecta related to mutations in the collagen type I genes, Oral Dis. 23 (2017) doi: /odi [20] J.C. Marini, W.A. Cabral, A.M. Barnes, W. Chang, Components of the collagen prolyl 3-hydroxylation complex are crucial for normal bone development, Cell Cycle. 6 (2007) doi: /cc [21] Z.L. Zhang, H. Zhang, Y.H. Ke, H. Yue, W.J. Xiao, J.B. Yu, J.M. Gu, W.W. Hu, C. Wang, J.W. He, W.Z. Fu, The identification of novel mutations in COL1A1, COL1A2, and LEPRE1 genes in Chinese patients with osteogenesis imperfecta, J. Bone Miner. Metab. 30 (2012) doi: /s [22] E. Barkova, U. Mohan, D. Chitayat, S. Keating, A. Toi, J. Frank, R. Frank, G. Tomlinson, P. Glanc, Fetal skeletal

54 54 dysplasias in a tertiary care center: Radiology, pathology, and molecular analysis of 112 cases, Clin. Genet. 87 (2015) doi: /cge [23] a M. Lund, a C. Nicholls, M. Schwartz, F. Skovby, Parental mosaicism and autosomal dominant mutations causing structural abnormalities of collagen I are frequent in families with osteogenesis imperfecta type III/IV., Acta Paediatr. 86 (1997) doi: /j tb08573.x. [24] L. Ries-Levavi, T. Ish-Shalom, M. Frydman, D. Lev, S. Cohen, G. Barkai, B. Goldman, P. Byers, E. Friedman, Genetic and biochemical analyses of Israeli osteogenesis imperfecta patients., Hum. Mutat. 23 (2004) doi: /humu [25] G. Venturi, E. Tedeschi, M. Mottes, M. Valli, M. Camilot, S. Viglio, F. Antoniazzi, L. Tatò, Osteogenesis imperfecta: clinical, biochemical and molecular findings., Clin. Genet. 70 (2006) doi: /j x. [26] L. Mauri, S. Uebe, H. Sticht, U. Vossmerbaeumer, N. Weisschuh, E. Manfredini, E. Maselli, M. Patrosso, R.N. Weinreb, S. Penco, A. Reis, F. Pasutto, Expanding the clinical spectrum of COL1A1 mutations in different forms of glaucoma, Orphanet J. Rare Dis. 11 (2016) 108. doi: /s y. [27] U. Schwarze, B.J. Starman, P.H. Byers, Redefinition of exon 7 in the COL1A1 gene of type I collagen by an intron 8 splicedonor-site mutation in a form of osteogenesis imperfecta: influence of intron splice order on outcome of splice-site mutation., Am. J. Hum. Genet. 65 (1999) doi: / [28] H.-Y. Lin, C.-K. Chuang, Y.-N. Su, M.-R. Chen, H.-C. Chiu, D.-M. Niu, S.-P. Lin, Genotype and phenotype analysis of Taiwanese patients with osteogenesis imperfecta., Orphanet J. Rare Dis. 10 (2015) 152. doi: /s [29] A. Forlino, F. Zolezzi, M. Valli, P.F. Pignatti, G. Cetta, P.C.

