UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA CURSO DE MEDICINA Disciplina de Microbiologia AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA 2017

ÍNDICE LEMBRETES IMPORTANTES... 1 RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS... 1 MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA... 3 MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO... 6 CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS... 8 CONJUGAÇÃO BACTERIANA... 11 DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS... 13 STAPHYLOCOCCUS... 14 STREPTOCOCCUS... 17 PSEUDOMONAS... 20 ENTEROBACTÉRIAS... 22

1 LEMBRETES IMPORTANTES 1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do ambiente fora do laboratório. 2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados. 3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.). 4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório. 6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que deixe os pés expostos. 7. Não serão permitidas fotografias no interior do laboratório, salvo em caso de autorização do docente responsável pela aula. RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório individual da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente deverá ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo menos uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em seu relatório, mesmo que o entregue. Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais que duas folhas.

2 Docentes do Ciclo de Bacteriologia Prof. Dr. Augusto Cezar Montelli Prof. Dr. Josias Rodrigues Prof. Dr. Rodrigo Tavanelli Hernandes Profa. Vera Lúcia Mores Rall Técnicos responsáveis pelas aulas práticas Ivana Giovannetti Castilho Larissa Ragozzo Cardoso de Oliveira Luiz Henrique Alquati

3 MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das lâminas será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram coradas e estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas pelo método de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração (como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco ou bacilo). Além das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a observação de uma lâmina contendo um esfregaço de escarro apresentando bacilos álcool-ácido resistentes (que não se coram pelo método de Gram) e corada pelo método de Ziehl-Neelsen. Coloração de Bactérias pelo Método de Gram Material: - Lâminas contendo o esfregaço de bactérias - Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool 95%, fucsina. Procedimento: a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1 minuto. b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto. c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto, deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos. d) Lavar a lâmina em água corrente. e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto. f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro. g) Observar ao microscópio e desenhar na folha seguinte.

4 Desenhos: Lâmina A (Escherichia coli) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina B (Staphylococcus aureus) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina C (Streptococcus agalactiae) Forma: Arranjo: Gram:

5 Lâmina D (Bacillus cereus) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina E (Neisseria sp) Forma: Arranjo: Gram: Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) (Mycobacterium tuberculosis) Lâmina contendo um esfregaço de escarro de um paciente com tuberculose, corada pelo método de Ziehl- Neelsen e apresentando BAAR

6 MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias Material: - A (Escherichia coli) - B (Staphylococcus aureus) - C (Streptococcus agalactiae) - Caldo sintético - Caldo comum - Caldo glicosado (caldo comum acrescido de 1% de glicose) - Alça de níquel cromo Procedimento: 1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios. 2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio). 4. Anotar os resultados. A B C Crescimento em Caldo sintético Caldo comum Caldo glicosado B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano Material: - Meio de Tiogel - Caldo simples - A (Escherichia coli) - D (Pseudomonas aeruginosa) - F (Clostridium sp) - Agulha de níquel cromo

Procedimento: Com a agulha de níquel cromo, semear as culturas A e D em tubos de tiogel e incubar em estufa a 37 C. No dia seguinte, observar o crescimento das culturas A e D juntamente com a cultura F que foi previamente semeada quando do preparo da aula prática. Classificar cada cultura quando à dependência de oxigênio em aeróbia, anaeróbia ou facultativa, conforme o local de seu crescimento no tubo de tiogel (em cima, no fundo ou em toda a extensão do tubo) 7 A D F Local do crescimento no tubo Superfície Toda extensão Base do Meio Classificação

