Ciência e Tecnologia de Alimentos Print ISSN AVALIAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETERMINAÇÃO DE β-caroteno EM MACARRÃO FORTIFICADO 1

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1 Página Web 1 de 9 Ciência e Tecnologia de Alimentos Print ISSN Ciênc. Tecnol. Aliment. vol.18 no.1 Campinas Jan./Apr doi: /S Curriculum ScienTI How to cite this article AVALIAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETERMINAÇÃO DE β-caroteno EM MACARRÃO FORTIFICADO 1 Maricilda R. PEREIRA 2, J. AMAYA-FARFAN 3, D.B. RODRIGUEZ-AMAYA 3 RESUMO O β-caroteno sintético pode ser adicionado tecnologicamente ao macarrão na forma de solução oleosa, emulsões dispersíveis em água ou sob a forma de esferas coloidais, com a finalidade de melhorar a sua cor e valor vitamínico. Todavia, a inexistência de uma metodologia confiável e especificamente testada para a extração e dosagem do β-caroteno em macarrão enriquecido dificulta a avaliação da possível relevância nutricional da medida. O presente trabalho compara dois métodos de extração para produtos secos (LIVINGSTON, 1986 [método I] e RITTER & PURCELL, 1981 [método II]) e um para verduras e frutas (RODRIGUEZ-AMAYA et al., 1976 [método III]), quanto à eficiência de extração do β-caroteno no macarrão cru e cozido. A matéria-prima utilizada foi um lote de macarrão produzido com quantidade conhecida de β-caroteno, na forma de suspensão oleosa a 30%. Os resultados mostraram uma taxa de recuperação para β-caroteno de 89 e 84% pelos métodos III e I, respectivamente, enquanto que o método II apresentou recuperação de apenas 44%. Conclue-se que, tanto os métodos I e III podem ser usados para quantificar o β-caroteno em macarrão enriquecido. Por outro lado, a separação dos produtos de degradação do caroteno permite calcular o valor vitamínico real do macarrão cru e cozido. A superestimação dos valores vitamínicos, quando tais produtos não foram excluídos, foi de 24% para o macarrão cru e 25% para o cozido. Palavras-chave: β-caroteno, valor vitamínico-a, corante, macarrão.

2 Página Web 2 de 9 SUMMARY EVALUATION OF THE ANALYTICAL METHODOLOGY FOR THE DETERMINATION OF β-carotene IN FORTIFIED PASTA. Synthetic β- carotene can be technologically added to macaroni either in the form of an oily solution, water-dispersible emulsions or colloidal beadlets with the objective of improving its color and vitamin-a value. The lack of a reliable and tested methodology specifically for the extraction and quantification of β-carotene in enriched pasta prevents accurate evaluation of the possible nutritional significance of this measure. The present work compares two methods of extraction for dry products (LIVINGSTON, 1986 [method I] and RITTER & PURCELL, 1981 [method II]) and one for fruits and vegetables (RODRIGUEZ- AMAYA et al., 1976 [method III]), with respect to their extraction efficiency of β-carotene from both raw and cooked spaghetti. The raw material used for the experiment was a lot of spaghetti made with a known amount of β-carotene in the form of an oily 30% suspension. Results showed that percent recoveries for the carotene were 89 and 84 for methods III and I, respectively, whereas with method II only 44% recovery was attained. It can be concluded that both methods I and III can be used to determine β-carotene in enriched spaghetti. In addition, separation of the carotenoid degradation products is necessary for calculating the real vitamin A value in both raw and cooked pasta. Overestimation of the vitamin A values if degradation products were not separated was 24 for the raw and 25% for the cooked spaghetti. Key words: β-carotene, vitamin-a value, colorant, spaghetti fortification 1 - INTRODUÇÃO A natureza da amostra é uma consideração importante na escolha da metodologia analítica a ser utilizada na determinação de carotenóides provitamínicos A. No caso de amostras secas, a extração é uma das principais fontes de erro. Para este tipo de amostras tem sido proposta uma hogeneização em liquidificador, seguida de agitação com água e etanol, antes da sua extração com éter de petróleo (9). Outro método (7) propõe um processo de agitação a frio em substituição da extração e saponificação a quente sugerida no método da AOAC (1), como alternativa para a extração de xantofilas de plantas secas. Já um terceiro método (10), desenvolvido para frutas e verduras frescas, consiste em homogeneizar a amostra diretamente com acetona e filtrar em funil Buchner repetidas vezes, até se obter extrato incolor. RODRIGUEZ-AMAYA (11) recomenda que, independente do método a ser escolhido, alguns requisitos devem necessariamente ser preenchidos: O método deve separar ou remover os carotenóides não provitamínicos interferentes, separar as provitaminas e quantificá-las individualmente. As análises devem ser cuidadosas e rápidas, uma vez que a cadeia poliênica insaturada do β-caroteno é muito sensível ao oxigênio, à luz e ao calor. Além disso, as características estruturais da molécula se modificam na presença de álcalis e ácidos; logo, as amostras e extratos de carotenóides devem sempre ser protegidos da luz e estocados por tempo mínimo, na ausência de oxigênio (em vácuo ou em atmosfera de N2 ou Ar) e sob congelamento (3).

