UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO. Gabrielli de Oliveira Vaz

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1 UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO FACULDADE DE ENGENHARIA E ARQUITETURA CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL Gabrielli de Oliveira Vaz PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Bacillus pumilus USANDO FARELO DE TRIGO COMO SUBSTRATO Passo Fundo, 2013.

2 1 Gabrielli de Oliveira Vaz Produção de biossurfactante por Bacillus pumilus usando farelo de trigo como substrato Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Engenharia Ambiental, como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Engenheiro Ambiental. Orientador: Profª. Dra. Luciane Maria Colla Passo Fundo, 2013.

3 2 Gabrielli de Oliveira Vaz Produção de biossurfactante por Bacillus pumilus usando farelo de trigo como substrato Trabalho de Conclusão de Curso como requisito parcial para a obtenção do título de Engenheiro Ambiental Curso de Engenharia Ambiental da Faculdade de Engenharia e Arquitetura da Universidade de Passo Fundo. Aprovado pela banca examinadora: Orientador: Luciane Maria Colla, Dra. Faculdade de Engenharia e Arquitetura, UPF Faculdade de Engenharia e Arquitetura, UPF Vandré Barbosa Brião, Dr. Faculdade de Engenharia e Arquitetura, UPF Passo Fundo, 4 de novembro de 2013.

4 3 A T E S T A D O Atesto para os devidos fins que a aluna Gabrielli de Oliveira Vaz, autor do Trabalho de Conclusão intitulado Produção de biossurfactante por Bacillus pumilus usando farelo de trigo como substrato realizou as alterações sugeridas pela banca examinadora no relatório final. Passo Fundo, 29 de novembro de Profª. Dra. Luciane Maria Colla

5 4 AGRADECIMENTOS Eu não sei a quem agradecer primeiro, e a ordem aqui, não tem maior ou menor grau de importância, eu apenas quero agradecer de todo o meu coração a quem de alguma maneira me ajudou na construção deste trabalho. Primeiramente agradecer a Deus e a Nossa Senhora Aparecida pela vida, e por me protegerem e iluminarem os meus caminhos. Agradecer por todo o esforço, dedicação, apoio e amor dos meus pais Loreci de Oliveira Vaz e Adão de Oliveira Vaz em todos os momentos da minha vida. Agradecer a toda a minha família, em especial a minha avó Tereza, pelo total apoio nos estudos e por sempre estarem presentes. Ao meu namorado Rodrigo, por todo o amor, carinho, companheirismo, cuidado e principalmente paciência, sempre. Agradeço aos professores que contribuíram para o meu crescimento e por todo o conhecimento passado durante o meu período acadêmico, em especial a minha orientadora Professora Doutora Luciane Maria Colla, pela atenção, paciência e ajuda. Ao Iziquiel Cecchin e ao Professor Cleomar pela ajuda. Agradecer a amiga Marilda Ferreira dos Santos Zanfir, por toda a ajuda, paciência e amizade, obrigada por todo o conhecimento laboratorial passado e por fazer parte da minha vida. Ao estudante Rafael Braido pela ajuda e minutos cedidos. A Ellen Rodrigues pelo conhecimento passado, que possibilitou a execução deste trabalho.

6 5 A todos os meus colegas de graduação, pela amizade e companheirismo. A todos, os meus sinceros agradecimentos!

7 6 RESUMO A biorremediação é um processo biotecnológico que utiliza o metabolismo de microrganismos para eliminação rápida de poluentes presentes no ambiente ou a sua redução a níveis de concentração aceitáveis. Uma das técnicas de biorremediação de resíduos oleosos consiste no uso de biossurfactantes, os quais são metabólitos microbianos que tem por função a de diminuir a tensão superficial e interfacial formando microemulsões entre os resíduos oleosos e água, facilitando o processo de absorção do contaminante pelo microrganismo para posterior degradação. O custo de produção de biossurfactantes é aproximadamente de 3 a 10 vezes maior que o custo de surfactantes químicos. Para a produção de biossurfactantes, o uso de substratos mais baratos e solúveis em água, como por exemplo, os resíduos agroindustriais, como o farelo de trigo, são alternativas que podem viabilizar a produção e consequentemente reduzir custos. Objetivou-se utilizar o farelo de trigo como um substrato alternativo para a produção em estado submerso de biossurfactante, utilizando para produção a bactéria Bacillus pumilus. A produção foi realizada em meio base composto por farelo de trigo com a adição de indutores (óleo diesel, gasolina e biodiesel) e fontes de nitrogênio (NH 4 NO 3, ureia e NaNO 2 ). A produção de biossurfactantes foi avaliada pela determinação da tensão superficial nos meios fermentados livres de células e através, das atividades emulsificantes A/O (água/óleo) e O/A (óleo/água). O biossurfactante produzido foi capaz de reduzir a tensão superficial até 37 mn/m quando utilizado óleo diesel como indutor e ureia como fonte de nitrogênio. As melhores atividades emulsificantes A/O foram obtidas quando utilizado o indutor biodiesel e ureia como fonte de nitrogênio. As maiores atividades O/A foram obtidas com óleo diesel como indutor e ureia como fonte de nitrogênio. Conclui-se que, o farelo de trigo pode ser usado como substrato para a produção de biossurfactante utilizando como produtor a bactéria Bacillus pumilus. Palavras-chave: Biorremediação, fonte de nitrogênio, indutor.

8 7 ABSTRACT Bioremediation is a biotechnological process which utilizes the metabolism of microorganisms for rapid elimination of pollutants present in the environment or reduction to acceptable levels of concentration. One technique for bioremediation of waste oil is the use of biosurfactants, which are microbial metabolites whose function is to decrease surface and interfacial tension between the microemulsion forming oily waste water, making the process of absorption of the contaminant to the microorganism further deterioration. The cost of production of biosurfactants is approximately 3 to 10 times greater than the cost of chemical surfactants. For biosurfactant production, the use of less expensive water-soluble substrates, such as agro-industrial waste, such as wheat bran, are alternatives that can make possible the production, and consequently reduce costs. This study aimed to use the wheat bran as an alternative substrate for biosurfactant production in submerged state, using the bacterium Bacillus pumilus production. The production was carried out in basic medium composed of wheat bran with the addition of inducers (diesel, gasoline and diesel) and nitrogen source ( NH4NO3, urea and NaNO2 ). The biosurfactant production was evaluated by determination of surface tension in the fermented media free of cells and through the activities emulsifying facturers W/O ( water/oil) and O/W (oil/water). The isolated biosurfactant was able to reduce the surface tension to 37 mn/m when used diesel oil as inducer and urea as nitrogen source. The best emulsifying activities W/ O were obtained when using biodiesel inductor and urea as nitrogen source. The highest activities O/W were obtained with diesel oil as inducer and urea as nitrogen source. It is concluded that wheat bran can be used as substrate for biosurfactant production using the bacterium as a producer Bacillus pumilus. Keywords : Bioremediation, nitrogen source inductor.

