PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR BACILLUS SUBTILIS UTILIZANDO RESÍDUO DO PROCESSAMENTO DO ABACAXI COMO SUBSTRATO

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1 PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR BACILLUS SUBTILIS UTILIZANDO RESÍDUO DO PROCESSAMENTO DO ABACAXI COMO SUBSTRATO Aluna: Daniela Diniz Ehrhardt Orientador: Elias Basile Tambourgi Departamento de Engenharia de Sistemas Químicos Faculdade de Engenharia Química Unicamp RESUMO Biossurfactantes são grupos de compostos químicos produzidos por bactérias, fungos e leveduras através da biodegradação de matérias-primas renováveis. Tais compostos possuem característica anfipática, agindo como emulsificantes de hidrocarbonetos. São polímeros que formam micelas que se acumulam na interface entre líquidos de diferentes graus de polaridade. A demanda por surfactantes aumentou consideravelmente dentro da indústria química. A utilização de biossurfactantes tornou-se uma alternativa bastante interessante em substituição aos surfactantes sintéticos, pois geram menor impacto ambiental devido à sua biodegrabilidade, diversidade estrutural e baixa toxicidade. O presente trabalho tem como objetivo a produção de biossurfactante através da fermentação do resíduo do processamento do abacaxi, por Bacillus subtilis, a C.

2 INTRODUÇÃO Surfactantes são agentes anfifílicos que, quando acumulados na superfície de interface entre duas fases imiscíveis, são capazes de reduzir a tensão superficial e interfacial (Ghodjavand, Vahabzadeh, Roayaei e Shahraki, 2008). Outra propriedade fundamental dos surfactantes é a tendência a formar agregados, as micelas, que, geralmente, se formam a baixas concentrações de água. A concentração mínima na qual se inicia a formação das micelas é denominada de Concentração Micelar Crítica (CMC), sendo uma importante característica dos surfactantes (Barros, Quadros, Móstica e Pastore, 2007). A CMC depende da estrutura do tensoativo (tamanho da cadeia do hidrocarboneto) e das condições experimentais (força iônica, contra-íons, temperatura etc), e as discussões sobre sua formação, funções e relações com aplicações industriais é de extrema importância (Behring, 2004). A propriedade de redução das tensões superficial e interfacial fazem os surfactantes serem adequados para uma ampla gama de aplicações industriais, envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases (Nitschke e Pastore, 2002). Os tensoativos quando em solução, devido à presença do grupo lipofílico, ocupam preferencialmente a superfície do líquido, diminuindo a força de coesão entre as moléculas do solvente e, consequentemente, diminuindo a tensão superficial (Behring, 2004). Assim como os surfactantes, os biossurfactantes são compostos formados por moléculas com porções hidrofóbicas e hidrofílicas que, através de seu acúmulo nas interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade (água/óleo, óleo/água), reduzem as tensões superficiais e interfaciais, aumentando a área superficial de compostos insolúveis, permitindo o aumento da mobilidade, biodisponibilidade e subsequente biodegradação. (Banat, 2000). Diferentemente dos surfactantes sintéticos, os biossurfactantes são compostos de origem natural, produzidos por bactérias, fungos ou leveduras. Os primeiros relatos envolvendo a utilização de biossurfactantes datam de 1949, quando Jarvis e Johnson detectaram as atividades antibiótica e hemolítica de um ramnolipídeo, e de 1968, quando Arima descobririu a existência de um novo composto biologicamente ativo produzido por Bacillus subtilis, o qual foi denominado surfactina, devido à sua grande atividade superficial, tendo, posteriormente, sua estrutura elucidada. Mais tarde, foi registrada a produção de biossurfactante em meios hidrofóbicos, o que levou a estudos de sua aplicação em tratamento de resíduos de petróleo, recuperação de petróleo, biorremediação e dispersão no derramamento de óleos (Barros, Quadros, Móstica e Pastore, 2007).

