Aplicações de Espectrometria de Massa

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1 Tipos de MS Aplicações de Espectrometria de Massa Prof. Alan J A McBride Proteômica GC-MS - Cromatografia gasosa MS Separa compostos voláteis na coluna de gás e a identificação é por massa LC-MS - Cromatografia líquida MS Separa compostos delicados em coluna de HPLC e a identificação é por massa MS-MS - Espectrometria de massa tandem Separa fragmentos compostos pelo campo magnético e a identificação é por massa Ionização por electronspray (ESI) ESI Massas moleculares até ca Da Dar origem a íons com uma única carga (M + H) + ou (M - H) - Exemplo do espectro da leucina encefalina pentapeptídeo, YGGFL C 28 H 37 N 5 O 7 = 555,2692 Da Íons dominantes: m/z 556,1 M + H + = 555, Boa concordância com o valor teórico Outros íons de menor intensidade: m/z 557,2 12 C foi substituído por um átomo de 13 C m/z 578,1 Aductos íons de sódio (M + Na) + Massas moleculares > ca Da Dar origem a íons com cargas múltiplas (M + nh) n+ ou (M - nh) n- As proteínas têm muitos locais adequados para protonação; Exemplo de cargas múltiplas, que é o espectro m/z da proteína lisozima de ovo de galinha branca: m/z varia entre 1101,5 e 2044,6; Cada pico é um molécula de proteína intacta, um número diferente de cargas. M. Mann, C. K. Meng, J. B. Fenn, Anal. Chem., 1989, 61, 1702 Exemplo: lisozima Os valores m/z são expressadas: m/z = (MW + nh + )/n m/z = a razão massa-carga; MW = massa molecular da amostra; n = o número inteiro de cargas dos íons; H = massa de uma próton = 1,008 Da. Exemplo: lisozima m/z = (MW + nh + )/n Se os íons m/z = 1431,6 ter "n" As taxas de íons m/z 1301,4 terá "n +1" cargas, A equação acima pode ser escrita de novo para estes dois íons: 1431,6 = (MW + nh + )/n e 1301,4 = [MW + (n+1)h + ] /(n+1) n(1431,6) - nh + = (n+1)1301,4 - (n+1)h + n(1431,6) = n(1301,4) +1301,4 - H + n(1431,6 1301,4) = 1301,4 - H + n = (1301,4 - H + ) / (1431,6 1301,4) = ,6 = (MW + nh + )/n 1431,6 x 10 = MW + (10 x 1,008) MW = 14,316 10,08 MW = ,9 Da 1

2 Exemplo: lisozima Massa molecular observada, ,9 Da, tem boa concordância com o valor teórico de ,14 Da. Precisão usando ionização electrospray ou nanospray: Dentro de 0,01% da massa molecular Representa o ± 1,4 Da Exemplo: lisozima Pode converter o espectro m/z para um perfil de massa molecular: Dominado pelo pico ,7 Da Vários picos menores de massa maior - aductos de sal: Na (M+23), K (M+39), H 2 SO 4 ou H 3 PO 4 (M+98). As massas moleculares podem ser lidos facilmente e sem ambiguidade Indicação da pureza da proteína. Espectrometria de massa tandem Espectrometria de massa tandem NANOSPRAY TIP HEXAPOLE QUADRUPOLE SKIMMER ION SOURCE HEXAPOLE COLLISION CELL HEXAPOLE TOF MCP DETECTOR PUSHER REFLECTRON Finalidade é gerar íons do íon-precursor para fornecer informação estrutural sobre uma molécula. Além disso, permite a separação e identificação de compostos em misturas complexas. Utiliza dois ou mais analisadores de massa / filtros separados por uma câmara de colisão cheio com árgon ou xénon. Célula de colisão é onde os íons selecionados são encaminhados para uma maior fragmentação. Espectrometria de massa tandem Configurações diferentes de MS-MS: Quadrupolo-quadrupolo (baixa energia) Sector magnético-quadrupolo (alto) Quadrupolo-TOF (baixa energia) TOF-TOF (baixa energia) Experimentos de fragmentação também pode ser realizada em instrumentos analisadores individuais, tais como instrumentos de armadilha de íons e instrumentos TOF equipado com pós-fonte de decomposição. Caracterização de Proteínas 2