9 8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1Tubo de ensaio com emulsão O/A e emulsão A/O Figura 2 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo fermentativo para os experimentos que utilizaram óleo diesel como indutor Figura 3 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo fermentativo para os experimentos que utilizaram biodiesel como indutor Figura 4 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo fermentativo para os experimentos que utilizaram gasolina como indutor Figura 5 Gráfico de PARETO para a atividade emulsificante O/A Figura 6 Gráfico de PARETO para a atividade emulsificante A/O... 38

10 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Funções e aplicações industriais dos biossurfactantes Tabela 2 Principais grupos de surfactantes de origem natural e sintética Tabela 3Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos Tabela 4 Composição centesimal do farelo de trigo Tabela 5 Planejamento Fatorial Completo 3² utilizado para avaliar a influência da fonte de N e indutor sobre a produção de biossurfactante por B. pumilus Tabela 6 Concentração celular e redução da tensão superficial Tabela 7 ph do extrato livre de células Tabela 8 Atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo para os tempos inicial e em 72 horas Tabela 9 Adimensionais das atividades emulsificantes A/O e O/A para os diferentes experimentos realizados no Planejamento Fatorial Completo 3² Tabela 10 ANOVA dos resultados de atividade emulsificante O/A em função das variáveis estudadas Tabela 11 Efeitos estimados das variáveis sobre a atividade emulsificante óleo em água Tabela 12 ANOVA dos resultados de atividade emulsificante A/O em função das variáveis estudadas Tabela 13 Efeitos estimados das variáveis sobre a atividade emulsificante A/O... 37

11 10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO DESENVOLVIMENTO Revisão Bibliográfica BIOTECNOLOGIA BIORREMEDIAÇÃO BIOSSURFACTANTES FATORES QUE AFETAM A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE APLICAÇÕES DOS BIOSSURFACTANTES CLASSIFICAÇÃO E NATUREZA QUÍMICA DOS BIOSSURFACTANTES MICRORGANISMOS PRODUTORES DE BIOSSURFACTANTES PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Bacillus pumilus MEIO DE CULTIVO MATERIAL E MÉTODOS Resultados e discussões Tensão superficial Determinação da concentração de células ph Atividade emulsificante Conclusão... 39

12 11 1 INTRODUÇÃO Os problemas ambientais tornam-se cada vez mais críticos e frequentes em decorrência do aumento das atividades industriais e do crescimento desordenado da população. A contaminação de ambientes, principalmente da água, vem crescendo cada vez mais, tornando escassa a água de boa qualidade. Essa contaminação se dá pela introdução de substâncias nocivas que acarreta vários efeitos negativos sobre a vida animal e vegetal (NITSCHKE; PASTORE, 2003). Uma das principais vias de poluição das águas é causada pelo petróleo e seus derivados. Inúmeras técnicas físicas, químicas e biológicas vêm sendo desenvolvidas para a remoção de petróleo derramado ou para a redução dos seus efeitos sobre o ecossistema. Pesquisas realizadas demonstram como o meio ambiente reage a tais condições, intervenções antropogênicas, revelando a significativa atuação de microrganismos na busca da autopreservação e recuperação. Isso é feito através da capacidade que alguns microrganismos possuem em degradar este tipo de poluente (NITSCHKE; PASTORE, 2002). Desai e Banat (1997), afirmam que o custo para a produção de biossurfactantes é de aproximadamente 3 a 10 vezes maior que o custo de surfactantes químicos, quando comparados, o que por vezes tem impossibilitado seu uso em maior escala. Contudo, outros substratos mais baratos e solúveis em água, como os resíduos agroindustriais, mostram-se como uma excelente opção para a produção de biossurfactante. Os biossurfactantes são compostos produzidos por diversos microrganismos que apresentam grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma molécula, o que lhes confere a capacidade de agir em interfaces, aumentando a capacidade emulsificante, detergente, lubrificante, solubilizante e dispersante (OLIVEIRA, 2010). O Estado do Rio Grande de Sul é segundo maior produtor nacional na cultura de trigo. As maiores regiões produtoras deste grão localizam-se principalmente na porção nortenoroeste do Rio Grande do Sul, com isso, o farelo de trigo torna-se um subproduto agroindustrial de fácil obtenção, podendo assim ser usado como um substrato alternativo e de baixo custo para a produção de biossurfactante (SEPLAG, 2013). O uso de substratos alternativos como os resíduos agroindustriais tornaria a produção de biossurfactantes mais viável financeiramente aumentando o seu interesse comercial (NITSCHKE; PASTORE, 2003).

13 12 O objetivo geral deste trabalho foi o uso de farelo de trigo como substrato alternativo para a produção de biossurfactante por Bacillus pumilus em estado submerso. Os objetivos específicos foram: a) Utilização de farelo de trigo como substrato para a produção de biossurfactantes; b) Estudar a influência de diferentes indutores a produção de biossurfactantes pela bactéria Bacillus pumilus; c) Estudar a influência de diferentes fontes de nitrogênio para a produção de biossurfactantes por Bacillus pumilus.