3 Página Web 3 de 9 O macarrão colorido com β-caroteno pode ser considerado como fortificado ou nutrificado. Atualmente, na comercialização usa-se o qualificativo de "vitaminado", quando de fato, o produto recebe a provitamina em quantidades que, segundo o rótulo, devem fornecer entre 2000 e 4000 UI de vitamina A por kg. Sendo que a fortificação de alimentos industrializados se apresenta como um dos meios de combate à deficiência de vitamina A, reconhecida em certas regiões do território brasileiro, é de interesse nutricional e tecnológico avaliar a eficácia desta técnica aplicada ao macarrão. A avaliação deve incluir a monitoração da quantidade do nutriente adicionado, desde a fabricação até o preparo e consumo a nível doméstico, para o qual é necessário contar com um método analítico com precisão e exatidão que o façam confiável. Apesar dessa necessidade, na literatura não foi encontrada uma metodologia analítica específica para a determinação de β-caroteno em massas alimentícias enriquecidas. Existe um trabalho sobre a estabilidade do β-caroteno em massas vitaminadas (12), mas não foi encontrada descrição da metodologia ou referência e validação da mesma. Nesse trabalho concluiu-se que o β-caroteno exercia apenas uma função de corante. O objetivo do presente trabalho foi comparar três métodos de extração existentes e estabelecer um procedimento analítico completo para a determinação exata e precisa da provitamina A em macarrão Material 2 - MATERIAL E MÉTODOS Dois tipos de espaguete foram utilizados para o estudo: um de tipo comercial e outro produzido em laboratório, com farinha de trigo especial (Braswey S.A., Ind.e Com.), acrescida de suspensão oleosa a 30% de β-caroteno (lote , fornecido pela Hoffmann- La Roche, Ltd.), em quantidade suficiente para uma concentração final de 4,75 mg/kg de produto. A suspensão comercial do pigmento foi pesada e diluída em óleo de soja (24 C) para 1,9mg de β-caroteno/ml de óleo e, finalmente preparado premix, contendo 9,5mg, por 100g Fabricação A elaboração do macarrão compreendeu os seguintes passos: mistura do premix à farinha, hidratação e homogeneização, extrusão e moldagem, seccionamento, secagem, embalagem. A farinha foi hidratada até 30% de umidade, como recomendado por BANASIK (2). O trabalho da massa foi realizado no misturador do extrusor, o qual era composto de um eixo duplo de pás entrepostas. A massa era conduzida ao cilindro de extrusão sob a ação de rosca sem-fim, com o uso de vácuo. A moldagem foi determinada por orifícios de 3mm de diâmetro, recobertos com Teflon. Após a moldagem, o espaguete foi recortado no comprimento de 50cm e estendido sobre grades de bastões de madeira. Para efetuar a secagem, as grades foram introduzidas em secador de paredes de madeira e portas de acrílico, com circulação forçada de ar e temperatura (45 C) e umidade (95 a 65%) controladas. O espaguete produzido foi embalado em sacos de polietileno (0,2mm) e recobertos com papel alumínio por dois dias, quando se iniciaram as análises Avaliação do macarrão

