Marcadores Genéticos Desenvolvimento e Aplicações
Marcador Característica capaz de detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou organismos
Marcador Genético Toda característica fenotípica ou qualquer segmento de DNA que sejam transmitidos pelos pais para as progênies e que permitam a análise de similaridade e diversidade genética entre indivíduos podem detectar polimorfismo Marcadores Genéticos Morfológicos Bioquímicos Baseados em DNA Marcadores moleculares
Tipos de Marcadores Moleculares Genéticos Marcadores Bioquímicos Isoenzimas formas moleculares múltiplas de uma mesma enzima com a mesma especificidade enzimática resultante de variações alélicas dos genes codificadores Marcadores de DNA Baseados em hibridização RFLP VNTR (Minissatélites) Baseados em PCR Amplificação aleatória (RAPD ou AP-PCR) PCR alelo específico SNP CAPS Microssatélites ISSR SCAR AFLP STS
Marcadores Bioquímicos Isoenzimas Controladas geneticamente por um ou vários genes mesmo loco ou locos diferentes quando controladas por alelos de um único loco aloenzimas Padrão de herança monogênica e codominante http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=protein_kinase_c
Marcadores Bioquímicos Isoenzimas Variações devido a duplicação de genes com mutações subsequentes nos locos alterações secundárias na estrutura de cadeias polipeptídicas Podem ser afetadas qualitativa e quantitativamente por fatores ambientais Técnicas analíticas cromatografia filtração gélica Eletroforese amido (penetrose) SDS-PAGE coloração por métodos histoquímicos Zimograma
Marcadores Bioquímicos Gel de Amido SDS-PAGE http://www.imb-jena.de/~rake/bioinformatics_web/proteins_purification.html Figura adaptada de: http://www.cas.muohio.edu/~wilsonkg/old/gene2005/gene/mendexceptns/mende xcp.htm Aqua-BioSci. Monogr., 1,(2): 1 57, 2008 Pesq. Agropec. Bras., 36(5):771-779, 2001
Marcadores Bioquímicos Interpretação de Zimogramas Um loco gênico 2 alelos: A e B Três genótipos possíveis AA /AB /BB Codificando enzima (1) monomérica (2) dimérica (3) trimérica (4) tetramérica Polipeptídeos Polipeptídeos: a e b intensidade das bandas no gel reflete a concentração proporcional das diferentes isoenzimas na amostra Gametas A B A AA AB B AB BB FERREIRA & GRATAPAGLIA, 1998
Marcadores Bioquímicos Isoenzimas Vantagens Técnica relativamente barata e operacionalmente acessível Vários locos isoenzimáticos podem ser analisados simultaneamente Não são detectados efeitos deletérios, epistáticos ou pleiotrópicos associados aos alelos isoenzimáticos Desvantagens Reduzida cobertura nos genomas investigados pequeno número de locos que podem ser detectados Baixo nível de polimorfismo por loco Influência do ambiente e do estádio de desenvolvimento na expressão de certas enzimas Complexidade de alguns zimogramas interpretação dificultada
Marcadores Bioquímicos Isoenzimas - Aplicações Caracterização da variabilidade genética de populações naturais e de espécies cultivadas Estudos de evolução e dispersão de espécies Análises filogenéticas Melhoramento Identificação de ligação gênica entre marcadores isoenzimáticos e caracteres de herança simples e complexa Identificação de acessos e cultivares Seleção indireta de caracteres de interesse agronômico Aumento na resolução de mapas de ligação
Marcadores de DNA - Início Descoberta das Enzimas de Restrição Linn e Arber/Meselson e Yuan (1968) Sítio de reconhecimento sequência palindrômica BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H 5 G/GATCC 3 EcoRI - Escherichia coli R 5 G/AATTC 3 HaeIII - Haemophilus aegyptius 5 GG/CC 3 PstI - Providencia stuartii 5 CTGCA/G 3
Marcadores de DNA Aplicações Estudos de diversidade genética Estudos evolutivos e de genética de populações fluxo gênico filogenia filogeografia determinação de taxas de discriminação Caracterização da relação genética entre populações mapeamento e análises de similaridade e distância genética Avaliação de hibridização Caracterização e conservação de recursos genéticos Ex.: em bancos de germoplasma Impressão digital genética identificação de acessos de plantas, isolados de um microrganismo etc diagnóstico molecular detecção de variação clonal e transgênicos análises forense e civil Melhoramento (SAM) construção de mapas de ligação e mapeamento de QTLs controle de introgressão de genes em programas de melhoramento resistência a doenças Marcação de gene Detecção de instabilidade genômica
Marcadores de DNA Baseados em Hibridização RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Botstein et al. (1980) We describe a new basis for the construction of a genetic linkage map of the human genome.