14 13 2 DESENVOLVIMENTO 2.1 Revisão Bibliográfica 2.2 BIOTECNOLOGIA A biotecnologia, segundo Bueno (2008), é o conjunto de conhecimentos e técnicas que permite aos pesquisadores o desenvolvimento de métodos, técnicas e meios associados a seres vivos, macro e microscópios, onde, um dos objetivos é o de produzir produtos úteis e que contribuam para a resolução de problemas relacionados com poluição de meios. Muitas indústrias tradicionais estão enfatizando um redirecionamento para o surgimento de novas tecnologias. Uma vez que a biotecnologia faz uso de diversos compostos com propriedades tensoativas, seja na purificação de produtos biológicos ou em biocatálise e, esta também necessita dar resposta (preventiva e curativa) aos problemas que os tensoativos domésticos e industriais possam causar nas estações de tratamento de efluentes. Preocupações ambientais têm orientado a seleção de tensoativos em que, testes de biodegradabilidade e de toxicidade começaram a ter uma importância decisiva. Assim, existe a tendência de aproximar-se a produção do natural, atendendo o princípio, segundo o qual a natureza, por si só, não tem capacidade de desfazer o que o homem faz (ROCHA, 1999, MULLER; RUSSEL; LUCASE, 1997, apud BUENO, 2008). 2.3 BIORREMEDIAÇÃO De acordo com Silveira (2009), dentre os processos biológicos pode-se destacar a biorremediação, que consiste na utilização de microrganismos ou dos seus componentes na recuperação de áreas contaminadas, reduzindo ou eliminando os contaminantes, a mesma pode ser aplicável em meios como águas superficiais, subterrâneas, solos, resíduos, efluentes industriais em aterro ou áreas de contenção. Nitschke e Pastore (2002) relatam que se tornaram numerosos os acidentes relacionados com derramamentos ou vazamentos de petróleo causando muitos problemas ecológicos e sociais. Para combater esses problemas são usados os conhecimentos das

15 14 propriedades dos biossurfactantes, que aumentam a interação superficial água/óleo, facilitando o acesso de substratos hidrofóbicos às células. Com isso aceleram a degradação dos componentes do petróleo por microrganismos e promovem a biorremediação de águas e solos de uma forma mais eficaz. Gaylarde et al., (2005) afirmam que as técnicas de biorremediação desenvolvidas são ecologicamente mais adequadas e eficazes quando aplicadas em ambientes contaminados por metais tóxicos e em meios contaminados por moléculas orgânicas de difícil degradação, tais moléculas são denominadas recalcitrantes, que podem ser de origem natural, sintetizadas pelo metabolismo biológico, ou sintéticas, produzidas por tecnologias industriais modernas e estranhas ao ambiente natural, por estas razões denominadas xenobióticas (xenos, de grego = estrangeiro). Os processos biológicos de descontaminação utilizam, geralmente, microrganismos autóctones (do próprio ambiente) ou introduzidos (estado nativo ou geneticamente modificados), possuindo a capacidade de degradar compostos poluidores, que resultem em produtos de degradação com estrutura menos recalcitrante em relação à molécula original, ou na mineralização do xenobiótico (GAYLARDE et al., 2005). Fatores podem influenciar à degradabilidade de compostos recalcitrantes, tais como fatores físicos e químicos e fatores biológicos. A natureza física da matriz onde o composto é encontrado, temperatura e luz são os principais parâmetros físicos com influência na degradabilidade de compostos (BUENO, 2008). Inúmeros são os fatores químicos que podem influenciar, acelerando ou reduzindo, a taxa de degradação de um poluente. A composição química da matriz ambiental, que define a capacidade nutritiva, o ph, umidade, teor de oxigênio dissolvido e a composição e estrutura química do poluente, são fatores que merecem destaque (GAYLARDE et al., 2005). Dentre os fatores biológicos, devem ser consideradas as condições de biodegradação de um composto químico no meio ambiente, que depende, sobretudo, da presença de uma população de microrganismos capas de metabolizar a molécula original e seus produtos de degradação. Na biosfera atual, não existem, rotas enzimáticas catabólicas capazes de degradar todos os compostos novos que a cultura humana sintetizou durante os últimos 100 anos (GAYLARDE et al., 2005). Enzimas que catabolizam a degradação de compostos naturais podem apresentar baixa especificidade pelo seu substrato e, com isso, os xenobióticos com estrutura química semelhante a compostos naturais podem ser reconhecidos pelo sítio ativo de enzima, possibilitando, assim, que sejam quimicamente transformados. Quando o xenobiótico tem a

16 15 possibilidade de percorrer todos os caminhos de uma determinada rota catabólica enzimática, ele se tornara uma possibilidade nutritiva para o microrganismo, tornando-se produtos de sua degradação aproveitados pelo seu metabolismo construtivo e energético (GAYLARDE et al., 2005). A biorremediação e uma tecnologia complexa e sua implementação ocorre em etapas que compreendem um estudo do ambiente, do tipo de contaminante, dos riscos e da legislação. Inicialmente, é necessária uma caracterização do tipo e da quantidade do poluente, bem como avaliações de natureza biológica, geológica, geofísica e hidrológica do sítio contaminado (GAYLARDE et al., 2005). Inicialmente, as avaliações biológicas ocorrem em laboratório, visando à otimização da biodegradação do composto. São realisados testes de bioestimulação, que compreende na adição de nutrientes e/ou surfactantes, e os testes de bioaumentação, que é baseado na adição de culturas de microrganismos biodegradadores ou mediadores. Baseando-se nos dados obtidos, é escolhida a técnica de biorremediação mais adequada para a situação e testes de campo são realizados, para verificar a eficiência do processo in situ (GAYLARDE et al., 2005). 2.4 BIOSSURFACTANTES Os surfactantes têm como função reduzir a tensão superficial, ou seja, reduzir a energia livre do sistema. Isso se da devido à substituição da maior parte das moléculas de alta energia na interface diminuindo, assim, a tensão superficial e interfacial dos líquidos. Estes são constituídos por uma porção hidrofóbica e um grupo hidrofílico, sendo conhecidos também por substâncias anfifílicas (BUENO, 2008). As moléculas surfactantes possuem duas propriedades fundamentais: a) As moléculas saem da solução para se posicionar nas interfaces (ex: ar/líquido, líquido/líquido) com orientação específica, que também pode ser conhecida como adsorção; b) Formando agregados orientados, ou também chamados de micelas. Na formação de micelas em solução, a mesma conferirá as propriedades de detergência e solubilização (BUENO, 2008).

