AVALIAÇÃO IN SILICO DO POLIMORFISMO DA REGIÃO AMONTANTE DE GENES RELACIONADOS À AUTOFAGIA EM PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS.

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1 AVALIAÇÃO IN SILICO DO POLIMORFISMO DA REGIÃO AMONTANTE DE GENES RELACIONADOS À AUTOFAGIA EM PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS. Ana David Cruz de França, Ana Caroline Vitorio da Silva Braz, Flavia Villaça Morais. Faculdade de Ciências da Saúde, Curso de Biomedicina, Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP). Av Shishima Hifume 2911, Urbanova, São José dos Campos, SP, CEP Resumo- Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico que apresenta na forma de micélio à 25 C e na de levedura à 36 C. Este dimorfismo é fat or indispensável para que o fungo se instale no homem, causando a paracoccidioidomicose (PCM). Um mecanismo possivelmente envolvido no dimorfismo é a autofagia, que em diferentes organismos pode estar envolvida, entre outras coisas, em processos de adaptação e sobrevivência à situações adversas. Sendo o dimorfismo do fungo situação necessária para o estabelecimento da PCM o objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de análises in silico, o polimorfismo das regiões amontantes de cinco genes relacionados a este processo no P. brasiliensis, a saber: ATG7, ATG18, VAM3, SEC23, PRB1, em três isolados do fungo (, e ). Os resultados mostraram que as seqüências analisadas do apresentaram extenso polimorfismo em relação às seqüências dos outros dois isolados, e, sugerindo uma possível variação no comportamento destes isolados durante o processo de autofagia. Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, autofagia, polimorfismo Área do Conhecimento: Ciências Biológicas Introdução Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, ou seja, a alteração da temperatura é fator indispensável para que ocorra a mudança de sua forma, que cresce como micélio à temperatura ambiente e como levedura em tecidos parasitados ou cultivados a 36 C (SAN BLAS et al., 2000). O fungo é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose de alta endemicidade na América Latina (RESTREPO, 1985). A PCM é uma micose sistêmica, de natureza granulomatosa crônica, que acomete frequentemente os pulmões e tecidos mucocutâneos, podendo disseminar-se por via linfo-hematogênica para tecidos e orgãos adjacentes (FRANCO, 1986). A infecção é adquirida por inalação de conídios do P. brasiliensis presentes em micronichos como solo e detritos vegetais, que, sob condições apropriadas, se instalam nos alvéolos pulmonares e sofrem dimorfismo de micélio para levedura. Fatores relacionados ao P. brasiliensis como virulência, patogenicidade e composição antigênica, estão associados às manifestações clínicas da doença (LONDERO et al., 1982). Autofagia é um processo usado pelas células para controle da homeostase e na adaptação às condições de estresse. Ocorre em todos os organismos eucariontes onde o citosol e organelas são sequestrados por uma vesícula de membrana dupla, os autofagossomos, e entregues aos lisossomos para serem degradados (vacúolos autofágicos). Assim, ocorre a reciclagem de moléculas para posterior utilização em novos processos celulares (KLIONSKY., 2005). Estudos recentes em diferentes microorganismos, Sacaromyces Cerevisiae (WANG e KLIONSKY.,2003) identificaram vários genes envolvidos no processo de autofagia demonstrando sua importância em diversos mecanismos biológicos, dentre os quais podemos citar: adaptação, diferenciação e desenvolvimento celular (KLIONSKY.,2005). Uma possibilidade é que a autofagia possa estar envolvida no processo de transição dimórfica do P. brasiliensis, atuando como possível fator de virulência. Análises moleculares de genes envolvidos em possíveis mecanismos de virulência tem demonstrado a existência de considerável variabilidade genética entre diferentes isolados de P. brasiliensis (MATUTE et al.,2006; MORAIS et al.,2000), o que pode refletir nos diferentes níveis de virulência observados entre os isolados ( CARVALHO et al.,2005). Assim, o objetivo foi verificar, através de análises "in silico, a presença de polimorfismo em genes envolvidos no processo de autofagia (APG7, ATG18, PRB1, SEC 23, VAM3) em três isolados do P. brasiliensis,, e. Metodologia Baseando-se em sequências genômicas de genes autofágicos de P. brasiliensis obtidas por 1

