n LC provém a separação, em fase líquida, de misturas complexas, porém dificilmente fornece a identificação positiva de componentes individuais.

Transcrição

1 Introdução à LC/MS

2 Introdução n LC provém a separação, em fase líquida, de misturas complexas, porém dificilmente fornece a identificação positiva de componentes individuais. n MS é uma técnica que auxilia na elucidação estrutural de compostos em fase gasosa, porém dificilmente é apropriado para a análise de misturas. n LC opera em fase líquida enquanto que MS opera em fase gasosa, sob alto vácuo.

3 Introdução n O uso de uma interface é necessário para ter compostos seqüencialmente separados em LC e introduzidos para análise no MS. n Um bom sistema LC/MS pode fornecer informações quali e quantitativas, geralmente com diminutas quantidades de material.

4 Cromatografia Líquida

5 Espectrometria de Massas

6 Misturas em MS

7 Combinando LC com MS

8 Aquisição dos Dados Velocidade de varredura

9 Aquisição dos Dados Número de espectros por pico

10 Melhorando os Resultados Obter a maior eficiência possível

11 Melhorando os Resultados Apresentação de cromatograma de íon selecionado

12 Melhorando os Resultados Monitoramento de íon selecionado (SIM)

13 Sumário n O interfaceamento de LC com MS resulta em um instrumento poderoso de LC/MS que pode ser usado para análises de misturas complexas, originada de fontes mais variadas. n Aplicações de interesse nas áreas de meio ambiente, arqueologia, medicina e forense, além de química e bioquímica.

14 Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas LC/MS n Espectrometria de Massas n Interfaces n Analisadores de Massas

15 I. Espectrometria de Massas (MS) n A espectrometria de massas é uma técnica analítica instrumental utilizada para a análise, em fase gasosa, de átomos ou moléculas de uma amostra que são ionizados e separados de acordo com a razão massa/carga quando submetidos a condições específicas de um campo elétrico e/ou magnético.

16 I. Espectrometria de Massas (MS) n A determinação da massa molecular; n A caracterização estrutural; n O estudo da reatividade em fase gasosa; n A análise qualitativa e quantitativa dos componentes de uma mistura complexa; n A estrutura de compostos inorgânicos, orgânicos e biológicos; n A estrutura e composição de superfície sólida; n A razão isotópica de átomos na amostra.

17 II. O Espectrômetro de Massas n Processo de ionização e/ou fragmentação n Separação dos íons n Detecção e análise Amostra Sistema de introdução de amostra Fonte de íons Analisador de massas Detector Sistema de vácuo Proc. de dados

18 Etil benzeno: MM = 106 Da C 6 H 5 CH 2 CH 3 + e - C 6 H 5 CH 2 CH e -

19 Informações do Espectro de Massas n Separação dos íons pela razão massa/carga n Pico do íon molecular n Pico do íon base (100%) n Padrão de fragmentação n Razão isotópica

20 III. Fontes (Processos) de Ionização Tipo Nome e Sigla Agente Ionizante Básico Fase Gasosa Impacto Eletrônico (EI) elétrons energéticos Ionização Química (CI) íons gasosos Ionização de Campo (FI) eletrodo alta voltagem Dessorção Dessorção de Campo (FD) eletrodo alta voltagem Ionização electrospray (ESI) alto campo elétrico Ionização/dessorção à laser feixe de laser assistido por matriz (MALD/I) Bombardeamento de átomos rápidos (FAB) feixe átomos acelerados Ionização termospray (TS) alta temperatura

21 Impacto Eletrônico ou Ionização por Eletrons n A amostra passa por uma cortina de elétrons acelerados por um campo de 70 ev E = 70 ev kj mol -1 n Energia de ligação típica kj mol -1 Fragmentação

22 Impacto Eletrônico

23 Ionização por Elétron J Alta produção de íons - boa sensibilidade J Fragmentação auxilia na identificação K Requer amostra volátil L Pico íon molecular nem sempre é evidente Uso de Ionização Química (CI): produção de íon molecular e a fragmentação é mais amena

24 Reprodutibilidade de fragmentação

25 Ionização à Pressão Atmosférica (API) n Ionização Electrospray (ESI) n Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI)

26 Vantagens API n Informação sobre a massa molecular (MM) dos compostos, inclusive grandes biopolímeros. n Sensível; MM obtida com concentrações baixas de analitos. n A técnica é compatível com moléculas voláteis, não voláteis, polares e apolares. n Excelente para confirmação de compostos conhecidos.