17 16 Estas propriedades fazem os surfactantes serem adequados para uma ampla gama de aplicações industriais envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade umectante, solubilização e dispersão de fases. A maior utilização dos surfactantes se concentra na indústria de produtos de limpeza (sabões e detergentes), na indústria de petróleo e na indústria de cosméticos e produtos de higiene (NITSCHKE; PASTORE, 2002). Os surfactantes existentes e disponíveis comercialmente, em sua maioria, são sintetizados a partir derivados de petróleo. A crescente preocupação ambiental da sociedade combinada com novas legislações de controle do meio ambiente levaram os cientistas a pesquisar surfactantes biológicos como substitutos dos surfactantes já existentes (NITSCHKE; PASTORE, 2002). Biossurfactantes são compostos de origem microbiana que exibem propriedades surfactantes, ou seja, tem por função diminuir a tensão superficial e interfacial formando microemulsões nas quais os hidrocarbonetos podem solubilizar-se em água ou a água solubilizar-se em hidrocarbonetos, possuindo alta capacidade emulsificante, são denominados biossurfactantes que consistem de subprodutos metabólicos de bactérias, fungos e leveduras (OLIVEIRA, 2010). Tais compostos são capazes de dividir interfaces entre fluídos com diferentes graus de polaridade e pontes de hidrogênio tais como óleo/água ou ar/água interfacial (NITSCHKE; PASTORE, 2002). Os biossurfactantes possuem aplicações potenciais em diferentes setores industriais como formulações farmacêuticas e cosméticas, petroquímica, médica, produtos alimentícios e nas áreas de proteção ao meio ambiente (SINGH; CAMEOTRA, 2004 apud BUENO, 2008). De um modo geral, os biossurfactantes possuem uma estrutura composta por uma porção hidrofílica que consiste de aminoácidos, peptídeos, ânions ou cátions; mono, di ou polissacarídeos e uma porção hidrofóbica consistindo de ácidos graxos saturados ou insaturados (SINGH; CAMEOTRA, 2004 apud BUENO, 2008). Os biossurfactantes produzidos por microrganismos procariontes ou eucariontes podem possuir diferentes estruturas químicas, podendo ser de baixo ou alto peso molecular. Estruturas de baixo peso molecular são geralmente glicolipídeos contendo os açúcares ramnose, soforose e trealose e lipopeptídeos que consistem de polipeptídios curtos e os de alto peso molecular como os biopolímeros que incluem lipoproteínas, complexos lipopolissacarídeo-proteína e complexos polissacarídeo-proteínas-ácidos graxos, biossurfactantes que possuem alto peso molecular está relacionado à produção de emulsão

18 17 (CHRISTOFI; IVSHINA, 2002; RON; ROSENBERG, 2002, LANG, 2002; SULLIVAN, 1998 apud BUENO, 2008) FATORES QUE AFETAM A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE Fonte de carbono - indutor Cerqueira (2007) relata que a fonte de carbono é um dos fatores mais importantes para a produção de todo e qualquer biossurfactante, a composição do meio de cultivo vai influenciar diretamente a quantidade e as propriedades dos biossurfactantes a serem produzidos. As fontes de carbono que normalmente são usadas podem ser divididas em três categorias: carboidratos, hidrocarbonetos e óleos vegetais. Alguns microrganismos produzem biossurfactantes somente utilizando fontes de carbono hidrofóbicas, hidrocarbonetos ou óleos vegetais, outros somente usam carboidratos, e outros ainda usam diversas fontes de carbono, em combinação ou individualmente (KIM et al, 1997, apud CERQUEIRA, 2007) Fonte de nitrogênio A fonte de nitrogênio possui um papel importante na produção de biossurfactante, podendo interferir na mesma, isso pode ocorrer tanto na quantidade como na composição do biossurfactante, tais estudos, foram realizados para avaliar o efeito da fonte de nitrogênio na produção de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa e Rhodococcus spp., onde foram verificadas que máximas produções somente puderam ser alcançadas quando nitrato foi utilizado como fonte de nitrogênio (DESAI; BANAT, 1997). Em estudos realizados por Makkar; Cameotra (1997) foram testadas diferentes fontes de nitrogênio (0,3%) na produção de biossurfactantes por Bacillus subtilis, tais autores concluíram que nitrato de sódio, nitrato de potássio e ureia foram as melhores fontes de nitrogênio testadas usando tal microrganismo.

19 Fontes de outros nutrientes Estudos indicam que a adição de MnSO 4 resultou em significante aumento da produção de biossurfactante e crescimento celular, enquanto CaCl 2 e NaCl não apresentaram efeito algum e que a maior concentração de biossurfactante foi encontrada para a concentração de 50 mg.l-1 de MnSO 4.4H 2 O, já para a fonte de fosfato, suprida por K 2 HPO 4 e NaH 2 PO 4 na proporção em peso de 7:1, obteve-se um resultado diferente na produção de biossurfactante quando fora comparado com o crescimento celular, a máxima concentração celular somente foi obtida quando 9 g/l de fosfatos foram utilizados, enquanto que a maior concentração de biossurfactante ocorreu quando utilizou-se 12 g/l de fosfatos (KIM et al., 1997, citados por PINTO, 2008) Fatores ambientais Desai; Banat (1997) relatam que alguns fatores ambientais e diferentes condições de crescimento como a temperatura, agitação e disponibilidade de oxigênio também podem afetar a produção de biossurfactante através do seu efeito no crescimento ou atividade celular. Segundo Turkovskaya et al. (2001), durante seus estudos da produção de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa em diferentes temperaturas, ph e agitação, observaram que na ausência de agitação, pouco biossurfactante foi sintetizado a temperatura ambiente, pois a tensão superficial do meio livre de células foi de 66,9 mn/m, não apresentando atividade emulsificante. Quando se manteve o meio sem agitação e aumentando a temperatura para 30ºC, a tensão superficial reduziu consideravelmente (37,4 mn/m), entretanto a atividade emulsificante permenaceu baixa (10%). Quando se utilizou agitação em shaker a 160 rpm e temperaturas de 20 e 30ºC, o crescimento celular e rendimento do surfactante foram superiores, com redução da tensão superficial para 25 mn.m-1, e atividade emulsificante de 60%. O ótimo ph para o crescimento do microrganismo e biossíntese de surfactante foi de 7,0-8,0.