Marcadores de DNA Baseados em Hibridização RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Polimorfismos decorrem da criação ou eliminação de sítios de restrição devido a mutações gênicas (substituição de bases, inserções/deleções) rearranjos de segmentos cromossômicos Alteram a distância entre dois sítios de restrição adjacentes Deleções Duplicações Inversões Translocações
Marcadores de DNA Baseados em Hibridização RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Figura traduzida de: http://dean.pku.edu.cn/jiaoxue/zhubmb/chapter9/p2.htm
Marcadores de DNA Baseados em Hibridização RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Botstein et al. (1980)
Marcadores de DNA Baseados em Hibridização RFLP x VNTR Diferenças RFLP Utilização de sondas homólogas a sequências únicas no genoma detecta um ou poucos locos de cada vez padrão simples de bandas VNTR Utilização de sondas homólogas às sequências repetitivas de minissatélites detecta todos os locos hipervariáveis simultaneamente padrão complexo com múltiplas bandas
Marcadores de DNA RFLPs Vantagens Expressão codominante Não são afetados por pleiotropia, epistasia ou variações ambientais O DNA a ser analisado pode ser extraído de qualquer parte do organismo Resultados altamente estáveis e reproduzíveis Cobrem amplamente o genoma sondas podem ser obtidas de cdna (cópia única) ou de DNA genômico clonado ao acaso Disponibilidade no mercado de vários tipos de enzimas de restrição utilização em combinação com diversos tipos de sondas Possibilidade de utilização de sondas heterólogas mapeamento comparativo entre espécies Membranas de hibridização podem ser conservadas e reutilizadas
Marcadores de DNA RFLPs Limitações Processo caro e muito trabalhoso Requer uma quantidade elevada de DNA (10 g para eucariotos)
Marcadores de DNA Baseados em PCR - Início Mullis et al. (1986): publicação da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) possibilitou gerar grandes quantidades de DNA de segmentos específicos do genoma uso de DNA polimerase de E.coli polimerização a 37 C termolábil destruída em cada ciclo de desnaturação do DNA adicionada manualmente a cada ciclo Prêmio Nobel de Química de 1993
Marcadores de DNA Baseados em PCR - Início Saiki et al. (1988): isolamento de DNA polimerase de Thermus aquaticus polimerização a 72 C mantém atividade durante algumas horas a 95 C Automação completa do processo Thermus aquaticus Vive em fontes termais, como esta do Yellowstone National Park http://www.musee-afrappier.qc.ca/en/index.php?pageid=3412- html&image=3412_pcr1 http://publications.nigms.nih.gov/thenewgenetics/chapter3.ht ml
Marcadores de DNA Baseados em PCR PCR alelo específico Uso de primers ou iniciadores específicos para iniciar a síntese de um segmento de DNA alvo ARMS (Amplification Refractory Mutation System) AS-PCR (Allele Specific PCR) PASA (PCR Amplification of Specific Alleles) PCR alelo específico da cadeia da haptoglobina humana (Hp)
Marcadores de DNA Baseados em PCR PCR alelo específico OU Definição das sequências busca nos bancos de dados garantir que a sequência alvo ocorre apenas no gene ou fragmento desejado sequenciamento desenho e validação dos primers necessidade de conhecimento prévio da sequência de DNAalvo onde se deseja que os primers sejam ligados uso de programas computacionais http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1.html
Cuidados ao desenhar os primers Tamanho de 18-25 nucleotídeos comprimento não deve diferir além de 3 pb Não devem conter sequências repetidas invertidas ou autocomplementares >3 pb evita formar estruturas secundárias estáveis que impedem o anelamento ao DNA-alvo Sequência terminal 3 de um primer não deve ser capaz de se ligar a qualquer sítio do outro primer evita a formação de dímeros de primers Estrutura em grampo de cabelo http://www.uq.edu.au/vdu/pdu_pcrprimers.htm http://www.nfstc.org/pdi/subject04/pdi_s0 4_m01_02_h.htm