2 Braz e Morais, (2009), foram confirmadas por pesquisa no NCBI (Nactional Center for Biotechnology Information) utilizando a ferramenta BLAST( Basic local alignment search tool). A partir destas sequências, foi selecionada a região amontante do P. brasiliensis, com auxílio do broad institute ( Com uso do software bioedit que possui a ferramenta CLUSTALW MULTIPLE ALIGNMENT, que possibilita a realização do alinhamento das sequências de cada gene, foi realizada, então, o alinhamento dos três isolados (, e ), onde os nucleotídeos que se repetem entre eles, geram uma sequência padrão para comparação e análise do polimorfismo, denominado sequência consenso. Resultados A partir dos alinhamentos das seqüências dos genes relacionados à autofagia nos três isolados de P. brasiliensis (, e ) foi feito uma comparação entre os isolados com a seqüência consenso, podendo assim, avaliar o polimorfismo e similaridade entre os três isolados. Em todas as seqüências a região em branco significa o local onde ocorreu polimorfismo. As regiões amontantes dos três isolados do P brasiliensis, iniciam-se após o primeiro códon de iniciação do gene (adenina), que possui numeração 1, por isso que a seqüência da região reguladora foi numerada negativamente, pela localização antes do gene e tem tamanhos e número de nucleotídeos diferentes nos cinco genes porque todas elas terminam onde se inicia um outro gene. A Figura 1 representa o alinhamento das sequências da região amontante do gene ATG18, dos três isolados de P. brasiliensis (, e ). Apresenta pontos polimórficos com troca de nucleotídeos no isolado, localizados nas seguintes posições: ( -9, -21, -24, -68, -120, -136, - 143, -164) e 40 sitios de deleções nas posições (- 27, -193, -250 até -212). No isolado Pb 18 o ponto polimórfico se encontra na posição gene ATG18 dos três isolados do P. brasiliensis (,, ) A Figura 2 representa o alinhamento do gene SEC23 apresentando 8 pontos polimórficos e sitios de deleções no isolado e 1 ponto polimórfico no isolado e similaridade no isolado quando comparados a sequência consenso. Os pontos polimórficos onde ocorreram trocas de nucleotídeos do isolado encontram-se nas posições: (-19, -33, -38, -43, - 44, -70, -83, -117, -172, -173, -176, -178, -193), os sítios de deleções de nucleotideos nas posições (- 51, -52), os sítios de adição de nucleotídeos nas posições (-180 a -191, -224 a -238). E similaridade nos isolados e. Figura 1- Alinhamento da região amontante do Figura 2- Alinhamento das seqüências da região amontante do gene SEC23, dos três isolados de P. brasiliensis (, e ). 2

3 A Figura 3 representa o alinhamento dos três isolados do gene relacionado a autofagia PRB1, apresentando pontos polimórficos com troca de nucleotídeos, sitios de deleção e adição no e similaridade nos isolados e quando comparados a sequência consenso. Os 12 pontos polimórficos no isolado se encontram nas seguintes posições: (-18, --31, -58, -84, -86, -114, - 118, -147, -158, -161, - 165, -176), sítios de deleções nas seguintes posições dos nucleotídeos: (-9, -166, -167, -175, -185 a -189) e sítios de adição de nucleotídeos nas posições (- 43, -63, -64, ). nucleotídeos no isolado se encontram nas seguintes posições ( -9, -21, -24, -68, -120, -136, - 143, -164) e os 40 sitios de deleções nas posições (-27, -193, -250 até -212). O ponto polimórfico do se encontra na posição -111 e o apresenta-se similar quando comparados a sequência consenso. Figura 3- Alinhamento das seqüências da região amontante do gene PRB1, dos três isolados de P. brasiliensis (, e ). A Figura 4 abaixo representa o alinhamento dos três isolados do gene relacionado a autofagia ATG7. Apresenta 8 pontos polimórficos com troca de nucleotídeos e 40 sítios de deleção no isolado, 1 ponto polimórfico com troca de nucleotideo no isolado e similaridade no isolado quando comparados a sequência consenso. Os 8 pontos polimórficos com trocas de Figura 4- Alinhamento das seqüências da região amontante do gene ATG7, dos três isolados de P. brasiliensis (, e ). 3