3 Por que Proteômica? As proteínas são os agentes activos biológicos em células. Sequências de DNA não mostram como as proteínas funcionam ou como biológica processos ocorrem. Proteínas sofrem modificações pós-transcricionais. Estruturas 3D afetar a função da proteína. O splicing alternativo. The Human Proteome Initiative. (2007) Retrieved March 24, Desafios As análises de misturas complexas não são completas. Difícil preparar uma amostra pura. A expressão de proteínas é muito sensível às condições ambientais. Difícil de utilizar correntes de íons para determinar a abundância de peptídeos. Perfil de proteínas Gerar mapas de proteoma de grande escala. Anotar e corrigir sequências genômicas. Analisar a expressão da proteína como uma função do estado celular. MS-MS e Proteômica MS-MS Metodologia 2D-GE + MALDI-MS Peptide Mass Fingerprinting (PMF) 2D-GE + MS-MS Sequence Tag/Fragment Ion Searching Multidimensional LC + MS-MS ICAT (marcação com isótopos) MudPIT 1D-GE + LC + MS-MS De Novo Peptide Sequencing (MS-MS) 3

4 MS-MS para identificar proteínas Porque Tripsina para MS-MS? As proteínas são isolados (a partir de gel ou HPLC) e submetido a digestão tríptica; Peptídeos são enviados através de ionizador e numa célula de colisão, onde os íons duplamente carregados são seleccionados e fragmentados através de decomposição induzido por colisão (CID); Os íons resultantes com carga única (íons filha) são analisados para determinar a sequência ou a identidde do peptídeo-precursor. CID de peptídeos menos de 2-3 kda é mais fiável para estudos MS-MS A frequência de clivagem tríptica garante que a maioria dos peptídeos será deste tamanho. Tripsina cliva no lado C-terminal da arginina e lisina; Os resíduos básicos estão no lado C-terminal; Então, os peptídeos fragmentam de um modo mais previsível ao longo do comprimento do peptídeo. Por que carga dupla? É mais fácil de interpretar espectros obtidos a partir de péptideosprecursores duplamente carregadas: Maioria dos fragmentos de íons têm carga única. Precursores com carga dupla fragmenta também de tal modo que a maior parte das ligações peptídicas romper com frequência similar, de fato que é mais provável para derivar uma sequência completa. MS-MS e Fragmentos de Peptídeos Quando os peptídeos ou proteínas são admitidos para uma célula de colisão: Usualmente fragmenta no ponto mais fraco da ligação (a ligação peptídica); Quebra nas ligações CH-NH e CH-CO também ocorre. Condições de colisão têm que ser otimizado para cada peptídeo; Dois tipos de íons-filha são produzidos: "b" de íons e "y" de íons. MS-MS Fragmentação de Peptídeos MS-MS Fragmentação de Peptídeos y n-1 y n-2 y 1 Ala-Gly-His-Leu- Phe-Glu-Cys-Tyr R 1 R 2 R 3 R n H 2 N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO CO-NH-CH-CO 2 H b 1 b 2 b n-1 b 1 y 1 b 2 y 2 b 3 y 3 b 4 y 4 b 5 y 5 b 1 y 1 b 2 y 2 b 3 y 3 b 4 y 4 b 5 y 5 4