20 APLICAÇÕES DOS BIOSSURFACTANTES As propriedades físico-químicas, características dos biossurfactantes, torna a indústria petrolífera o maior mercado para os biossurfactantes, pois os mesmos seriam utilizados na produção de petróleo ou incorporados em formulações de óleos lubrificantes. Outras aplicações incluem biorremediação, dispersão no derramamento de óleos, remoção e mobilização de resíduos de óleo em tanques de estocagem, recuperação melhorada de petróleo, locais poluídos por compostos relacionados à liberação de hidrocarbonetos no ambiente decorrente da atividade industrial (OLIVEIRA, 2010). Os biossurfactantes com estrutura anfipática atuam sobre os hidrocarbonetos emulsificando-os por meio da formação de micelas, que se acumulam na interface entre líquidos de diferentes polaridades. Isto disponibiliza poluentes hidrofóbicos do solo como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) e conferem a capacidade de detergência, emulsificação, lubrificação, solubilização e dispersão de fases (KUIPER et al., 2004; BICCA; FLECK; AYUB, 1999 apud BUENO, 2008; DESAI; BANAT, 1997). Os biossurfactantes atualmente estão sendo usados nos campos que incluem formulação de produção de produtos de higiene e cosméticos, mineração, agricultura e as indústrias de papel, têxtil, cerâmica, alimentos e a indústria farmacêutica, as quais podem ser observadas na Tabela 1 (PIROLLO, 2006). Tabela 1 Funções e aplicações industriais dos biossurfactantes. Funções Campos de aplicação Emulsionantes e Cosméticos, tintas, biorremediação, óleos e alimentos dispersantes Solubilizantes Produtos farmacêuticos e de higiene Agentes molhantes e Produtos farmacêuticos, têxteis e tintas penetrantes Detergentes Produtos de limpeza e agricultura Agentes espumantes Produtos de higiene, cosméticos e flotação de minérios Agentes espessantes Tintas e alimentos Sequestrantes de metais Mineração Formadores de vesículas Cosméticos e sistemas de liberação de drogas Demulsificantes Tratamento de resíduos e recuperação de petróleo Redutores de viscosidade Transporte em tubulações e oleodutos (continua)

21 20 Dispersantes Fungicidas Fonte: PIROLLO, (conclusão) Misturas carvão-água e calcáreo-água Controle biológico de fitopatógenos CLASSIFICAÇÃO E NATUREZA QUÍMICA DOS BIOSSURFACTANTES Os biossurfactantes são classificados de acordo com sua natureza bioquímica e por sua origem microbiana, diferentemente dos surfactantes sintéticos que são classificados a partir de sua natureza e através do seu grupo polar, de acordo com seus constituintes os biossurfactantes são divididos em classes, na qual podem ser classificados como glicolipídeos, lipopeptídeos, ácidos graxos, lipídeos neutros, fosfolipídeos e biossurfactantes poliméricos (LIMA, 2007). A Tabela 2 descreve os principais grupos de surfactantes de origem natural e sintética. Tabela 2 Principais grupos de surfactantes de origem natural e sintética. NATURAIS Alquil poliglicosídeos Biossurfactantes Amidas de ácidos graxos Aminas de ácidos graxos Glucamidas Lecitinas Derivados de proteínas Saponinas Sorbitol e ésteres de sorbitan Ésteres de sacarose Sulfatos de álcoois graxos naturais Fonte: LIMA, SINTÉTICOS Alcanolaminas Alquil e aril éter carboxilatos Alquil aril sulfatos Alquil aril éter sulfatos Alquil etoxilados Alquil sulfonatos Alquil fenol etoxilados Aminoóxidos Betaínas Co-polímeros de óxido de etil/propileno Ácidos graxos etoxilados MICRORGANISMOS PRODUTORES DE BIOSSURFACTANTES

22 21 Bezerra (2006) afirma que o êxito ou fracasso em um processo fermentativo começa com a escolha do microrganismo que pode ser selecionado de materiais contaminados ou não, certos critérios devem ser considerados na hora da escolha das cepas, para que só assim haja uma boa produção do metabólito que se deseja. Uma grande variedade de microrganismos tem a capacidade de produzir biossurfactantes, evidenciando que a quantidade e a qualidade são influenciadas pela natureza do substrato e as condições de cultivo (SILVA, 2011). Alguns critérios recebem destaque tais como, a cepa escolhida deverá ser geneticamente estável, tenha uma alta velocidade de crescimento, seja pura (livre de contaminantes), que os custos dos nutrientes sejam baratos, no presente trabalho, será apresentado o uso de substratos agroindustriais, que tem por finalidade baratear a produção (BEZERRA, 2006). Ao escolher o microrganismo desejado, deve-se observar se o mesmo possui elevada eficiência na conversão do substrato em produto, ou seja, quanto maior a afinidade do microrganismo com o meio oferecido, maior será a eficiência de conversão, sendo assim, resultando no acumulo do produto no meio, de forma a obter elevada concentração deste no caldo fermentado (BEZERRA, 2006). As classes de biossurfactantes e microrganismos produtores estão distribuídos entre uma variedade de gêneros, apresentadas na Tabela 3. Tabela 3Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos TIPO DE BIOSSURFACTANTE MICRORGANISMO GLICOLIPÍDIOS - Ramnolipídios - Roforolipídios - Rrehalolipídios LIPOPEPTÍDIOS E LIPOPROTEÍNAS - Peptídio-lipídio - Viscosina - Serrawetina - Surfactina - Subtilisina - Gramicidina - Polimixina ÁCIDOS GRAXOS, LIPÍDIOS NEUTROS E FOSFOLIPÍDIOS (continua) Pseudomonas aeruginosa Torulopsis bombicola, T. apicola Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium sp. Bacillus licheniformis Pseudomonas fluorescens Serratia marcescens Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacillus brevis Bacillus polymyxa

23 22 - Ácidos graxos - Lipídios neutros - Fosfolipídios SURFACTANTES POLIMÉRICOS - emulsan - biodispersan - liposan - carboidrato-lipídio-proteína - manana-lipídio-proteína SURFACTANTES PARTICULADOS - vesículas - células Várias bactérias Fonte: PIROLLO, (conclusão) Corynebacterium lepus Nocardia erythropolis Thiobacillus thiooxidans Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter calcoaceticus Candida lipolytica Pseudomonas fluorescens Candida tropicalis Acinetobacter calcoaceticus PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Bacillus pumilus Existem poucos dados e artigos disponíveis na literatura fazendo referência sobre a produção de biossurfactantes por B. pumilus, o microrganismo estudado no presente trabalho. Bugay (2009) revela que os primeiros estudos foram reportados por Morikawa et al. (1992), que identificaram B. pumilus como sendo um novo produtor de surfactina, porém outros autores testaram a produção de surfactina por diversas espécies de Bacillus e concluíram que o biossurfactante produzido por B. pumilus é similar, mas não idêntico, à surfactina. Esse tipo de microrganismo se dá em solo, água, ar e em decomposição de tecidos vegetais, são frequentemente encontrados em simbiose no desenvolvimento radicular de plantas. Esta bactéria tem a capacidade de produzir inúmeras moléculas, tais como biossurfactantes, proteases, lignocelulases e uma variedade de toxinas e antibióticos (OLIVIERA, 2010). De acordo com estudos realizados, a bactéria B. pumilus produz um lipopeptídeo da família da surfactina, chamado de pumilacidina (OLIVEIRA, 2010). Bueno (2008) isolou inúmeros microrganismos de diferentes amostras de solo contaminado com hidrocarbonetos para avaliar a produção de biossurfactantes. Segundo a pesquisa, o microrganismo que melhor produziu foi à bactéria identificada como Bacillus pumilus utilizando como fonte de carbono baixas concentrações de sacarose, adicionado de óleo diesel como indutor.