4 A Figura 5 representa o alinhamento dos três isolados do gene relacionado a autofagia VAM3. Apresenta 5 pontos polimórficos com troca de nucleotídeos e 10 sítios de deleção no isolado, 2 ponto polimórfico com troca de nucleotideo no isolado e similaridade no isolado quando comparados a sequência consenso. Os 5 pontos polimórficos com trocas de nucleotídeos no isolado se encontram nas seguintes posições ( -14, -29, -50, -69, -76) e os 10 sitios de deleçôes nas posições(-118 a -127), os 2 ponto polimórfico do encontram-se nas posiçôes (-34 e -81) e o apresenta similaridades quando comparados a sequencia consenso. Figura 5- Alinhamento das seqüências da região amontante do gene VAM3, dos três isolados de P. brasiliensis (, e ). Discussão Pelos resultados, observamos vários pontos polimórficos de troca de nucleotídeos nos cinco genes autofágicos no isolado. Nos genes ATG7, PRB1, SEC23 e VAM3 observam-se sítios de deleção, e, nos genes SEC23 e PRB1, sitios de adições no isolado. No isolado observou-se pontos polimórficos com troca de nucleotídeos nos genes ATG7 e VAM3. Já o isolado, apresentou-se similar com a sequência consenso nos cinco genes, sem regiões polimórficas. Em trabalhos anteriores, o P. brasiliensis foi dividido em três classes filogenéticas: S1, PS2 e PS3, (MATUTE el al.) sendo o o principal representante do grupo S1 e com uma alta virulência quando comprovado em estudos com camundongos. (CALICH et al.,1998). O é representante do grupo PS2 e vem sendo muito usado em estudos de virulência molecular e filogeneticamente, pois é um isolado de baixa virulência. Já o isolado tem-se mostrado o mais diferente de todos, não se enquadrando até agora nas classificações filogenéticas e é mais estudado molecularmente. Sugerimos que isso poderia explicar a extensa variabilidade deste isolado comparado com os outros dois ( e ). O P. brasiliensis tem mostrado grande variabilidade genética quando analisado molecularmente, pelo estudo do gene PBG43. Este gene codifica uma proteína glicolisada GP43, sendo ela um antígeno dominante do P. brasiliensis bastante estudada nas últimas décadas por sua importância na proteção imune e diagnóstica (PUCCIA et al,2007). Por meio de análise em Southem blot com digestão de DNA e seqüenciamento do gene da GP43, foi demonstrado diversos pontos polimórficos entre 17 isolados de P. brasiliensis que alteram a proteína final refletindo assim na virulência do fungo (MORAIS et al.,2000). Estudos das regiões promotoras do PBGP43, entre os três isolados, apresentaram mais pontos polimórficos no isolado do que entre o e o. Sendo o mrna reduzido no com choque térmico e mantido inalterado nos e, podendo comprovar estudos já realizados que caracterizaram o por apresentar baixa virulência. (CARVALHO et al.,2005). Neste trabalho, através das diferenças encontradas, foi feita uma analise do polimorfismo da região amontante dos genes autofágicos, observando muitos pontos polimórficos entre o isolado quando comparado a seqüência consenso, e grande similaridade entre os isolados e. O dimorfismo, constituindo um mecanismo de defesa importante para adaptação de P. brasiliensis durante estabelecimento da doença e sobrevivência, pode ter relação com a autofagia, sendo assim, se confirmado, este trabalho contribuiria para futuras pesquisas que poderiam atuar na interferência de RNA ou alterar a regulação destes genes autofágicos impedindo assim a manifestação da autofagia impedindo diferenciação celular e podendo implicar na virulência do fungo. 4

5 Conclusão Conclui-se que existe um grande polimorfismo na região amontante no isolado, sendo este polimorfismo caracterizado por regiões de trocas, deleções e adições de nucleotídeo. No entanto o isolado não apresentou pontos polimórficos quando comparado com a sequência consenso porém grande similaridade com o isolado que apresentou poucos pontos polimórficos caracterizados por trocas de nucleotídeos em apenas dois dos cinco genes autofágicos. Referencias bibliográficas -PUCCIA, R. Diversity in Paracoccidioides brasiliensis. The PbGP43 gene as a genetic marker. Mycopathologia, RESTREPO, A. The ecology of Paracoccidioides brasiliensis: A puzzle still unsolved. Journal of Medical and Veterinary Mycology, SAN-BLAS, F; G. San-Blas. Protoplast production from the yeast phase of Paracoccidioides brasiliensis, WANG C W; KLIONSKY D J. The molecular mechanism of autophagy. Mol. Med., V.9, BRAZ, A. C. V. S; MORAIS F.V. Análise in silico de genes relacionados à autofagia de três isolados do Paracoccidioides brasiliensis: Avaliação do polimorfismo, trabalho de conclusão de curso (Graduação em Biomedicina), UNIVAP, BROAD INSTITUTE. Disponível em: Acesso em: 10 julho CALICH, V.L.; KASHINO, S.S. Cytokines produced by susceptible and resistant mice in the course of Paracoccidioides brasiliensis infection. Braz. J. Med. Biol., CARVALHO, K.C. Virulence of Paracoccidioides brasiliensis and gp43 expression in isolates bearing known PbGP43 genotype. Microbes and Infection. V.7, FRANCO, M. - Host-parasite relationship in paracoccidioidomycosis, J. med. vet. Mycol., KLIONSKY D.J. The molecular machinery of autophagy, Journal of Cell Science, MATUTE, D.R., McEwen, J.G., Puccia, R., et al., Cryptic speciation and recombination in the fungus Paracoccidioides brasiliensis as revealed by gene genealogies. Mol. Biol. Evol 23, MORAIS, F.V.; BARROS T.F.;FUKADA M. K.; CISALPINO P. S.; PUCCIA R. Polymorphism in the gene coding for the immunodominant antigen gp43 from the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. J. Clin. Microbiol. V.38, n.11, NACTIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. Disponível em: Acesso em: 20 ago

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