Cuidados ao desenhar os primers Base terminal 3 G ou C Exceto NNCG ou NNGC formação de estruturas secundárias e dímeros de primers Tm (melting temperature): 52-65 ºC depende do conteúdo GC Tm de cada par de primers não deve diferir em mais de 5 C Tm do produto a ser amplificado não deve diferir da Tm dos primers em mais de 10 C várias expressões matemáticas e programas de computador para calcular
Cuidados ao desenhar os primers Ta (annealing temperature) dos primers 3-5 C mais baixas que a Tm calculada se muito alta anelamento deficiente baixa produção de DNA amplificado se muito baixa anelamento não-específico amplificação de segmentos de DNA indesejáveis otimização várias PCRs variando de 2-10 C abaixo da Tm calculada para os primers Proporção G+C entre 40-60% Distribuição balanceada das 4 bases ao longo do comprimento do primer
Marcadores de DNA Baseados em PCR Amplificação aleatória (RAPD ou AP-PCR) Desenvolvido por dois grupos independentes de pesquisadores RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (Williams et al., 1990 ) AP-PCR: Arbitrary Primed-Polymerase Chain Reaction (Welsh & McClelland, 1990) Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo genoma
Marcadores de DNA Baseados em PCR Amplificação aleatória (RAPD ou AP-PCR) Utiliza um primer único primers curtos (10 bases) e de sequências arbitrárias sequências alvo desconhecida elimina a necessidade de conhecimento prévio dos fragmentos a serem amplificados Sítios de anelamento próximos e em orientações opostas dentro da distância percorrida pela polimerase amplificação Altas concentrações de MgCl 2 no tampão diminui a estringência do anelamento Temperaturas de anelamento baixas (~36 C) permitem o anelamento dos primers curtos Maior número de ciclos térmicos ~45 compensar primers curtos http://www.fao.org/docrep/008/y5970e/y5970e06.htm
Marcadores de DNA Baseados em PCR Amplificação aleatória (RAPD ou AP-PCR) Marcador dominante não permite distinguir heterozigotos Figure 1. RAPD products from four G. barbadense cultivars generated by random primer A9B7. Sequenced fragments are marked by arrows. Sequências dos fragmentos amplificados incluem DNA de cópia única DNA repetitivo Bases moleculares mutações de ponto no sítio de pareamento do primer deleções ou inserções entre dois sítios de pareamento do primer Afr. J. Biotechnol..2 (5): 129-132, 2003
Marcadores de DNA Baseados em PCR RAPD Vantagens e Limitações Vantagens Simplicidade, rapidez e baixo custo Não requer biblioteca de sondas Limitações Expressão dominante Baixo conteúdo de informação por loco Padronização de condições de amplificação Competição entre sítios de amplificação
Marcadores de DNA Baseados em PCR SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Polimorfismos resultantes da alteração de uma única base no genoma Substituições Transição purina purina A G pirimidina pirimidina Inserções/deleções (Indel) DIPs deletion/insertion polymorphisms T C Transversão purina pirimidina pirimidina purina A ou G T ou C
Marcadores de DNA Baseados em PCR SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Ampla distribuição no genoma forma de variação mais frequente nos genomas
Marcadores de DNA Baseados em PCR SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Em geral, natureza bi-alélica http://www.siriusgenomics.com/technology/ Para que uma variação seja considerada SNP deve ocorrer em pelo menos 1% da população
Marcadores de DNA Baseados em PCR SNPs Identificação Sequenciamento direto amplificação por PCR e sequenciamento de fragmentos genômicos e de regiões gênicas equivalentes de vários indivíduos Análise eletrônica da variação de ponto banco de dados sequências de projetos genomas bibliotecas de cdna de diferentes indivíduos (EST s) Diferentes estratégias para comparar regiões específicas do DNA de diferentes indivíduos