55 55 Brunelli, M. Mottes, Severe (type III) osteogenesis imperfecta due to glycine substitutions in the central domain of the collagen triple helix, Hum. Mol. Genet. 3 (1994) doi: /hmg/ [30] H. Zhang, R. Yang, Y. Wang, J. Ye, L. Han, W. Qiu, X. Gu, A pilot study of gene testing of genetic bone dysplasia using targeted next-generation sequencing., J. Hum. Genet. 60 (2015) doi: /jhg [31] M.L. Stover, D. Primorac, S.C. Liu, M.B. McKinstry, D.W. Rowe, Defective splicing of mrna from one COL1A1 allele of type I collagen in nondeforming (type I) osteogenesis imperfecta, J. Clin. Invest. 92 (1993) doi: /jci [32] J. Körkkö, H. Kuivaniemi, P. Paassilta, J. Zhuang, G. Tromp, A. DePaepe, D.J. Prockop, L. Ala-Kokko, Two new recurrent nucleotide mutations in the COL1A1 gene in four patients with osteogenesis imperfecta: About one-fifth are recurrent, Hum. Mutat. 9 (1997) doi: /(sici) (1997)9:2<148::aid-humu7>3.0.co;2-5. [33] C. Johnson, D. Primorac, M. McKinstry, J. McNeil, D. Rowe, J.B. Lawrence, Tracking Col1a1 RNA in Osteogenesis Imperfecta, J. Cell Biol. 150 (2000) [34] E. Faqeih, P. Roughley, F.H. Glorieux, F. Rauch, Osteogenesis Imperfecta Type III With Intracranial Hemorrhage and Brachydactyly Associated With Mutations in Exon 49 of COL1A2, (2009) doi: /ajmg.a [35] K.-S. Lee, H.-R. Song, T.-J. Cho, H.J. Kim, T.-M. Lee, H.-S. Jin, H.-Y. Park, S. Kang, S.-C. Jung, S.K. Koo, Mutational spectrum of type I collagen genes in Korean patients with osteogenesis imperfecta, Hum. Mutat. 27 (2006) doi: /humu [36] W. Kishta, F.H. Abduljabbar, M. Gdalevitch, F. Rauch, R. Hamdy, F. Fassier, Hip Dysplasia in Children With

56 56 Osteogenesis Imperfecta: Association With Collagen Type I C-Propeptide Mutations, J. Pediatr. Orthop. 0 (2015) 1 5. doi: /bpo [37] A. Taillandier, C. Domingues, C. De Cazanove, V. Porquet- Bordes, S. Monnot, T. Kiffer-Moreira, A. Rothenbuhler, P. Guggenbuhl, C. Cormier, G. Baujat, F. Debiais, Y. Capri, M. Cohen-Solal, P. Parent, J. Chiesa, A. Dieux, F. Petit, J. Roume, M. Isnard, V. Cormier-Daire, A. Linglart, J.L. Mill??n, J.P. Salles, C. Muti, B. Simon-Bouy, E. Mornet, Molecular diagnosis of hypophosphatasia and differential diagnosis by targeted Next Generation Sequencing, Mol. Genet. Metab. 116 (2015) doi: /j.ymgme [38] R. Sztrolovics, F.H. Glorieux, M. Van Der Rest, P.J. Roughley, Identification of type I collagen gene (COL1A2) mutations in nonlethal osteogenesis imperfecta, Hum. Mol. Genet. 2 (1993) doi: /hmg/ [39] a Forlino, E. D amato, M. Valli, G. Camera, E. Hopkins, J.C. Marini, G. Cetta, D. a Coviello, Phenotypic comparison of an osteogenesis imperfecta type IV proband with a de novo alpha2(i) Gly922 --> Ser substitution in type I collagen and an unrelated patient with an identical mutation., Biochem. Mol. Med. 62 (1997) doi: /bmme [40] H. Hartikka, K. Kuurila, J. Körkkö, I. Kaitila, R. Grénman, S. Pynnönen, J.C. Hyland, L. Ala-Kokko, Lack of correlation between the type of COL1A1 or COL1A2 mutation and hearing loss in osteogenesis imperfecta patients, Hum. Mutat. 24 (2004) doi: /humu [41] F.S. van Dijk, P.H. Byers, R. Dalgleish, F. Malfait, A. Maugeri, M. Rohrbach, S. Symoens, E.A. Sistermans, G. Pals, EMQN best practice guidelines for the laboratory diagnosis of osteogenesis imperfecta., Eur. J. Hum. Genet. 20 (2012) doi: /ejhg [42] E.R. Valadares, T.B. Carneiro, P.M. Santos, A.C. Oliveira, B. Zabel, What is new in genetics and osteogenesis imperfecta classification?, J. Pediatr. (Rio. J). 90 (2014)

57 57 doi: /j.jped [43] G. Bardai, P. Moffatt, F.H. Glorieux, F. Rauch, DNA sequence analysis in 598 individuals with a clinical diagnosis of osteogenesis imperfecta: diagnostic yield and mutation spectrum, Osteoporos. Int. 27 (2016) doi: /s

58 58 ANEXOS TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ANEXOS