24 MEIO DE CULTIVO O sucesso da produção industrial de biossurfactantes depende diretamente do desenvolvimento de processos mais baratos e de uso de matérias primas de baixo custo, para que assim, haja viabilidade na produção, uma vez que estas representam entre 10% a 30% do custo total, (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998). A escolha da fonte de carbono não pode ser somente induzida pelo seu custo, disponibilidade e pelas características nutricionais do agente fermentativo, é extremamente necessário que se leve em consideração o tipo de aplicação que se deseja do biossurfactante a ser produzido. Logo, a fonte de carbono é um fator importante no processo de síntese, uma vez que a alteração do substrato geralmente resulta em modificações da estrutura química do biossurfactante, ocasionando variação das suas propriedades físico-químicas (LIMA, 2007). Estudos apontam diferentes tipos de resíduos que podem ser usados como substratos alternativos na produção de biossurfactantes. Ter o conhecimento da composição adequada de nutrientes que permita o crescimento celular e o acumulo do produto de interesse é um dos maiores problemas encontrados durante a escolha do resíduo a ser utilizado. O estabelecimento de um processo biotecnológico a partir desses substratos alternativos também apresenta outra dificuldade, que é a padronização devido ás variações naturais de composição bem como os custos de transporte, armazenamento e tratamento prévio (NITSCHKE; PASTORE, 2003). Os resíduos agroindustriais possuem elevados teores de carboidratos e lipídeos, mostrando-se como substratos interessantes para a produção de biossurfactantes (MAKKAR; CAMEOTRA, 1998). As informações descritas no presente trabalho sobre o trigo justificam-se devido ao fato de que o resíduo gerado durante o processamento, beneficiamento do trigo, o farelo de trigo, fora utilizado como substrato alternativo para a produção de biossurfactante. O trigo ocupa o primeiro lugar em volume dos cereais mais produzidos no mundo, já no Brasil, 90% da produção do grão ocorre no sul do país, destacando-se a região nortenoroeste como a principal produtora do grão no estado do Rio Grande do Sul (

25 24 Silva (2006) relata que o consumo do trigo não de se dá de forma direta, primeiramente, os grãos devem ser submetidos a um processo de moagem e refinamento para só assim possa ser obtida a farinha de trigo, tal processo gera um resíduo que é a casca do grão ou também conhecido como farelo de trigo. A farinha refinada é comercializada para fins industriais e alimentícios enquanto o farelo é comercializado de forma incorporada em rações animais, tendo em vista ser um material rico em fibras e proteínas. Durante o processo de moagem e refinamento do trigo, para a obtenção da farinha de trigo, 28% do grão não é aproveitado, originando o farelo de trigo (PINTO, 2008). Portanto, a utilização deste resíduo agroindustrial para a produção de biossurfactante torna-se uma alternativa atrativa e de baixo custo. A Tabela 4 apresenta a composição centesimal em base seca do farelo de trigo. Tabela 4 Composição centesimal do farelo de trigo CONSTITUINTES Composição centesimal (%) Lipídios 3,43 Proteínas 19,79 Fibras 43,69 Carboidratos digeríveis 27,92 Fonte: RAUPP et al. (2000), apud PINTO Cinzas 6, MATERIAL E MÉTODOS Microrganismos e manutenção do inóculo Decesaro et al. (2013) isolou o microrganismo utilizado neste trabalho, tais cepas foram identificados como sendo a bactéria Bacillus pumilus, cepa originalmente isolada de solo contaminado com óleo diesel. A bactéria foi mantida em tubos inclinados contendo ágar padrão para contagem (PCA) sob-refrigeração a 4ºC, sendo repicadas a cada 30 d.

26 Preparo do inóculo O preparo do inoculo foi realizado em tubos de ensaio contendo 5 ml de meio nutriente, ph 7, com incubação por 24 h a 30ºC. O meio nutriente foi composto por (g/l): triptona 5, extrato de levedura 2,5 e glicose Fermentação submersa O meio fermentativo foi composto por um extrato de farelo de trigo (5% p/v) (fonte de carbono) adicionado de nutrientes. A partir da metodologia usada por Pinto (2008), ao extrato, foram adicionados com nutrientes (mm): NH 4 NO 3 (50,0), Na 2 HPO 4 (3,0), KH 2 PO 4 (3,0), CaCl 2 (0,007), MgSO 4.7H 2 O (0,8), EDTA sódico (0,004) e FeSO 4.7H 2 O (2,0). Como indutores foram utilizados gasolina, óleo de soja e óleo diesel na quantidade de 1% e como fontes de nitrogênio foram usados NH 4 NO 3 (4,0 g/l), ureia (3,0 g/l) e NaNO 3 (4,25 g/l). As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyers de 125 ml contendo 5 ml de inóculo e 45 ml de meio de cultivo. Amostragens foram realizadas no tempo inicial e 72 horas para a avaliação da produção de bioemulsificantes em mesa agitadora a 100rpm a uma temperatura de 30ºC. As análises foram realizadas em triplicata Planejamento experimental A Tabela 5 mostra o planejamento experimental utilizado para avaliar a influencia dos fatores estudados.