Marcadores de DNA Baseados em PCR SNPs Sequenciamento direto Necessidade de desenho de primers para amplificar segmentos de DNA de 400-700 pb Adiciona-se à extremidade 5 extensões que irão facilitar o anelamento dos primers posteriormente usados para o sequenciamento do fragmento amplificado R. Bras. Zootec., 8: 64-71, 2009
Marcadores de DNA Baseados em PCR SNPs Bancos de Dados Sequências de projetos genomas Bibliotecas de cdna de diferentes indivíduos (EST s)
Marcadores de DNA Baseados em PCR SNPs Análise Eletrônica Bancos de dados procura de SNPs por cromossomos procura de SNPs por região cromossômica procura de SNPs por gene
Marcadores de DNA Baseados em PCR STS (Sequence Tagged Sites) Detectam variação alélica no DNA codominantes podem distinguir homozigotos e heterozigotos São mais reproduzíveis que RAPD utilizam primers de sequências mais longas Requerem algum conhecimento prévio da sequência do DNA alvo Geram dados rapidamente e requerem quantidade mínima de DNA Incluem CAPs, microssatélites, ISSRs e SCARs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/techsts.shtml
Marcadores STS CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences ) PCR seguida de fragmentação fragmentos-alvos amplificados previamente por RAPD ou outros PCR fragmentos de DNA citoplasmático amplificados por primers universais uso de enzimas de restrição com cortes frequentes Ex.: MseI, TaqI, HinfI, PstI Polimorfismos são diferenças em comprimentos de fragmentos de restrição causada por SNPs ou Indels criam ou abolem sítios de restrição em amplicons produzidos por PCR primers específicos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/ doc/techcaps.shtml
Marcadores STS Microssatélites Sequências hipervariáveis de 1 a 6 pb repetidas em tandem, com distribuição ampla ao longo do genoma mais comuns 2-3 pb Polimorfismo resultante de diferentes rearranjos envolvendo segmentos de DNA de tamanhos diferentes
Surgimento de novos alelos Marcadores STS Microssatélites erros da DNA polimerase durante a replicação (slippage ou derrapagem) InDel crossing-over desigual http://virtuallaboratory.colorado.edu/biofunda mentals/lecturenotes/topic3-4_mutation.htm
Marcadores codominantes Multi-alélicos Marcadores STS Microssatélites Regiões flanqueadoras conservadas entre indivíduos da mesma espécie permite desenho de primers específicos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/techsts.shtml
Outros nomes Marcadores STS Microssatélites SSR: Simple Sequence Repeats STR: Short Tandem Repeats SSLP: Simple Sequence Lenght Polymorphisms STMS: Sequence Tagged Microsatellite Sites Frequência genômica varia entre espécies número de locos e tipos de repetições mamíferos mais comum AG plantas mais comuns AT e AC
Marcadores STS Desenvolvimento de marcadores microssatélites Método tradicional Outras estratégias Busca em banco de genes Utilização de sequências ESTs Utilização de BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) http://www.fbr.org/swksweb/bi_intro.html
Marcadores STS ISSR (Inter-simple Sequence Repeats ) Polimorfismos STS encontrados entre as repetições de microssatélites Primers podem ser concebidos com base em repetições microssatélites terá como alvo os múltiplos locos Primers podem ser estendidos para fora ou dentro do ISSR (alternativo) amplificação mais provável de uma região única Marcador dominante ISSR usando primer 880 para verificar variação intrapopulacional de café http://www.ccmb.res.in/coffeegermplasm/fp_db_pop_issr.htm
Marcadores STS ISSR (Inter-simple Sequence Repeats ) Repetições de di ou tri nucleotídeos marcadas com radioatividade e ancoradas com 2 a 4 nucleotídeos em uma das extremidades são usadas como primers para PCR http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/ doc/techsts.shtml
Marcadores STS SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) É a conversão de marcadores RAPD para marcadores de sequência específica (Paran & Michelmore 1993)