4 Página Web 4 de 9 Tempo de cozimento, aumento de peso, aumento de volume e perda de sólidos solúveis foram parâmetros observados para determinar a qualidade do macarrão produzido no laboratório (8). Para o tempo de cocção de 11 min., até atingir o ponto "al dente", o macarrão mostrou um aumento médio de peso de 185,5%, aumento médio de volume de 356% e perda média de sólidos de 13,8%. Excetuando a perda de sólidos solúveis, que foi acima do esperado, a qualidade geral do macarrão pode ser considerada boa (4) Métodos de extração do β-caroteno Foram avaliados os três métodos de extração, abaixo descritos, a fim de definir as suas eficiências Método I (LIVINGSTON, 1986 [8]) Este método consiste na saponificação e extração simultânea a frio. Com a ajuda de agitador magnético, as amostras cruas e cozidas foram saponificadas com KOH a 40% (1ml:1g), extraídas com hexano-acetona-etanol (10:7:6) e mantidas sob agitação durante uma hora. Após essa operação, água foi adicionada (0,5ml/g, somente para amostras cruas), o sistema agitado por 30min, adicionado o hexano e agitado por mais 5min. A barra magnética foi removida e adicionou-se 20ml de Na 2 SO 4 a 10%, em água, com agitação vigorosa durante 1min. O extrato foi mantido no escuro por 1hr, filtrado em funil Buchner e lavado várias vezes com água destilada em funil separatório. A seguir, o extrato foi evaporado, até próximo da secura, efetuando-se então a transferência para éter de petróleo e aferindo-se o volume em pequenos balões volumétricos Método II (RITTER & PURCELL, 1981 [9]) No método II, as amostras foram agitadas, com 50ml de água e, a seguir, com 50ml de etanol em liquidificador de copo de aço inoxidável, por aproximadamente quinze segundos, cada vez. No caso do macarrão cozido, a adição de água foi omitida. Transferência quantitativa para funil separatório de 500ml foi obtida com a mistura água-álcool (1:1). A extração se deu por agitação desta mistura com éter de petróleo (cerca de 80ml), sendo a fase água-álcool colocada num outro funil separatório, onde a extração foi repetida até não se obter mais extrato colorido. Os extratos em éter de petróleo foram reunidos e lavados por três vezes com água destilada. O extrato global foi seco com sulfato de sódio anidro, concentrado em rotoevaporador e o volume acertado em balão volumétrico Método III (RODRIGUEZ-AMAYA et al., 1976 [10]) Após 30min de hidratação da amostra crua (1,5ml de água/g), procedeu-se à extração, com acetona em liquidificador de copo de aço inoxidável. O homogeneizado é filtrado em funil de Buchner e a extração repetida até o resíduo e o filtrado se mostrarem incolores. A partição para éter de petróleo foi realizada a seguir em funil de separação. Por fim, o extrato foi concentrado em rotoevaporador e seu volume aferido em balão volumétrico Cromatografia em Coluna Clássica Com o objetivo de separar os produtos de degradação do β-caroteno, os extratos obtidos pelos três métodods foram cromatografados em coluna clássica (aberta). A coluna, contendo mistura homogênea de MgO/Hiflosupercel (1:2), foi empacotada com o auxílio de vácuo. As amostras foram primeiramente eluídas com éter de petróleo, depois com éter etílico em éter de petróleo a 4%, para separar a fração β-caroteno e, a seguir, com concentrações crescentes de acetona em éter de petróleo (8, 15, 20, 30, 40 e 100%), para separar as demais frações. As