27 26 Tabela 5 Planejamento Fatorial Completo 3² utilizado para avaliar a influência da fonte de N e indutor sobre a produção de biossurfactante por B. pumilus. Exp. X 1 (Fonte de nitrogênio) X 2 (Indutor) 1-1 (NH 4 NO 3 ) -1 (Óleo diesel) 2 0 (Ureia) -1 (Óleo diesel) 3 1 (NaNO 3 ) -1 (Óleo diesel) 4-1 (NH 4 NO 3 ) 0 (Gasolina) 5 0 (Ureia) 0 (Gasolina) 6 1 (NaNO 3 ) 0 (Gasolina) 7-1 (NH 4 NO 3 ) 1 (Biodiesel) 8 0 (Ureia) 1 (Biodiesel) 9 1 (NaNO 3 ) 1 (Biodiesel) Determinação da produção de biossurfactantes Os caldos fermentados livres de células foram submetidos à análise de tensão superficial, análise da concentração celular e atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo Determinação da tensão superficial A medida da tensão superficial foi realizada, nas amostras centrifugadas, livres de células, através do tensiômetro Krüss utilizando um anel de platina ph de vidro. O ph foi determinado através de leitura direta em phmetro digital, utilizando eletrodo

28 Determinação da concentração de células A concentração de células no meio fermentado foi realizada após a centrifugação de um volume conhecido de amostra, 50 ml, feita secagem a 60ºC por 24h em cápsulas de alumínio taradas Atividade emulsificante As amostras foram centrifugadas e filtradas em papel filtro para a determinação da atividade emulsificante. As atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo foram determinadas segundo metodologia proposta por Pinto et al. (2009), utilizando-se 3,5 ml de extrato e 2 ml de óleo de milho. A mistura foi agitada em agitador Vórtex a 700 rpm por 1 min. Após 60 min de repouso foi lida a absorbância do meio emulsificado óleo/água em espectrofotômetro a 610 nm. A absorbância da atividade emulsificante óleo/água foi obtida a partir da diminuição da absorbância da amostra da absorbância do branco conforme a Equação 1. Após 24 h de repouso foi realizada a leitura em paquímetro, da altura da emulsão água/óleo formada e da altura total (altura da emulsão mais altura da camada remanescente de óleo), gerando a atividade emulsificante água em óleo de acordo com a Equação 2. Três brancos foram realizados, utilizando água no lugar da amostra e os extratos obtidos a partir dos meios de cultivo. A Figura 1 apresenta o esquema da formação das emulsões A/O e O/A no tubo de ensaio. A formação da emulsão O/A é estimada pela leitura da absorbância 60 min após a agitação, enquanto a estabilidade da emulsão A/O é estimada pela medida da altura da camada superior emulsificada em comparação com a altura total de líquido do sistema.

29 28 Figura 1Tubo de ensaio com emulsão O/A e emulsão A/O Fonte: PINTO et al (2009). AE AE ( ABS ABS D Equação 1. O / A amostra branco) ( E E D Equação 2. A / O amostra branco) Onde: AE = atividade emulsificante (AE); O/A = óleo em água; A/O = água em óleo; ABS = absorbância; E = relação centesimal entre a altura da emulsão água/óleo e a altura total; D = diluição da amostra em água Tratamento dos dados Para verificar o potencial do substrato utilizado bem como dos indutores e fontes de nitrogênio para a produção de biossurfactante usando a bactéria B. pumilus como microrganismo produtor, foram feitas comparações dos valores das atividades emulsificantes água-óleo e óleo-água bem como os valores referentes à tensão superficial em cada experimento. Os resultados de atividade emulsificante obtidos a partir dos experimentos do planejamento experimental foram tratados por análise de variância (ANOVA) a um nível de significância de 5%, através do programa Statistica 6.0.

30 Resultados e discussões Tensão superficial A determinação da tensão superficial foi utilizada como indicador qualitativo da produção de biossurfactante. Oliveira (2010) afirma que quanto maior for à concentração do tenso-ativo no meio, maior será a redução da tensão superficial. A tensão superficial obtida nos meios de fermentação para os experimentos que utilizaram óleo diesel (-1), gasolina (0) e biodiesel (1) podem ser observados nas Figuras 2, 3 e 4. Os resultados obtidos referentes à tensão superficial, utilizando farelo de trigo como meio base para a fermentação submersa e B. pumilus como microrganismo produtor, foram significativos para os indutores testados, bem como para as fontes de nitrogênio. Figura 2 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo fermentativo para os experimentos que utilizaram óleo diesel como indutor

31 30 Figura 3 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo fermentativo para os experimentos que utilizaram biodiesel como indutor Figura 4 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo fermentativo para os experimentos que utilizaram gasolina como indutor Os resultados mostram que o meio composto pelo indutor óleo diesel acrescido de ureia como fonte de nitrogênio obteve uma redução na tensão superficial para 37 mn/m. Esse resultado indica que a bactéria Bacillus pumilus produz um biossurfactante com alto poder redutor de tensão superficial.

32 31 Os experimentos que utilizaram biodiesel como indutor apresentaram redução da tensão superficial, porém, com a utilização de nitrato de sódio como fonte de nitrogênio, onde a tensão superficial reduziu para 42 mn/m. Usando gasolina como indutor não foi observada redução da tensão superficial. De acordo com a literatura, os microrganismos para serem considerados bons produtores de biossurfactantes devem reduzir a tensão superficial do sobrenadante em relação com a da água abaixo de 40 mnm -1 e em torno de 35 mnm -1 (DESAI; BANAT, 1997; BATISTA et al., 2006). Ambos os resultados mostram-se mais expressivos que o encontrado por Bento e colaboradores (2003), onde o valor da tensão superficial do biossurfactante produzido por Bacillus pumilus, utilizando meio de cultura a base de sais e extrato de levedura como fonte de carbono, foi de 49,5 mn/m. Comparando-se os resultados obtidos no presente trabalho, os mesmos mostram-se superiores aos encontrados de tensão superficial por Oliveira (2010), que obteve valores de tensão superficial de 45 mn/m utilizando Bacillus pumilus e óleo residual de fritura na concentração de 2 % em 24 horas de fermentação e 5 % em 48 horas e 96 horas de fermentação. Utilizando melaço a melhor redução da tensão superficial foi nas concentrações de 4 e 5 % em 48, 72 e 96 horas de fermentação no valor de 42 mn/m. Bugay (2009) obteve a maior redução de tensão superficial utilizando glicerol e glucose como fonte de carbono, para as cepas de B. pumilus e B. subtilis, onde a tensão inicial era de 58mN/m reduzida a 51,4 mn/m e 49,7 mn/m respectivamente. Segundo Makkar e Rockne (2003), o biossurfactante também é uma fonte de carbono e muitas vezes mais assimilável que a fornecida para a sua produção, portanto, o aumento na tensão superficial pode ser explicado pelo fato dos isolados possivelmente terem consumido o biossurfactante por elas inicialmente sintetizado, permitindo assim a continuidade do crescimento dos isolados, consequentemente aumentando a tensão superficial. O uso do farelo de trigo como substrato alternativo para a produção de biossurfactante quando acrescido de fontes de nitrogênio tais como ureia e nitrato de sódio e indutores como óleo diesel e biodiesel apresentaram redução na tensão superficial Determinação da concentração de células