27 Ionização por Electrospray (ESI) n Ionização à pressão atmosférica e temperatura ambiente n Aplicação de campo elétrico de vários kv promove a ionização das gotículas do spray n Um contra fluxo de gás secante reduz o tamanho das gotículas até o seu colapso eletrostático n Produção de íons com elevado número cargas

28 Interface ESI

29 Processo de Ionização

30 Aplicações do ESI q Análise de compostos polares e com elevada massa Molecular. Por Exemplo: Saponinas H 3 C CH 3 OH CH 3 CH 3 OH O H 3 C O HO O O H C H 3 OH O O H HO O O O H OH O O H OH H

31 sep16rfs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ES e Monitoramento da composição de % frações obtidas de extratos de Sapindus saponaria sep1162fs 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan ES e % sepfreu2026fs (0.494) Cm (7:13) Scan 1.81e5 ES e % % sepfreu2026fs 0 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ESsepha1149Fs 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8)) Scan ES e5 sep1112fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES e % % m/z sep1124fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) Scan ES e % sep16rfs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ESsep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES e e % sep1162fs 0 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan ESsep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) Scan ES e e Figura 18: Conjunto de espectro de massas 924.6das frações eluídas com MeOH/H % O (1:1). Debaixo para cima: fração 12, , 49 e sepfreu2026fs 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ESsep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ES e e %

32 Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI) n Bastante similar a ESI n Indicado para obtenção de MM de compostos conhecidos (confirmação de síntese de biblioteca combinatória), porém indução de fragmentação também é possível n Compatível com grande faixa de fluxos de fase móvel n Robusto para desenvolvimento de método

33 Interface APCI

34 Principais Diferenças entre APCI e ESI n Mecanismo de Ionização: n Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador aquecido e pneumaticamente assistido. A voltagem (~3 kv) é aplicada a uma agulha de metal na saída do spray. n A descarga Corona ioniza as moléculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos por transferência de prótons formando [M+H] + ou [M-H] -

35 Principais Diferenças entre APCI e ESI n Razão de Fluxo: n APCI tolera fluxos na ordem de 0,2 a 2,0 ml/ min, enquanto que ESI opera no máximo até 1,0 ml/min. n ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos quanto 5 µl/min, compatível com acoplamentos capilares (µlc ou CZE).

36 Principais Diferenças entre n Fragmentação: APCI e ESI n Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentação, enquanto que ESI pode até formar alguns íons pseudomoleculares. n APCI não produz cargas múltiplas, portanto não é adequado para compostos de alta MM. n Sensibilidade: n Sem ser uma regra, APCI tende a render melhor sensibilidade para solutos menos polares.

37 Dessorção/Ionização à Laser Assistida com Matriz (MALD/I) n Processo de ionização branda. n Apropriado para biomoléculas de elevado peso molecular. n Pulso de laser incide sobre uma amostra cocristalizada com uma matriz apropriada - derivados de ácidos benzóicos. n Análise proteômica.

38 Dessorção/Ionização à Laser Assistida com Matriz (MALD/I)

39 Espectro MALD/I

40 IV. Analisadores de Massas n Setor magnético (B) n Duplo foco (EB ou B 2 ) n Quadrupolo (Q) n Tempo de vôo (TOF) n Captura de íons (MS n ) n Ciclotron de íons (ICR)

41 Resolução em MS Nome Fórmula Nominal Exata Média Methyl Stearate C19H38O Ubiquitin C378H630N105O118S R S = m Δ m R S = ,0 e 400,1 (40,00 e (40,01)

42 Resolução em MS

43 Resolução em MS A resolução necessária depende da aplicação

44 Analisador tipo Setor Magnético m z = B 2 r 2V 2 e

45 Analisador Quadrupolar (Q) n Analisador de varredura n Normalmente é mais barato e robusto que setor magnético n Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofreqüência entre pares, permitindo que apenas um íon atinja o detetor de cada vez

46 Analisador Quadrupolar (Q)

47 Analisador Quadrupolar (Q)

48 Analisador Quadrupolar (Q)

49 Analisador Quadrupolar (Q) Experimentos de MS/MS com triplo quadrupolo

50 Analisador Quadrupolar (Q)

51 Tempo de Vôo (TOF) n Íons são produzidos em pulsos e injetados no tubo de deslocamento

52 Tempo de Vôo (TOF)

53 Tempo de Vôo (TOF) n Separação dos íons é temporal e depende da energia cinética dos fragmentos t f = d = d (1 2) V v m z m z = 2 1,9 V t d 2

54 Analisador Trap Iônico (ion trap) n Compacto & robusto n Funcionamento similar ao quadrupolo n Capacidade de efetuar MS tandem temporal

55 Analisador Trap Iônico (ion trap)