5 MS-MS Sequenciamento de novo de proteínas Peptídeos fragmento ao longo esqueleto do aminoácido para dar informação sobre a sequência. Peptídeos ca Da ou menos produzir os dados mais úteis. A quantidade de informação sobre a sequência peptídica varia de um para o outro. Alguns peptídeos pode gerar dados suficientes para uma sequência completa de ser determinado, outros podem gerar uma sequência parcial de 4 ou 5 amino ácidos. A proteína digerida pode ser analisada como uma mistura de reação total, sem qualquer separação dos produtos, a partir da qual os peptídeos individuais são selecionados e analisados pelo MS para gerar informação sobre a sequência. Cerca de 4 µl de solução necessária para a análise da digestão Proteína original de ca pmol/µl. MS-MS sequenciamento é um sensível técnica que consome pouco amostragem. As vezes, a sequência da proteína completa pode ser verificada: Mas, 70-80% cobertura é razoável. Muitas vezes, a sequência de uma cauda de 4/5 aminoácidos de um peptídeo proteolítica único é suficiente para identificar a proteína a partir de um banco de dados. Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido. Sequenciamento de novo de proteínas Sequenciamento de novo de Peptídeos (MS-MS) Feito quando a amostra não é susceptível de degradação de Edman; Feito quando não tem sequência ou perfil de PMF no bancos de dados; Requer um analisador de massa de elevada resolução (FT-ICR, QTof ou instrumento QStar) com <20 ppm resolução; Normalmente exige que digerir várias enzimas; Ainda um processo difícil, mas possível de fazer em quantidades muito mais baixas do que degradação de Edman. A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do exemplo, os íons y. Protocolos para Sequenciamento MS-MS Normalmente não pode identificar a um íon "b" de um íon "y"; Assumir a menor massa visível no espectro é uma lisina ou arginina: É o íon y1 Tripsina cliva após uma lisina ou arginina A massa y1 deve ser 147,113 para a lisina ou arginina para 175,119: O íon y1 é calculado adicionando 19,018 u (três hidrogênios e um de oxigénio) para as massas de resíduos de lisina e arginina. Massas das Amino Ácidos Glicina 57,02147 Alanina 71,03712 Serina 87,03203 Prolina 97,05277 Valina 99,06842 Treonina 101,04768 Cisteína 103,00919 Isoleucina 113,08407 Leucina 113,08407 Asparagina 114,04293 Massa monoisotópico Aspártico 115,02695 Glutamina 128,05858 Lisina 128,09497 Glutâmico 129,04264 Metionina 131,04049 Histidina 137,05891 Fenilalanina 147,06842 Arginina 156,10112 Tirosina 163,06333 Triptofano 186,

6 Anotar: Gly + Gly = u e Asn = u Ala + Gly = u e Gln = u and Lys = u Gly + Val = u e Arg = u Ala + Asp = Glu + Gly = e Trp = u Ser + Val = u e Trp = u Leu = Ile = u Protocolo 1. Preparação de amostra 2. Separação 3. Espectrometria de massa Visão geral Preparação de amostra A preparação da amostra inclui tudo o que se encontra entre a amostra e a primeira dimensão do gel 2D: Células e culturas de células multiplicar; Homogeneização e isolamento das proteínas; Remoção de contaminantes / limpeza; Fracionamento. Aebersold, R & Mann, M. (2003). Mass spectrometry based proteomics. Nature. 422, Remoção de contaminantes / limpeza Limpeza geral; melhorar a resolução; Melhorar a reprodutibilidade; Fracionamento; reduzir a complexidade; Melhorar a faixa de detecção; Enriqueça proteínas de baixaabundância. Gel SDS-Page em 2D 1. A primeira dimensão (foco isoelétrica) 1. Gel com um gradiente de ph imobilizado 2. Corrente causa as proteínas carregadas para se mover até que atinja o ponto isoeléctrico 2. A segunda dimensão (separação por massa) 1. Tira de gel da 1ª dimensão é carregada num gel de SDS-Page 2. SDS desnatura as proteínas (para fazer o movimento dependente apenas da massa, não de forma) e elimina a efeito de carga. Pode discriminar: ~ proteínas 6

7 Marcação Movie Coloração: Prata Coomassie blue Corantes fluorescentes Sypro Ruby $$$ Maracação radioisotópica Amostra de peptídeo Identificação dos Peptídeos MS-MS e Proteômica Vantagens Fornece dados precisos e específico da sequência. Mais informativos do que métodos PMF (> 90%). Pode ser usado para seqüenciamento de-novo (não totalmente dependente da base de dados). Pode ser usado para identificação de modificações. Prejuízos Requer manipulação e manuseio da amostra. Requer equipamento mais caro e complicado. Exige conhecimentos de alto nível. Mais lenta, não geralmente larga-escala. Quantificação de proteínas 7