33 32 A Tabela 6 mostra os valores referentes à concentração de células obtidas pelos experimentos em seus respectivos tempos. Tabela 6 Concentração celular e redução da tensão superficial Tempo Exp. Fonte de nitrogênio Indutor 0 horas(g/ml) 72 horas (g/ml) % aumento na concentração de células % redução da TS* 1 NH 4 NO 3 óleo diesel 0,198 0, ,4 2 Ureia óleo diesel 0,218 0, ,8 3 NaNO 3 óleo diesel 0,194 0,386 99,0 9,2 4 NH 4 NO 3 Gasolina 0,203 0,219 7,9-5 Ureia Gasolina 0,194 0,214 10,3-6 NaNO 3 Gasolina 0,190 0,201 5,8 0,9 7 NH 4 NO 3 Biodiesel 0,289 0,389 34,6 4,7 8 Ureia Biodiesel 0,292 0,448 53,4 7,6 9 NaNO 3 Biodiesel 0,303 0,401 32,3 6,3 *TS Tensão superficial Pode-se observar que no tempo de 72 horas, o experimento que fez uso do indutor óleo diesel e fonte de nitrogênio nitrato de amônia obteve o resultado mais expressivo de concentração celular, atingindo 120% de crescimento celular, comparando os resultados obtidos para a redução da tensão superficial, o experimento utilizando o indutor óleo diesel e a fonte de nitrogênio a ureia obteve o melhor resultado, com isso, podemos afirmar que o crescimento do microrganismo não influenciou na redução da tensão superficial. Em testes feitos em meio modelo para produção de biossurfactante utilizando como microrganismo produtor a bactéria Bacillus subtilis, Bueno (2008) afirma que o crescimento celular é diretamente proporcional à produção de biossurfactante e que, por sua vez, está relacionada à diminuição da tensão superficial e ao índice de emulsificação ph Os valores obtidos do ph para os diferentes extratos livres de células avaliados podem ser observados na Tabela 7, que apresenta os valores referentes a fermentação 0h e 72 horas.

34 33 Tabela 7 ph do extrato livre de células Experimento Fonte de nitrogênio Indutor 0 horas 72 horas 1 NH 4 NO 3 óleo diesel 7,0 7,2 2 Ureia óleo diesel 7,0 7,5 3 NaNO 3 óleo diesel 7,0 7,0 4 NH 4 NO 3 Gasolina 6,8 6,8 5 Ureia Gasolina 7,0 7,0 6 NaNO 3 Gasolina 7,2 7,1 7 NH 4 NO 3 Biodiesel 7,4 7,2 8 Ureia Biodiesel 7,1 7,3 9 NaNO 3 Biodiesel 6,7 6,9 Turkovskaya et al. (2001) observou que durante seus estudos da produção de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa o ótimo ph para o crescimento do microrganismo e biossíntese de surfactante foi de 7,0-8,0. Os resultados apresentados sugerem que no experimento que o ph variou de 7 no tempo 0 horas à 7,5 no tempo de 72 horas, obteve-se a maior redução na tensão superficial. Observa-se então que o ótimo ph para a produção de biossurfactante em meio contendo farelo de trigo como substrato, óleo diesel como indutor e ureia como fonte de nitrogênio e usando a bactéria Bacillus pumilus como microrganismo produtor, que o ph sugerido seja o que encontre-se em uma faixa de 7 à Atividade emulsificante A Tabela 8 apresenta os resultados de atividade emulsificante óleo em água e água em óleo para os experimentos do Planejamento Fatorial Completo 3 2.

35 34 Tabela 8 Atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo para os tempos inicial e em 72 horas. Exp. Fonte de AE O/A (UE)* AE A/O (UE)* Indutor nitrogênio 0 h 72 h 0 h 72 h 1 NH 4 NO 3 óleo diesel 0,458±0,046 0,564±0,030 26,192±0,455 25,522±0,609 2 Ureia óleo diesel 0,316±0,213 1,201±0,027 24,665±0,783 24,615±0,614 3 NaNO 3 óleo diesel 0,388±0,576 1,286±0,123 21,960±0,248 22,905±0,000 4 NH 4 NO 3 gasolina 0,428±0,049 0,357±0,080 25,208±1,290 24,613±0,354 5 Ureia gasolina 0,423±0,059 0,614±0,068 24,167±0,327 22,284±0,522 6 NaNO 3 gasolina 0,261±0,039 0,545±0,057 24,589±0,651 25,362±0,092 7 NH 4 NO 3 biodiesel 0,183±0,011 0,329±0,068 24,572±0, ,578±0,133 8 Ureia biodiesel 0,570±0,186 0,459±0,139 22,138±0,581 28,482±0,572 9 NaNO 3 biodiesel 0,404±0,056 0,219±0,067 22,548±0,772 29,174±0,790 *Resultados média ± desvio padrão As maiores atividades emulsificantes O/A foram encontradas no tempo de 72 horas, apresentado na Tabela 8, ambas as atividades utilizando óleo diesel como indutor, porém diferentes fontes de nitrogênio. A maior atividade ocorre quando ao meio fora adicionado uréia como fonte de nitrogênio (1,201±0,027 UE) e óleo diesel como indutor. Com relação às AE A/O, os melhores resultados foram obtidos no tempo de 72 horas. O experimento que apresentou o resultado mais expressivo foi o que fora adicionado biodiesel como indutor e uréia como fonte de nitrogênio, (28,482±0,572 UE). Bueno (2008) utilizou vários microrganismos isolados de amostras de solo contaminado com hidrocarbonetos para avaliar a produção de biossurfactantes. Nesta pesquisa o microrganismo que melhor produziu foi à bactéria identificada como Bacillus pumilus utilizando como fonte de carbono baixas concentrações de sacarose, adicionado de óleo diesel como indutor. Bento e colaboradores (2003) estudaram a caracterização dos biossurfactantes produzidos por populações microbianas de solos dos Estados Unidos e da China contaminados com óleo diesel. Dentre as bactérias produtoras o B. pumilus foi à bactéria que reduziu significativamente a tensão superficial, e aumentou a emulsificação em 59%. Biossurfactantes produzidos por Bacillus pumilus em amostra isolada a partir de resíduos de óleo (CALVO et al., 2008), demonstraram ser esta bactéria um agente promissor para aplicação ambiental Análise de variância