5 Página Web 5 de 9 frações eluídas, contendo acetona, foram lavadas três vezes em funil separatório para remoção da acetona, concentradas e completados os seus volumes Quantificação do β-caroteno A quantificação do extrato total foi feita, em primeira instância, supondo que se tratasse de todo-trans-β-caroteno; isto é, utilizando-se a absortividade específica de 2592, em éter de petróleo (5) e a absorvância no comprimento de onda máximo do espectro visível (espectrofotômetro Beckman DU-70) Cromatografia em Camada Delgada e Reações Específicas As bandas isoladas, reduzidas a volume mínimo, foram aplicadas em placas de sílica-gel 60 (Merck, 0,25mm de espessura), preparadas no laboratório e ativadas a 110 C, por 1 hora. A fase móvel utilizada foi metanol a 3% em benzeno. Os produtos epoxidados foram reconhecidos, na camada delgada, pela mudança de coloração da mancha de amarelo ou laranja, para azul ou verde, após exposição da placa a vapores de HCl (6). Para confirmar a configuração cis ou trans das frações, foi empregada a reação de fotoisomerização (5), pela adição de algumas gotas de solução de iodo e exposição à luz por 5min. O carotenóide originalmente todo-trans, mostrará um deslocamento do máximo espectral para comprimento de onda mais baixo, por razão da isomerização para a forma cis. O contrário ocorre se o carotenóide já for da forma cis Taxa de Recuperação do β-caroteno e Análise Estatística A porcentagem de perda foi apurada como a diferença entre a quantidade de pigmento extraída do premix menos a extraída do macarrão fabricado em laboratório, dividida pela quantidade no premix e multiplicada por 100. As determinações foram realizadas usando-se os três métodos descritos, sendo que o valor usado para o premix não incluiu aquele obtido com o método II. A análise estatística dos dados foi realizada com o auxílio dos softwares SAS e S-Plus. Comparação das médias foi obtida pelo teste de Duncan. 3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO Com o objetivo de testar a eficiência de extração dos três métodos, foi feita uma avaliação preliminar em macarrão comercial fortificado, no estado cru. Considerando que os três métodos não poderiam ser testados simultaneamente, dado o número de amostras a serem analisadas num reduzido tempo, decidiu-se comparar I contra III e I contra II, em ocasiões diferentes. Estes estão apresentados na Tabela 1. Além do método II extrair menor quantidade de carotenóide total, é evidente pela Tabela 1, que a média da fração ( foi sensivelmente inferior às obtidas com os outros dois métodos. A fração β-caroteno teve sua identidade confirmada pelos seguintes parâmetros: espectro de absorção, valor de RF na camada delgada e pela estabilidade da cor após o teste para epoxicarotenóides.

6 Página Web 6 de 9 O teor médio de β-caroteno encontrado no premix foi de 7,5±0,1 mg/100g, pelo método I, e 7,1 ± 0,2 mg/100g, utilizando o método III. Pelos valores individuais das repetições, foi possível notar o relativo grau de homogeneidade do premix, do qual 100g foram utilizados para a elaboração de 2kg de macarrão em laboratório. Para determinar as quantidades extraídas e a recuperação do pigmento no macarrão, cru e cozido, cada um dos três métodos foi utilizado, sendo que somente os resultados dos métodos I e III foram considerados satisfatórios para estabelecer o título do premix. A Tabela 2 mostra os teores de carotenóide total e β-caroteno encontrados no macarrão elaborado em laboratório, no estado cru. A análise estatística dos resultados apresentados na Tabela 2 indica que os valores obtidos pelo método II são significativamente menores, sendo que os obtidos pelos métodos I e III são equivalentes, pelo teste de Duncan (P<0,05). Situação análoga foi observada quando os métodos foram aplicados ao macarrão cozido (Tabela 3), com a diferença de que o método III extraiu quantidades maiores do que o método I, sem que entretanto, a diferença tenha sido significativa.