8 CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada ou não. Material - Suspensão da cultura A (Escherichia coli, bactéria não esporulada) em solução salina - Suspensão da cultura E (Bacillus cereus, bactéria esporulada) em solução salina - Placas de Petri contendo ágar nutriente e divididas em quadrantes, identificados pelo tempo de cultivo bacteriano em minutos (0, 5, 10 e 15 ). - Banho-Maria a 60º C - Alça de Níquel cromo Procedimento 1. Inocule (com a alça de níquel cromo) amostras das suspensões bacterianas A e E nas respectivas placas, no quadrante correspondente ao tempo 0. 2. Coloque, em banho-maria a 60º C, os tubos com a suspensões e, aos 5', 10' e 15', inocule novamente amostras das suspensões para os quadrantes correspondentes nas placas. 3. Deixe as placa na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 4. Observe a variação quantitativa de crescimento bacteriano nos quadrantes em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de crescimento). A E Tempo de aquecimento 0 5 10 15 B) Efeito de agentes químicos (antisséptico para enxague bucal) Material: - 3 suabes estéreis - Antisséptico bucal de uso comercial

9-1 placa de ágar-nutriente, dividida em três partes (identificadas por A, B e C) Procedimento: 1. Friccionar um suabe estéril na mucosa da bochecha e espalhar ( em ziguezague ) seu conteúdo no quadrante A da placa de ágar nutriente. 2. Bochechar, por 1 minuto, com parte do o antisséptico bucal fornecido. 3. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material, com outro suabe, espalhando seu conteúdo no quadrante B. 4. Bochechar novamente com o antisséptico bucal por 1 minuto. 5. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta com um novo suabe estéril espalhando seu conteúdo no quadrante C. 6. Deixe a placa na estufa a 37 C até o dia seguinte. 7. Fazer a leitura das placas, anotando com cruzes (de + a ++++), na tabela abaixo, a intensidade do crescimento microbiano, conforme o tempo de exposição ao antisséptico bucal. Tempo de exposição* A B C Crescimento Microbiano *Tempo de exposição ao antisséptico = A (antes do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo tratamento). C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias (álcool iodado a 0,1%) Material: - 1 tubo contendo aproximadamente 1 ml de álcool iodado a 0,1% - 1 placa de ágar-nutriente dividida em duas partes iguais, identificadas como antes e depois - 3 suabes estéreis Procedimento 1. Umedeça um suabe em salina, contida em um tubo de ensaio. Após retirar o excesso de salina, pressionando a suabe contra a parede do tubo, esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mãos; 2. Passe o suabe em uma das partes da placa com ágar nutriente ( antes );

3. Umedeça um segundo suabe em álcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da outra mão; 4. Aguarde 2 minutos para que o antisséptico aja sobre a microbiota da pele; 5. Passe então, nessa área, um terceiro suabe umedecido em salina, tomando cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Passe o suabe na superfície da outra metade da placa com ágar nutriente ( depois ) 6. Incube a placa na estufa a 37 C, durante uma noite. 7. Observe as placas e anote a intensidade do crescimento microbiano com sinal + (de + a++++) na tabela abaixo 10 Sem álcool-iodado 0,1% Com álcool-iodado 0,1%

11 CONJUGAÇÃO BACTERIANA Material: - 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal), dividida em duas partes iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas. - 1 placa de ágar MacConkey contendo cloranfenicol (Clo), dividida em duas partes iguais, identificadas com as culturas a serem semeadas. - 1 placa de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico e cloranfenicol (Nal + Clo) dividida em três partes, identificadas com as culturas a serem semeadas. - Escherichia coli C600, não fermentadora de lactose (lac-) (cultura A) em meio líquido. - Escherichia coli J53 fermentadora de lactose (lac+) (cultura B) em meio líquido - mistura das culturas A e B (cultura M) em meio líquido. - alça de níquel cromo. Procedimento: 1. Semear as culturas A e B nas partes correspondentes da placa de ágar MacConkey contendo Nal. Fazer o mesmo na placa contendo Clo. 2. Semear as culturas A, B e M nas partes correspondentes da placa de ágar MacConkey contendo Nal+Clo 3. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte. 4. Verificar a ocorrência de crescimento (+ ou -) e o fenótipo de fermentação de lactose (+ ou -) das culturas que cresceram e anote os resultados na tabela abaixo. Crescimento em ágar MacConkey contendo: Nal Clo Nal + Clo Fermentação da lactose A B M

12 Responda as seguintes questões: - Quais as hipóteses possíveis para explicar o ocorrido? - Como você poderia comprovar a sua hipótese utilizando métodos moleculares? Análise Molecular do Experimento de Conjugação: Eletroforese em gel de agarose do DNA plasmidial das culturas (1 a 3), juntamente com padrão de peso molecular (1ª. amostra à esquerda). Com base na análise da figura acima e nas informações sobre as culturas em ágar MacConkey, identifique o perfil plasmidial de cada uma das amostras empregadas nessa aula prática. Perfil Plasmidial 1 2 3

13 DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby Material: - s bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos contendo antibióticos distintos, em concentrações definidas - Régua - Tabela de referência Procedimento: 1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento. 2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no quadro abaixo. Droga 1 2 3 4 5 Concentração ( g/ml) Diâmetro do halo de inibição do crescimento * S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário. Interpretação*

14 STAPHYLOCOCCUS 1) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever as características das colônias (cor, brilho, opacidade, tamanho, etc.) e classificar as culturas quanto ao tipo de hemólise ( ou ). Características das Colônias Hemólise A B 2) Observar lâmina com esfregaço da cultura A corada pelo método de Gram. Desenhar. A 3) Prova da Catalase Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle (Streptococcus) algumas gotas de água oxigenada. Observar se há formação de bolhas e anotar abaixo o resultado (positivo ou negativo). A B Streptococcus Catalase

15 4) Prova da Coagulase Princípio: A coagulase é uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sanguíneo, produzindo coágulo. Procedimento: Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho a 1%. Incubar a 37 o C e observar durante 3-4 horas. Fazer o mesmo com a cultura B e anotar os resultados, como positivo ou negativo, segundo houver ou não a formação de coágulo. A B Prova da Coagulase 5) Compilação dos resultados e identificação das culturas Hemólise Catalase coagulase Identificação A B

16 ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DOS GÊNEROS Staphylococcus, Streptococcus e Micrococcus Cocos Gram + isolados ou agrupados Catalase Negativa Positiva Streptococcus Metabolismo Oxidativo e Fermentativo (OF) Oxidativo (O) Staphylococcus Micrococcus Coagulase Positiva Negativa Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis e outros

17 STREPTOCOCCUS EXERCÍCIOS A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E. Verificar o tipo de hemólise. C D E Hemólise B) Observar lâminas das culturas C e E coradas pelo método de Gram. C E C) Prova da catalase. Colocar sobre a cultura C (em caldo) e sobre uma cultura controle positivo algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e anotar o resultado (Positivo = formação de bolhas). C Staphylococcus aureus (controle +) Catalase

18 D) Prova de sensibilidade à bacitracina Princípio: Baseia-se na inibição de crescimento do Streptococcus pyogenes ( -hemolítico, grupo A) frente a uma pequena quantidade de bacitracina. A inibição do crescimento se manifesta através de um halo ao redor do disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura a ser testada, que é previamente espalhada sobre a superfície do ágar sangue. Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento. resistente: ausência de zona de inibição de crescimento. E) Prova de sensibilidade à optoquina. Baseada no mesmo princípio da prova anterior. Coloca-se um disco contendo optoquina sobre uma cultura semeada em ágar sangue e incuba-se por uma noite. No dia seguinte, verifica-se a ocorrência de um halo de inibição de crescimento bacteriano em torno do disco contendo a droga. F) CAMP teste Princípio: A atividade da hemolisina do Staphylococcus aureus é aumentada pela atividade hemolítica do Streptococcus agalactiae ( -hemolítico do grupo B). As bactérias são semeadas perpendicularmente no ágar e incubadas por uma noite a 37ºC. Com o crescimento bacteriano, as hemolisinas de ambas as bactérias difundem-se no ágar, de modo que no ponto onde se misturam forma-se uma zona de hemólise mais clara e que tem o formato de uma ponta de flecha. G) Identificação das culturas C D E Identificação

19 ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO Família: Streptococcaceae Gênero: Streptococcus (Cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia) Catalase negativos Tipo de hemólise Alfa Beta Gama Optoquina Bilesolubilidade Letalidade em camundongos Bacitracina Sensível Resistente Positiva Negativa Positiva Negativa Sensível Resistente Streptococcus pneumoniae Streptococcus -hemolítico Streptococcus pneumoniae Streptococcus -hemolítico Streptococcus pneumoniae Streptococcus -hemolítico Streptococcus pyogenes (gr. A) Streptococcus não do grupo A 19

20 PSEUDOMONAS 1) Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa. Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar, também, a pigmentação verde do crescimento em ágar simples uma característica peculiar da espécie. Característica das colônias P. aeruginosa 2) Observar lâmina com esfregaço da cultura de Pseudomonas aeruginosa corada pelo método de Gram. Observar ao microscópio e desenhar. Pseudomonas aeruginosa 3) Teste de fermentação da glicose Observar uma cultura de Pseudomonas e uma de Escherichia coli em caldo glicosado, contendo vermelho fenol ou indicador de Andrade. Interpretar a diferença de cor das culturas e anotar os resultados na tabela abaixo. Cor do meio Fermentação da glicose P. aeruginosa Escherichia coli

4) Prova da Citocromo C-oxidase Fazer prova da citocromo C-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado (positivo ou negativo). 21 Prova de citocromo C-oxidase P. aeruginosa Escherichia coli

22 ENTEROBACTÉRIAS 1) Observar a coloração das colônias das bactérias A, B, C e D cultivadas em placas de ágar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de fermentação de lactose e de produção de H 2 S. A Coloração da colônia em MacConkey SS Lactose H 2 S B C D 2) Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e citrato de Simmons (conforme orientação nas páginas 24 e 25) Anotar abaixo os resultados (+ ou -) das provas para cada cultura. Prova A B C D Citrato Glicose Gás Urease H 2 S LTD* Motilidade Lisina Indol Lactose** *LTD = L-triptofano desaminase ** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1) Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da página 26, identificar cada uma das culturas. s: A B C D

3) Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação bioquímica. 23 Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas B e C, utilizando os soros anti - S. flexneri e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou negativo). Soro B C Anti - Shigella flexneri Anti Salmonella Leitura das provas bioquímicas nos meios de EPM, MILi e Citrato de Simmons Meio de cultura 1 Cor/Aspecto Resultado Positivo para: Amarelo na base Fermentação de Glicose Verde na superfície 2 Desaminação de triptofano (LTD) EPM Preto na base H 2 S Bolhas de ar Produção de gás de ferm. da glicose Azul na base Urease Roxo Descarboxilação da lisina (LDC) MILi Tubo completamente Movimento turvo Vermelho 3 Produção de indol Citrato de Simmons Azul Aproveitamento de Carbono do citrato de sódio Obs: 1 Cor original dos meios: EPM e Citrato de Simmons = verde; MILi = roxo 2 Resultado positivo difícil de ser identificado; as culturas da aula prática dão resultado negativo nesta prova 3 A prova de indol é feita com a adição do reativo de Kovacs

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26 Perfil bioquímico e motilidade de algumas Enterobactérias Espécie/Gênero Prova Bioquímica Citrato Glicose Gás Urease H 2 S LTD* Movimento Lisina Indol Lactose Escherichia coli - + + ou - - - - + ou - + ou - + + Shigella flexneri - + - - - - - - + ou - - Edwardsiella tarda - + + - + - + + + - Salmonella sp + ou - + + - + - + + - - Citrobacter rodentium + + + + ou - + - + - - + ou - Klebsiella pneumoniae + + + + - - - + - + Enterobacter + + + + ou - - - + - - + ou - Serratia marcescens + + + ou - + ou - - - + + - - Proteus mirabilis + ou - + + + ou - + + + - - - Proteus vulgaris + ou - + + ou - + + + + - + - Morganella morganii - + + ou - + - + + ou - - + - Providencia rettigeri + + + ou - + - + + - + - *LTD = L-triptofano desaminase