USO DE TECNOLOGIAS MOLECULARES

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1 USO DE TECNOLOGIAS MOLECULARES

2 P= G+A

3 VP = VG + VA

4 Uso de marcadores no estudo de características quantitativas Características quantitativas Controladas por vários genes de pequeno efeito Sofrem maior influencia ambiental Não se sabe quanto ele contribui para o fenótipo QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caráter quantitativo identificado por marcadores moleculares. Finalidade: determinar quanto de uma característica quantitativa é explicada por um ou mais marcadores

5 QTL São regiões cromossômicas relacionadas com variação fenotípicas das características quantitativas Limitações: Dificuldade de avaliação dos caracteres quantitativos aliados a necessidade de ligação dos marcadores com os QTL Dificuldade de obtenção dos próprios marcadores Estudo difícil e trabalhoso Obs: Há necessidade de mais pesquisas para tornar mais eficientes o emprego dos marcadores moleculares no estudo das características quantitativas

6 MARCADORES GENÉTICOS Identificar ou etiquetar alguma coisa 1923: feijão com ausência de cor escura no tegumento x tamanho do semente : seleção de forma indireta (tegumento claro = marcador Qualidade de um bom marcador» Herdável» Fácil observação» Herdabilidade alta» Intimamente relacionado ao alelo que desejamos selecionar OBS: Essas qualidades tornam mas eficientes a seleção indireta Os marcadores genéticos podem ser morfológicos e moleculares.

7 MARCADORES MORFOLOGICOS Fenótipo de fácil identificação Normalmente determinada por único alelo. Exemplo 1: planta de milho jovem verde clara x esterilidade masculina ( fenótipo importante na produção de híbrido mas de difícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem alta probabilidade de serem herdados juntos) Exemplo 2: cor amarela do milho x teor de vitamina (o mesmo alelo para ambas características: mais fácil selecionar pela cor) Limitação dos marcadores morfológicos: Ocorrência em número reduzido Muitas características de interesse econômico não tem marcador morfológico Muitos marcadores que apresentam baixa herdabilidade

8 Marcadores moleculares O que seriam marcadores moleculares? São alterações encontradas na sequência de aminoácidos de uma proteína ou do próprio DNA, que podem alterar uma determinada característica em alguns indivíduos de uma população

9 Marcadores moleculares Características de DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdadas geneticamente. Os tipos de marcadores diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade do DNA.

10 Marcadores moleculares Marcadores de proteínas ( Produtos direto dos alelos); Marcadores que utilizam o próprio DNA (são os próprios genes ou seqüências de DNA situadas próxima ao gene de interesse):» RFLP» PCR» AFLP» Microssatélites

11 Marcadores de proteínas -bioquímicos Mais comuns: isoenzimas ( esterases, fosfatases, peroxidases...) Procedimento consiste na extração e identificação da proteína. Exemplo: Cevada izoenzima esterase x resistência um virus ( seleção indireta) Vantagem: menor custo Codominância: identifica homozigotos e heterozigotos Limitações: Reduzida variabilidade Marcadores em número reduzido

12 Marcadores que utilizam o próprio DNA São os próprios genes ou seus vizinhos, isto é seqüências de DNA situadas próxima ao gene que se deseja marcar Vantagens; Grande variabilidade entre indivíduos Numero de marcadores suficientes para marcar todos os alelos de todos os genes que se deseja marcar. Desvantagens: Técnicas laboratoriais mais caras, que os bioquimicos e os morfológicos

13 Marcadores moleculares princípio de funcionamento O princípio básico envolvido na obtenção e detecção dos marcadores bioquímico e molecular reside na utilização da ELETROFORESE Seu princípio é simples: moléculas de carga negativa migram para o pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo A técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia de Polimerase), a qual muito marcadores moleculares são derivados e consiste na amplificação enzimática direcionada por primers (iniciadores) de um DNA (PCR), é um método in vitro que sintetiza milhões de cópias de uma seqüência nucleotídica em poucas horas

14 Técnica de PCR Reação em Cadeia de Polimerase Técnica que replica milhões de vezes um fragmento de DNA, possibilitando a sua detecção e análise. Extração do DNA Vários protocolos Kits prontos

15 Exemplos de enzimas de restrição produzidas in vitro e comercializadas em laboratórios Enzima de restrição Origem Seq. de reconheciemnto BamH I Bacillus amyloliquefaciens H G*GATC*C G*CTAG*G EcoR I Escherichia coli RY 13 G*AATT*C C*TTAA*G Hae III Haemophilus aegyptus GG*CC CC*GG Hind III Haemophilus influenzae R4 A*AGCT*T T*TCGA*A

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19 Algumas classes de marcadores moleculares RFLP (Restriction Fragmenth Lenght Polymorphism) RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) Microssatélites ou SSR (Sequence Simple Repeats) AFLP (Amplified Frangment Lenght Polymorphism) SNP (Single-nucleotide polymorphism)

20 Os principais tipos de marcadores utilizados atualmente em pecuária são: 1)Análise das variações no comprimento de regiões de DNA tipo Microssatélite (testes de paternidade e registro) 2)Painéis contendo diversos polimorfismos de sítio único (SNP) (seleção e melhoramento)

21 RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) Significa polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (obtidos por corte de fita dupla de DNA). Tome-se dois indivíduos distintos que têm o DNA extraído e submetido a clivagem por enzima de restrição. O uso da técnica de RFLP visa detectar diferenças na seqüência de DNA dos dois indivíduos. Uma maneira de se fazer isto é sequenciar o DNA dos dois indivíduos e comparar as seqüências obtidas.

22 RFLP (Botstein et al., 1980) (Identificação por hibridização do DNA) 1- Extração do DNA 2- Digestão por enzimas de restrição que geram milhares de fragmentos 3- Separação dos fragmentos (eletroforese) 4- Transferência do DNA para membrana de nylon 5- Hibridação (fragmentos x sondas marcadas) 6- Autorradiografia(exposição da memb. a filme de raio X ou compostos luminescentes 7- Análise da segregação

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26 Admitindo-se que o fragmento de DNA identificado pela sonda esteja intimamante ligado a um alelo de interesse, pode-se selecionar esse alelo por meio desse fragmento. Assim o fragmento RFLP funciona como um marcador ou etiqueta do alelo de interesse.

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28 Usos marcadores RFLP Diversidade genética e identificação de paternidade Construção de mapas de ligação e mapeamento de QTLs Seleção assistida por marcadores (SAM)

29 RAPD- Fragmentos de DNA amplificados ao acaso ( Williams et al, 1990) Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo genoma; Utiliza primers curtos e de seqüências arbitrárias, com seqüências alvo desconhecida; Utiliza um primer único; Detecta polimorfismo em apenas um par de bases; Baseia-se na amplificação de DNA; Não Permite distinguir heterozigotos.

30 Baseado na observação de que um simples e pequeno oligonucleotídeo, casualmente escolhido de uma seqüência de DNA, quando misturado com DNA genômico e a termoestável polimerase, e sujeitos a ciclos de temperatura sob condições que lembram aquelas da PCR, irá servir de primer para a amplificação de diversos fragmentos de DNA Os produtos da reação são separados em gel de agarose e corados com brometo de etídeo

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33 Microssatélites ou SSR Comportamento Mendeliano e consistem de trechos de DNA de unidades mono-, di-, tri-, tetra- ou pentanucleotídica repetidas ao acaso, dispersas por todo o genoma eucarioto Os produtos da reação são separados em gel de poliacrilamida Vantagens (natureza multialélica, herança codominante; fácil detecção por PCR; quantidades mínimas de DNA) Desvantagens (custo final primers informativos )

34 Microssatélites Seqüências curtas (300 pb) Repetições em tandem (6 a 8 nucleotídeos = mais comuns TG/AC) Mais utilizada em mapeamento genético, devido a sua grande varredura no genoma.

35 MÉTODO as sequencias que flanqueiam Regiões repetidas são amplificadas por um par de primers específicos (20 a 30 bases) - complementares as seqüências microssatélites. Cada microssatélite é um loco genético altamente variável, multialélico. Separação por eletroforese (cada banda representa um alelo diferente do mesmo loco)

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40 Vantagens Herança codominante; alta abundância nos genomas eucariotos; multi-alelismo; baixo custo e potencial para amplificação de sistemas multiplex; Fácil execução ; automatizável Transferibilidade

41 DESVANTAGENS Desenvolvimento dos pares de primers específicosconstrução de bibliotecas genômicas enriquecidas com os microssatélites clonagem e seqüenciamento desses e o desenho dos primers complementares às regiões conservadas que flanqueiam os microssatélites

42 AFLP- Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (Vos et al., 1995). Técnica: Clivagem do DNA genômico com duas enzimas de restrição Ligação de adaptadores específicos aos terminais dos fragmentos clivados Pré-amplificação dos fragmentos,utiliza primers especificos para cada adaptador mais uma base seletiva (Eco + A, M+C) Amplificação seletiva utiliza primers específicos para o adaptador, sitio de restrição mais três bases seletivas Eletroforese em gel de alta resolução

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44 Vantagens dos marcadores AFLP: A grande quantidade de fragmentos que são gerados e resolvidos em um único gel, é o mais alto entre todas as tecnologias de marcadores. Grande poder de detecção de variabilidade genética. Da mesma forma que o ensaio de RAPD, o ensaio AFLP não requer conhecimento prévio de seqüência de DNA. Depois de preparados os fragmentos amplificáveis, um grande número de bandas polimórficas pode ser rapidamente obtido simplesmente com a variação das bases arbitrárias dos primers. O ensaio de AFLP é bem mais eficaz quando comparado ao ensaio de RAPD, pois na etapa de PCR, são utilizados primers bem mais longos, o que aumenta a especificidade da amplificação, evitando com isso a competição que ocorre durante a PCR no ensaio de RAPD.

45 Desvantagens dos marcadores AFLP: Baixo conteúdo de informação genética por loco. Marcadores AFLP são dominantes, genótipos heterozigotos não podem ser diretamente discriminados dos homozigotos. A análise de marcadores AFLP envolve um número maior de passos do que a análise de RAPD, uma maior quantidade de reagentes (enzimas de restrição, adaptadores e primers específicos ). Um DNA de alto nível de pureza é necessário para garantir a digestão completa pelas enzimas de restrição em todas as amostras, a digestão parcial ou a má qualidade do DNA pode facilmente levar a interpretações errôneas do polimorfismo.

46 MARCADORES DERIVADOS DE SEQÜENCIAS EXPRESSAS

47 Marcador molecular SNP Polimorfismos de base única Correspondem a posições onde existe uma alternância dos nucleotídeos A, C, G e T, em uma freqüência alélica mínima de 1% em uma dada população São polimorfismos estáveis A grande maioria é neutra Duas pessoas não relacionadas diferem em aproximadamente 1 base a cada Do total de 3 bilhões de bases em seu genoma um indivíduo carregaria 3 milhões de SNPs.

48 SNP- Polimorfismo de um nucleotídeo Single Nucleotide Polymorphism ou Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos Polimorfismo baseados na alteração de uma única base no genoma Exemplo: AAGGTTA muda para ATGGTTA

49 Tipos mais comuns de SNPs: Transição: base púrica é substituída por outra púrica A G T C Transversão: púrica substituída por pirimídica ou vice-versa : A C A T G C G T

50 Podem ocorrer em regiões expressas e não expressas São estáveis do ponto de vista evolutivo SNP se ocorrer em pelo menos 1% da população Alta freqüência e distribuição no genoma: Genoma humano: 90% polimorfismo SNPs 1,42 milhão Milho: 1SNP 48pb (Regiões não-codificadoras) Total SNPs São encontrados no genoma em : Haplogrupos: mutações que ocorrem próximas e são herdadas juntas Indivíduo Seqüência encontrada Haplogrupo 1 GATATTCGTACGGATGTATC AG 2 GATGTTCGTACTGATGTATC GT Individuais:

51 Métodos para detectar SNPs SNPs não necessitam da separação de fragmentos de DNA por tamanho Sequenciamento de segmentos amplificados via PCR de indivíduos diferentes Descoberta de SNPs em bibliotecas genômicas (SNP Finder) Descoberta de esnp em bibliotecas de EST São encontrados em: 1. Em regiões codificadoras: podem gerar alelos 2. Em regiões não codificadoras: servem como marcadores moleculares.

52 VANTAGENS Abundância no genoma Elevado grau de polimorfismo Detecção de diferentes alelos para genes de interesse DESVANTAGEM Sequenciamento de DNA em grande escala

53 Marcadores moleculares - aplicabilidade Caracterização de diversidade genética em populações naturais e genótipos cultivados Sistemática e evolução (taxonomia molecular) Identificação de genes de interesse zootécnico Confecção de mapas genéticos Clonagem de genes e mapeamento Seleção assistida em melhoramento Diversidade genética e seleção de genitores Fingerprinting e proteção de cultivos Análise de pureza genética Mapeamento comparativo

54 Produção animal Animais geneticamente modificados: O estudo da regulação e expressão gênica; A utilização de animais transgênicos como biorreatores; A geração de modelos animais para estudos biomédicos e para xenotransplante; Introdução de novas características genéticas importantes economicamente.

55 O estudo da regulação e expressão gênica Animais transgênicos têm sido amplamente utilizados para a elucidação dos mecanismos moleculares que controlam a expressão e a regulação de diversos genes durante o desenvolvimento fetal e em tecidos adultos. Tem sido possível estudar e construir mapas detalhados de genes envolvidos no desenvolvimento embrionário de uma variedade de espécies.

56 A utilização de animais transgênicos como biorreatores O fato de animais trangênicos expressarem proteínas em determinados órgãos, utilizando-se promotores tecido-específicos, torna-os viáveis como biorreatores de proteínas de importância biomédica. Animais domésticos podem servir de biofábricas na produção em larga escala de proteínas expressas no sangue ou no leite. O isolamento dessas proteínas tem vantagens sobre os tecidos pois esses fluidos são constantemente produzidos.

57 A geração de modelos animais para estudos biomédicos e para xenotransplante Animais transgênicos também podem ser utilizados para estudar o mecanismo molecular que contribui para a patologia de doenças humanas, assim como para testar agentes terapeuticos que evitem o início da doença, diminuam o seu progresso ou reduzam os seus sintomas. Camundongos tem sido mais frequentemente utilizados como modelo animal para um grande número de doenças como: fibrose cística, arteriosclerose, osteogênese imperfeita, B- talassemia, obesidade, AIDS, câncer, entre outras. Também têm sido utilizados como doadores de órgãos, que expressem fatores de inibição à rejeição. Ex: suínos transgênicos estão sendo testados como doadores de órgãos para humanos (xenotransplante).

58 Introdução de novas características genéticas importantes economicamente. O objetivo nessa área é a produção de animais transgênicos que apresentem características de importância comercial, tais como maior eficiência na conversão alimentar, maior quantidade de proteína na carne, maior taxa de crescimento corporal, maior produção de carcaça, resistência a doenças, alteração na composição do leite (aumentando a quantidade de proteínas), modificação nas estruturas de fibras têxteis como lã e cashmere

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62 Conclusão As aplicações da biotecnologia na área animal são múltiplas e estão em diferentes etapas de desenvolvimento, algumas com problemas técnicos a serem solucionados e outras que já geraram produtos que podem entrar no mercado ou que já estão sendo comercializados. O ambiente é efervecente e fascinante e, certamente, contribuirá para a melhor qualidade de vida do homem.

63 Obrigado pela a atenção de vocês!!!

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