8 Proteômica Quantitativa Moderno Isotope-coded affinity tag (ICAT): Isótopos pesados ou leves e a cauda de biotina pode modificar peptídeos contendo cisteína; Grupo Aebersold, aplicou esta tecnologia para células de Saccharomyces cerevisiae. Proteómica quantitativa é a identificação e quantificação precisa da expressão de proteína total num genoma ou um complexo sistema híbrido: Detectar as alterações quantitativas nas proteínas. Descoberta da Proteômica vs. Proteômica Refinada Discovery versus targeted proteomics Proteômica de descoberta: Otimiza a identificação de proteínas por gastar mais tempo e esforço por amostra e reduzir o número de amostras analisadas. Proteômica refinada: Estratégias limita o número de recursos que serão monitorados; Otimizar os métodos de cromatografia de afinação e aquisição de alcançar a maior sensibilidade Rendimento para centenas ou milhares de amostras Proteômica Quantitativo Relativo e Absoluto MS é inerentemente não quantitativo: Diferenças na eficiência de ionização; Detecção de muitos peptídeos numa determinada amostra Provocou o desenvolvimento de métodos para determinar a abundância relativa e absoluta de proteínas em amostras. A intensidade de um pico de espectro de massa não é um bom indicador da quantidade de substância a analisar na amostra. Proteômica Quantitativo Relativo Separadamente analisar amostras por MS e comparar o espectro para determinar a abundância de péptidos em uma amostra em relação a um outro: Estratégias de etiqueta sem quantificação Amostras diferentially marcadas são combinados e analisados em conjunto, e as diferenças nas intensidades dos picos dos pares isotópicos refletem com precisão a diferença na abundância das proteínas correspondentes. Proteômica Quantitativo Relativo SILAC Stable isotope labeling with amino acids in cell culture ICAT Isotope-coded affinity tag ITRAQ Isobaric tags for relative and absolute quantitation Marcação enzimática Proteômica Quantitativo Absoluto Selected reaction monitoring (SEM) Monitoramento de reação selecionada. Íon de massa particular é seleccionado na primeira fase de MS-MS Íon-percursor. O íon-produto da fragmentação do íon-precursor é seleccionado para a segunda fase MS para detecção. ESI-Quadrupolo triplo MS: Peptídeos marcados pesados (Ex. D, 13 C, or 15 N) para formar a curva de calibração; Número de cópias por célula do peptídeo nativo leve, e, por extensão, a sua proteína parental. 8

9 Relative Abundance 18/02/2013 Glicobiologia Analise de Glicanos Glicanos N-ligados são extremamente importantes na dobragem de proteínas em células eucarióticas. Células tumorais fazer glicanos N-ligados que são anormais e são reconhecidos pelo receptor CD337 nas células NK. Glicanos O-ligados são importantes no desenvolvimento de microflora intestinal normal. Outro tipo de glicano celular é os glicosaminoglicanos: Heparina MS no Glicobiologia Modificações pós-traducionais (PTM) Predominantemente utilizado na glicobiologia para caracterização e elucidação das estruturas de glicano. É um método complementar de HPLC para a análise de glicanos. Glicanos intactas são detectadas directamente: Íons carregados individualmente por MALDI-MS; Ou, seguindo permetilação ou peracetylation, por bombardeamento com átomos rápidos de espectrometria de massa (FAB-MS. ESI-MS dá bons sinais para os glicanos menores PTM Amino ácido alvos para PTM. Deteção de Fosfoserina b-ions NH- K E s* S N T D S A G A L G T L R -OH y-ions s* = phosphoserine [M+2H] y9 y14-h b1 3PO 4 b2 y y y1 b3-phos y5 y y y10 y11 y12 y13 y14 y15-h 3PO m/z 9

10 Identificação de Patógenos Identificação de Patógenos MALDI-MS para identificar proteínas produzidas por bactérias; Bancos de dados de espectros MALDI para identificar as bactérias; Neste ponto, não há grande base de dados consistente está disponível. Teste respiratório da uréia para identificar Helicobacter pylori Pacientes engolher uréia marcado com um isótopo raro, ex. 13 C; detecção de CO 2 marcado com 13C no ar expirado indica que a ureia foi clivado, que indica a presença de urease do H. pylori; 13 C é detectado por razão isotopo MS. Aplicações de GC-MS Monitoramento ambiental e limpeza Forense criminal Antidoping Segurança, ex. aeroportos Análise de alimentos, bebidas e perfumes Astroquímica Medicina GC-MS Doenças metabólicas congênitas que afetam os níveis sanguíneos de ácidos orgânicos; Sistema de análise integrada GC-MS, que é possível testar um recémnascido por mais de 100 desordens metabólicas genéticas. Outras aplicações de MS Isótopo datação e rastreamento Análise de vestígios de gás O mapeamento da localização dos átomos individuais Farmacocinética Exploração espacial Conclusões Proteômica é extremamente valioso para a compreensão de processos biológicos e avançar o campo da biologia de sistemas. O principal objetivo da biologia de sistemas é a integração de dados de estas observações em modelos que possam, eventualmente, representar e simular a fisiologia da célula. 10