3 Ainda segundo Barros, Quadros, Móstica e Pastore (2007), a indústria petrolífera era o grande mercado para biossurfactantes até a década de 90, porém a diversidade química destas moléculas fornece uma ampla variedade de compostos com propriedades específicas, que permitem aplicações comerciais em diversos setores industriais. Nas últimas décadas, os biossurfactantes ganharam maior atenção por apresentarem algumas vantagens em relação aos surfactantes, tais como: biodegrabilidade, baixa toxicidade, aceitabilidade ecológica e possibilidade de serem produzidos com a utilização de matériasprimas renováveis, de baixo custo (Nitschke e Pastore, 2006). A vasta aplicação destes compostos e suas propriedades são muito interessantes. Dentre eles podemos citar os lipopeptídeos, usualmente produzidos por Bacillus (Ghodjavand, Vahabzadeh, Roayaei e Shahraki,2008). Segundo Nitschke e Pastore (2002), atualmente nos países industrializados, 70 a 75% dos surfactantes consumidos são de origem petroquímica, enquanto nos países em desenvolvimento os compostos de origem microbiana predominam. Há, entretanto, uma tendência dos países industrializados passarem a utilizar surfactantes naturais, pela necessidade de uso de produtos mais brandos e biodegradáveis. De acordo com Barros, Quadros, Móstica e Pastore (2007), a produção de surfactantes excede 3 milhões de toneladas/ano, sendo que sua utilização se concentra nas indústrias de petróleo, cosméticos, de produtos de higiene e limpeza. O aumento da preocupação ambiental entre os consumidores, combinado com as novas legislações de controle do meio ambiente, levaram a procura de biossurfactantes como alternativa aos produtos existentes. Os biossurfactantes vêm sendo testados em aplicações ambientais como a biorremediação, dispersão de efluentes oleosos, otimização da recuperação de óleos e transferência de óleo cru. São compostos que podem substituir os surfactantes químicos no futuro, especialmente em indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica, produtos de limpeza industriais, produtos químicos agroindustriais e em processos de biorremediação, já que são biodegradáveis, possuem baixa toxicidade e apresentam estabilidade em valores extremos de ph, temperatura e salinidade (Pinto, Martins e Costa, 2009). Os conceitos de produção de biossurfactante de baixo custo incluem melhoria de rendimento de produção por melhoria de tensão, otimização de mídia, ou operação de biorreator e design, bem como a utilização de substratos mais baratos e renováveis, tais como açúcares, óleos, alcanos, e resíduos para reduzir o custo do substrato de fermentação (Yeh, Wei e Chang, 2006). Os biossurfactantes produzidos por microrganismos podem ser obtidos utilizando-se procedimentos relativamente simples e substratos baratos, através de processos de fermentação.

4 Açúcares e óleos são fontes de carbono adequadas para a obtenção de tensoativos ecologicamente seguros (Bueno, Silva e Garcia-Cruz, 2010). Processos industriais e ambientais estão frequentemente associados a condições extremas de temperatura, pressão, força iônica, ph e presença de solventes orgânico. Diversos estudos têm avaliado a estabilidade dos biossurfactantes frente a essas condições. Isto ocorre em função da necessidade de uma avaliação do comportamento destes compostos para que sua utilização seja viabilizada (Barros, Quadros e Pastore, 2008). Os biossurfactantes, de modo geral, podem ser classificados em: glicolipídeos, lipossacarídeos, lipopeptídeos, fosfolipídeos e ácidos graxos/lipídeos neutros (como os ácidos ustilágico e corino- micólico), além de surfactantes poliméricos e surfactantes articulados, sendo os lipopeptídeos os biossurfactantes mais efetivos (Barros, Quadros, Móstica e Pastore, 2007). Os surfactantes lipoprotéicos são talvez os mais conhecidos por suas atividades antibióticas, sendo melhor caracterizados aqueles produzidos por Bacillus sp, incluindo surfactina, iturina, fengicina, liquenisina, micosubtilisina e bacilomicina (Barros, Quadros, Móstica e Pastore, 2007). A surfactina é reconhecida como um dos biossurfactante mais eficaz disponíveis, mas o alto custo e o baixo rendimento envolvidos na produção limitou suas aplicações. Desta forma, o desenvolvimento de estratégias de alto rendimento e baixo custo de produção da surfactina é de demanda urgente (Yeh, Wei e Chang, 2006). A aplicação do resíduo do abacaxi como substrato de fonte renovável garante o baixo custo na produção do surfactante microbiológico, uma vez que este fruto é extensivamente cultivado no Brasil, o qual é o segundo maior produtor mundial. Além disso, a utilização de biossurfactantes, substituindo os surfactantes sintéticos, é mais viável ecologicamente por se tratar de um produto biodegradável e com baixa toxicidade. OBJETIVO O presente trabalho tem como objetivo a produção de biossurfactante, mais precisamente a surfactina, através da fermentação do resíduo do processamento do abacaxi, por Bacillus subtilis.

5 PLANO DE TRABALHO E CRONOGRAMA O aluno deverá cumprir as disciplinas ao longo do ano de Inicialmente, será feita a revisão bibliográfica e esta deverá ser estudada de forma continuada até o final da parte experimental, a fim se aprofundar no tema escolhido, observar as lacunas sobre a pesquisa que deverão ser preenchidas e aplicar os conhecimentos obtidos nas análises que serão realizadas. Posteriormente, iniciará a fase de coleta de dados experimentalmente em laboratório. Ao término da coleta, os dados serão analisados estatisticamente, a fim de avaliar os resultados obtidos. A redação da qualificação será feita ao fim dos experimentos seguida da defesa de qualificação. Após coleta de informações nos conteúdos bibliográficos existentes, coleta de dados experimentais, análise estatística dos dados e qualificação, iniciará a fase de confecção da tese propriamente dita, com término ao final do ano de 2014 e defesa. CRONOGRAMA ATIVIDADES Disciplinas Revisão Bibliográfica Análises Experimentais Análise de dados/resultados Redação e Defesa Qualificação Redação Tese Defesa Tese MESES / X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X MATERIAIS E MÉTODOS MATERIAIS Microrganismo: A bactéria Bacillus subtilis ATCC 6051 Lote T17/01/I pertence à Coleção de Culturas Tropical e foi gentilmente cedida pela Fundação André Tosello. Substrato: para a produção do biossurfactante será utilizado como substrato resíduo do processamento do abacaxi gentilmente cedido pelo hortifrúti Oba de Campinas-SP. Meio de Cultura: para o crescimento do microrganismo será utilizado o meio de cultura ágar nutriente, ph 7.4 ± 0.2, fabricante OXOID [(g.l -1 ) extrato de carne 1,0g; extrato de levedura 2,0g; peptona 5,0g; cloreto de sódio 5,0g; ágar 15,0g].