7 Página Web 7 de 9 Para o macarrão cru, os métodos I e III apresentaram as maiores taxas de recuperação (84 e 89%, respectivamente; Tabela 4). Deve ser levado em conta o fato desta recuperação incluir, não somente a perda inerente ao método, mas também quaisquer perdas associadas ao processamento do macarrão. Apesar da dificuldade de separar a recuperação do método de extração das perdas inerentes ao processamento, considera-se que a avaliação da metodologia é mais adequada se aplicada a um produto de composição conhecida. De qualquer forma, as recuperações analíticas obtidas para os métodos I e III foram aparentemente satisfatórias. O valor vitamínico A do macarrão foi calculado de duas formas: utilizando tanto o teor total de carotenóides, como a fração β-caroteno (Tabela 2). Considerando o teor total de carotenóides, isto é, incluindo produtos de degradação sem valor vitamínico, a superestimação incorrida, para o produto cru, foi de 24, 10 e 20%, pelos métodos I, II e III, respectivamente. Já para o macarrão cozido (Tabela 3), o cálculo do valor vitamínico pelo teor total de carotenóides, resulta em superestimação de 25% por ambos os métodos I e III. Pelo método II, a extração é tão baixa que a diferença entre os carotenóides totais e a fração β-caroteno não foi perceptível. Pelas características espectrais e de coloração das manchas correspondentes aos produtos de degradação, pode afirmar-se que esses são respectivamente cis-isômeros e epoxicarotenóides. 4 - CONCLUSÃO Da comparação de metodologias para a dosagem de β-caroteno em macarrão enriquecido, pode-se concluir que: os métodos I (7) e III (10) mostraram-se igualmente eficientes (taxas de recuperação de 84 e 89%, respectivamente), podendo ser indistintamente usados para analisar o macarrão cru e cozido. O método II (9), sugerido originalmente para produtos secos, mostrou-se insatisfatório. 2. É recomendável efetuar a separação cromatográfica dos produtos de degradação para evitar

8 Página Web 8 de 9 uma superestimação de aproximadamente de 20 a 25% no valor vitamínico A do macarrão enriquecido. 5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (1) A.O.A.C. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists. Arlington, VA, 14th ed, p835-6, (2) BANASIK, O.J. Pasta processing. Cereal Foods World, v.26, n.4, p , (3) BRITTON, G.; YOUNG, A.J. Methods for isolation and analysis of carotenoids. In: BRITTON, G.; YOUNG, A.J., eds. Carotenoids in photosynthesis. London:Chapman & Hall, cap. 10, p (4) CIACCO, C.F.; CHANG, Y.K. Massas: tecnologia e qualidade. Campinas:Editora da UNICAMP-Ícone, 127p., (5) DAVIES, B.H. Carotenoids. In:GOODWIN, T.W. Chemistry and biochemistry of plant pigments. London:Academic Press, v.2, p (6) GROSS, J.; GABAI, M.; LIFSHITZ, L. Carotenoids in juice of shamouti orange. Journal of Food Science, v.36, p , (7) LIVINGSTON, A.L. Rapid analysis of xanthophyll and carotene in dried plant materials. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v.69, n.6, p , (8) PIZZINATTO, A; MAGNO, C.P.R.; CAMPAGNOLLI, D.M.F.; VITTI, I.P.; LEITO, R.F.F. Avaliação tecnológica de produtos derivados de farinhas de trigo (pão, macarrão, biscoito). Centro de Tecnologia de Farinhas e Panificação, Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), Campinas, SP, pp. (9) RITTER, E.De; PURCELL, A.E. Carotenoid analytical methods. In: BAUERNFEIND, J.C., Carotenoids as colorants and vitamin A precursors. Technological and nutritional applications. Florida: Academic Press, cap.10, p (10) RODRIGUEZ-AMAYA, D.B.; RAYMUNDO, L.C., LEE, T.C.; SIMPSON, K.L.; CHICHESTER, C.O. Carotenoid pigment changes in ripening Momordica charantia fruits. Annals of Botany, v.40, p , (11) RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Critical review of provitamin A determination in plant foods. Journal of Micronutrient Analysis, v.5, p , (12) SABINO, M.; INOMATA, E.I.; PREGNOLATO, W. Estabilidade do β-caroteno em massas alimentícias vitaminadas. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.39, n.1, p.55-59, AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à CAPES pela bolsa de pós-graduação concedida ao primeiro autor e à FAPESP pelo auxílio financeiro.

9 Página Web 9 de 9 1 Recebido para publicação em 19/06/97. Aceito para publicação em 10/03/98. 2 Aluna de mestrado. 3 Professor da Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP SBCTA Av. Brasil, 2880 Caixa Postal Campinas SP - Brazil Tel.: Tel./Fax.: publicacoes@sbcta.org.br