Marcadores STS SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/techsts.shtml Eletroforese em gel de agarose de marcadores SCAR validados para soja. A) SCAR44, B) SCAR56, C) SCAR195 Theor. Appl. Genet., 121: 1-8,2010
Marcadores de DNA Baseados em PCR AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ) Patente Zabeau and Vos (1993) European Patent Application, publication n : EP 0534858 Publicação Vos et al. (1995) Combina robustez de RFLP e praticidade da PCR com primers arbitrários em alta estringência
Marcadores de DNA Baseados em PCR AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ) Marcador dominante Combinação de primers seletivos permitem obter grande número de marcadores genéticos Nucleic Acids Res., 23(21): 4407-4414, 1995 Rev. Bras. Frutic., 27(3): 454-457, 2005
Marcadores de DNA Baseados em PCR AFLP - Técnica Adaptada de Biotecnol. Ciên. Desenvolv., 29: 56-60, 2002 Biotecnol. Ciên. Desenvolv., 29: 56-60, 2002 Nucleic Acids Res., 23(21): 4407-4414, 1995
Marcadores de DNA Baseados em PCR AFLP - Técnica Marcação ( 33 P ou fluorocromo) Biotecnol. Ciên. Desenvolv., 29: 56-60, 2002 Análise no gel Separação em gel de poliacrilamida desnaturante Coloração por nitrato de prata pega-se a sequência rarofrequente joga-se fora as bandas grandes fragmentos pequenos (frequentefrequente) não são marcados e vão embora na eletroforese Marcação de primers e visualização por autoradiografia ( 32 P ou 33 P) ou sequenciador automático (fluorocromos)
Marcadores de DNA Baseados em PCR AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ) Vantagens Obtenção de resultados em grande quantidade e em curto prazo saturação de regiões genômicas e alto desempenho na geração de dados Avanço significativo para espécies de baixo polimorfismo Desvantagens Quantidade de DNA necessária (300 ng) DNA tem que ser de alta qualidade (alto grau de pureza)
Bibliografia SHIBATA, M.; COELHO, C.M.M.; OLIVEIRA, L.M.; GUIDOLIN, A.F. Padronização metodológica para determinação de proteínas de reserva de sementes de Handroanthus albus (Chamiso). Rev. Ciên. Agrovet., 10(2): 151-157, 2011. CARPENTIERI-PÍPOLO, V.; GALLO-MEAGHER, M.; DICKSON, D.V.; GORBET, D.W.; MENDES, M.L.; SOUZA, S.G.H. Comparação entre métodos de marcação da sonda de RFLP R2430E utilizada na seleção de cultivares de amendoim resistente à Meloidogyne arenaria. Semina: Ciên. Agrár., 29(4): 783-788, 2008. AMAR, A.M.; AMAR, M.J.A. Investigação de Paternidade e Maternidade: Aplicações Médico-Legais. 2ª ed.,são Paulo, Editora Ícone, 1993. 80 p. ZIMMER, P.D.; OLIVEIRA, A.C.; MALONE, G. (Org.). Ferramentas da biotecnologia no melhoramento genético vegetal. Pelotas, UFPEL, 2005. 158 p. FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introduccion al uso de marcadores moleculares em el analisis genetico. Brasília, Embrapa/Cenargen, 1998. 220 p.
Bibliografia BORÉM, A.; CAIXETA, E.T. (Ed.). Marcadores Moleculares. Viçosa, UFV, 2006. 374 p. OLSON, M.; HOOD, L.; CANTOR, C.; BOTSTEIN, D. A common language for physical mapping of the human genome. Science 245: 1434-5, 1989. MULLIS K, FALOONA F, SCHARF S, SAIKI R, HORN G, ERLICH H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp.Quant.Biol., 51: 263-273, 1986. LOPES, R.; LOPES, M.T.G.; FIGUEIRA, A.V.O.; CAMARGO, L.E.A.; FUNGARO, M.H.P.; CARNEIRO, M.S.; VIEIRA, M.L.C. Marcadores Moleculares Dominantes - Aspectos técnicos e interpretação genética. Biotecnol. Ciên. Desenvolv., 29: 56-60, 2002. HOSHINO, A.A.; PALMIERI, D.A.; BRAVO, J.P.; PEREIRA, T.E.B.; LOPES, C.R.; GIMENES, M.A. Marcador microssatélite na conservação de germoplasma vegetal - Aplicação de marcadores moleculares do tipo microssatélite na caracterização e conservação de recursos genéticos vegetais mantidos em bancos de germplasma. Biotecnol. Ciên. Desenvolv., 29: 146-150, 2002. Bioloja.com