6 Tampão ph 8,0: para manter o ph do substrato constante durante a fermentação, será preparada solução tampão fosfato ph 8,0, seguindo a metodologia descrita por Morita e Assumpção (1995). MÉTODOS - Condições de cultivo e produção do biossurfactante Repique do microrganismo: serão realizados 10 tubos de repique do Bacillus subtilis. Os tubos contendo ágar nutriente serão autoclavados por 15 minutos e deixados em repouso até esfriar. O repique será então realizado, com auxílio de alça de platina e bico de bulsen. Os tubos repicados serão incubados por 24 horas e mantidos refrigerados. Preparação do pré-inóculo: será preparada uma solução de peptona a 2% em água destilada em erlenmeyer de 250mL. Essa solução será autoclavada por 15 minutos e, após resfriamento, irá inocular a cultura com auxílio de alça de platina e bico de bulsen. Posteriormente, será. Meio de produção: em seis frascos de 250mL serão adicionados 60mL de caldo do abacaxi previamente filtrado e 20mL de tampão ph 8,0. Os frascos serão Produção do biossurfactante: as fermentações para a produção serão realizadas com seis erlenmeyers de 250mL, contendo o meio de produção anteriormente descrito e em cada um deles acrescidos 16mL do pré-inoculo (20%). Os frascos serão serão submetidas à determinação de tensão superficial e índice de emulsificação. Tensão superficial: a medida da tensão superficial será realizada de acordo com o método do peso da gota descrito por Behring (2004). Índice de emulsificação: a emulsificação será medida através da proporção óleo/biossurfactante, de acordo com a metodologia proposta por Cooper e Goldenberg (1987). Serão utilizados 3 diferentes tipos de óleos (óleo de soja, diesel e óleo de motor) e a análises serão feitas em duplicatas. ph: a medida do ph será realizada com 50mL do biossurfactante produzido, com o auxílio de um phmêtro eletrônico. ANÁLISE DE DADOS A análise dos dados obtidos experimentalmente será feita estatisticamente, avaliando os valores obtidos de tensão superficial, índice de emulsão e ph.

7 REFERÊNCIAS Barros FFC, Quadros CP, Móstica Júnior MR, Pastore GM. Surfactina: Propriedades Químicas, Tecnológicas e Funcionais para Aplicações em Alimentos. Quim Nova. 2007; 30(2): Barros F, Quadros C, Pastore G. Propriedades emulsificantes e estabilidade do biossurfactante produzido por Bacillus subtilis em manipueira. Ciênc. de Tecnologia de Alimentos. [Internet] [cited 2014 Mar 19]; 2008(003159): Available from: Behring JL, Lucas M, Machado C, Barcellos IO. Adaptação no Método do Peso da Gota Para Determinação da Tensão Superficial: Um método simplificado para a quantificação da CMC de surfactantes no Ensino da Química. Quim Nova. 2004; 27(3): Bueno SM, Silva AN, Garcia-Cruz CH. Estudo da Produção de Biossurfactante em Caldo de Fermentação. Quim Nova. 2010; 33(7): Ghojavand H, Vahabzadeh F, Roayaei E, Shahraki AK. Production and properties of a biosurfactant obtained from a member of the Bacillus subtilis group (PTCC 1696). J Colloid Interface Sci [Internet] Aug [cited 2014 Mar 12]; 324(1-2): Available from: Nitschke M, Pastore GM. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresour Technol [Internet] Jan [cited 2014 Mar 11]; 97(2): Available from: Nitschke M, Pastore M. Biossurfactantes: Propriedades e Aplicações. Quim Nova. 2002; 25(5): Pinto MH, Martins RG, Costa JAV. Avaliação Cinética da Produção de Biossurfactantes Bacterianos. Quim Nova, Vol32, No ; 32(8): Yeh MS, Wei YH, Chang JS. Bioreactor design for enhanced carrier-assisted surfactin production with Bacillus subtilis. Process Biochem [Internet] Aug [cited 2014 Feb 20];41(8): Available from: