Levedura - Lise Medida de atividade total e específica (antes) Cromatografia de troca-iônica Medida de atividade total e específica (após) Diálise Eletroforese (SDS-PAGE) Sequenciamento e Identificação de proteínas Sayuri Miyamoto 2017
Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas Determinação da massa molecular Sequenciamento da proteína
Determinação de Massa Molecular da Proteína SDS-PAGE Cromatografia de exclusão Espectrometriade massas
Comparativo entre métodos que permitem determinação de massa SDS-PAGE Migração relativa Mr D d Precisão ± 10 % Rm =d/d Mr = massa molecular (ou peso molecular) Cromatografia de Exclusão Eluição relativa Precisão ± 1 % Espectrometria de Massas Método bastante sensível Valores de massa/carga bastante precisos Precisão ± 0.01 %
Como funciona a técnica? Espectrometriade Massas Espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry) é uma técnica analítica extremamente sensível que permite determinar a massa molecular. Ela também fornece informações acerca da estrutura da molécula. O equipamento que faz a medida da massa é o Espectrômetro de Massas. MALDI-TOF Q-TOF
Espectrômetrode Massas Características básicas de um espectrômetro de massas ALTO VÁCUO ÍONS EM FASE GASOSA SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE DADOS AMOSTRA Sample (ex. proteínas) Inlet + _ Fonte de Ionização Analisador de Massas Detector ESPETRO DE MASSAS (m/z)
Espectrode Massas O resultado obtido na análise por espectrometria de massas é um espectro de massas. O espectro de massa é um gráfico que mostra a abundância (intensidade) relativa de cada íon com massa/carga (m/z) definidos. Importante: o equipamento faz uma medida da razão (m/z) entre a massa do íon (m) sobre a carga do íon (z) e não da massa em si. A molécula pode ser ionizada: -pela adição de um ou mais prótons ( [M+nH + ] n+ ): modo de ionização positiva -pela perda de um ou mais prótons ( [M-nH + ] n- ): modo de ionização negativa Proteínas e peptídeos normalmente sofrem protonação e são analisados como íons carregados positivamente
Ionização IONIZAÇÃO (formação de íons com carga positiva ou negativa) é o primeiro passo fundamental para que a molécula possa ser introduzida no analisador de massas Duas principais técnicas de ionização BRANDAS (Soft) empregadas para análise de biomoléculas: ELECTROSPRAY e o MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization). Nobel Prize in Chemistry, 2002 John B. Fenn is the chemist who invented the ELECTROSPRAY method (1988). Professor of Chemistry at Yale University, USA, and at Virginia Commonwealth University, USA Koichi Tanaka research engineer who developed the MALDI technique (1987). Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.
Ionização por Electrospray (ESI) Voet Biochemistry 3e 2004 John Wiley & Sons, Inc. Massa =(m/z x z) z Massa =(1027.6) x (100) (100) Massa= 102760-100 Massa = 102660
Ionização por MALDI Massa =(m/z x z) z Massa =(29281 x 1) 1 Massa= 29280
Espectros de Massa de Proteína Intacta ESI MALDI
Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas Determinação da massa molecular Sequenciamento da proteína 1-análise da composição de aa 2-análise da seq. de aa Sayuri Miyamoto 2014
1- Análise da composição total de aminoácidos Hidrólise de todas as ligações peptídicas em meio fortemente ácido ou básico ( 2-4 M de NaOH ou 6 M HCl) ou por enzimas (mistura de proteases) Aminoácidos sãoseparados por técnicas cromatográficas (exemplo HPLC) Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp-Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr Asp Tyr Arg His Ala Ser Thr Cys Gly Glu Asn HCl 6 M, 100C, 24h Lys Arg Ile Lys Trp Leu Derivatização pré-coluna (o-ftalaldeído, fenilisotiocianto, etc.) Asp 1 Glu 1 Asn 1 Ser 1 Gln 0 His 1 Gly 0 Thr 0 Arg 2 Ala 1 Tyr 1 Met 0 Val 0 Phe 0 Ile 1 Leu 1 Lys 1
2-Sequenciamento de Proteínas I. Redução de pontes de disulfeto usando agentes redutores como o 2-mercaptoetanol. É importante alquilar as cisteínas para evitar que as pontes de disulfetos se formem novamente. II. Clivagem da cadeia polipeptídica usando métodos de clivagem específicos. (ex. Proteases como a Tripsina). + H 3 N- -COO - Tripsina (Cliva após resíduos básicos Lys e Arg) Fragmentos Peptídicos * O uso combinado de mais de um método de clivagem ajuda no ordenamento das sequência de peptídeos, principalmente no método de Sanger
2-Sequenciamento de Proteínas III. Sequenciamento dos fragmentos peptídicos Degradação de Edman (Sequenciamento a partir do N-terminal) Limitado a oligopeptídeos de até 50 aa Sequenciamento através de análise por MS e/ou MS/MS MALDI-TOF Q-TOF
2-Sequenciamento de Proteínas Degradação de Edman (1950) Edman desenvolveu um método que permite remover aminoácidos sequencialmente a partir do N-terminal.
Tripsina (Cliva após resíduos básicos Lys e Arg) Como ordenar a sequência de peptídeos?? Usar mais de um método de clivagem da cadeia polippetídica... Exemplo: Quimotripsina (Cliva após resíduos aromáticos) Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr
INSULINA Foi sequenciada por Frederik Sanger Prêmio Nobel em 1958 http://www.whatisbiotechnology.org/exhibitions/sanger/insulin
Degradação de Edman Sequenciadores Automáticos Limitações: Tempo de análise longo! Grande quantidade de amostra! Muito lento para os padrões de hoje!!! Hoje em dia o sequenciamento é feito por espectrometria de massas. (+rápido, requer pouquíssima amostra)
Espectrometria de Massas Análise de massa de Proteínas Intactas (MS) Análise de massa de Peptídeos (MS) Sequenciamento
Espectrometria de massas propiciou grandes avanços nas áreas de Proteômica, Glicômica e Lipidômica Wenk, M.R. 2010 Cell 143, 188.
Sequenciamento de proteínas por espectrometria de massas
Busca baseada em dados de MS (PMF) Busca em Banco de Dados (ex. Mascot) Busca baseada em dados de MS/MS (sequenciamento) Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo selecionado
Exemplo de análise de glicosidase por SDS-PAGE e espectrometria de massas
Determinação da pureza e da massa molecular da glicosidase por SDS-PAGE Padrão de glicosidase
Determinação da massa molecular da glicosidase por MALDI-TOF Massa = 57287 Da Inte ns. [a.u.] 57288.292 3000 MALDI-TOF 2000 1000 0 40000 45000 50000 55000 60000 65000 70000 75000 m/z
Remoção da banda da glicosidase, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massa Tripsinização MALDI-TOF-TOF
Espetro de massa dos peptídeos da beta-glicosidase Inte ns. [a.u.] x10 4 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 742.326 963.414 898.397 1179.511 1333.524 1515.656 1783.703 2065.844 2383.836 3313.082 2938.198 4074.899 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 m/z Lista de peptídeos m/z 698.315 742.326 780.283 866.400 936.431 963.414 1034.066 1082.483 1121.502 1154.519 1170.517 1179.511 1361.555 1383.528 1515.656 1728.736 1783.703 1940.766 2089.867 2272.853 2288.853 2310.801 2938.198
Busca no Mascot utilizando as massas dos peptídeos detectados Lista de peptídeos m/z 698.315 742.326 780.283 866.400 936.431 963.414 1034.066 1082.483 1121.502 1154.519 1170.517 1179.511 1361.555 1383.528 1515.656 1728.736 1783.703 1940.766 2089.867 2272.853 2288.853 2310.801 2938.198
Banco de Dados (Database) Swiss-Prot Se a proteína é de um organismo bem caracterizado como humanos, camundongos, levedura, ou arabdopsis, o Swiss Prot é o recomendado NCBIprot Se a proteína é de bactéria ou planta, usar o NCBIprot, pois é um banco de dados mais amplo que o Swiss-Prot
Modificações Modificações fixas Exemplo mais comum é a alquilação de cisteínas. O alquilante mais comum é a iodoacetamida (carbamidomethyl) ou ácido iodoacético (carboxymethyl). Modificações variáveis Exemplo: - Oxidações que ocorrem durante o processamento de amostra (oxidação de metionina) - Modificações pós-traducionais (fosforilação)
Scores acima de 93: significantes (p<0.05) O score obtido na busca foi de 121.
Busca baseada em dados de MS (PMF) Busca em Banco de Dados (ex. Mascot) Busca baseada em dados de MS/MS (sequenciamento) Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo selecionado
Sequenciamento de Peptídeos baseado em MS/MS
Matching dos escpectros de MS/MS realizado por software MS/MS Experimental MS/MS Teórico Sequência do peptídeo
Resumo: Identificação de Proteínas/Enzimas 1. Determinação da massa molecular SDS-PAGE cromatografia de exclusão molecular espectrometria de massas (MALDI-TOF, Q-TOF) 2. Determinação da sequência de aminoácidos Degradação de Edman Espectrometria de massas Em ambos os casos proteínas precisam ser clivadas especificamente (ex. Proteases) para gerar peptídeos menores. A espectrometria de massas é a técnica mais precisa e mais utilizada atualmente.
Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli - mais de 2,000 proteínas podem ser visualizadas Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos Lenhinger Proteínas são identificadas por espectrometria de massas
Análise Proteômica de uma Célula Eucariótica (HeLa) - mais de 2,000 proteínas identificadas 36761 espectros de MS/MS
Avisos: Entregar exercício 1 Resolver exercício 2 em casa Gabaritos e materiais da aula disponíveis na página do Sandro Próxima aula (20/Junho) teremos plantão de dúvidas na sala 4 Prova 2 será no dia 27/Junho no Anfiteatro Vermelho