Anáise univariada e Mutivariada no mapeamento genético da pressão arteria Nubia Esteban Duarte 1, Júia Maria Pavan Soer, 1 e Aexandre Pereira, 2 1 Universidade de São Pauo (USP) nubiaest@ime.usp.br 2 Laboratório de Genética e Cardioogia Moecuar (USP) 1. Introdução Em pesquisa Genômica é de grande interesse o mapeamento de genes que controam traços ou fenótipos quantitativos conhecidos na iteratura como QTL s (do ingês, Quantitative trait oci). Metodoogias estatísticas para identificar genes que tenham efeitos sobre um único traço são bem conhecidas na iteratura e têm sido exaustivamente apicadas no mapeamento genético de muitas doenças. Porém, na prática, diferentes traços são correacionados, como é o caso de hipertensão e obesidade, possivemente, devido à ação de genes comuns envovidos na sua reguação. Nestes casos, por meio de técnicas estatísticas mutivariadas, que exporam a estrutura de covariância entre os traços, é possíve identificar genes não detectados por anáises univariadas, ganhar precisão nas estimativas dos efeitos e conhecer a posição desses genes, aém de testar efeitos de peiotropia (um mesmo gene controando vários traços) e interações gene ambiente (por exempo, os genes que controam a pressão antes e depois de dieta com sa). No contexto dos probemas de abordagem mutivariada surgiu a motivação para o desenvovimento do presente trabaho cujos objetivos são: Exporar diferentes modeos de mapeamento genético univariados e mutivariados para estudar o efeito de peiotropia e interação gene ambiente; Apicar tais modeos de mapeamento genético na anáise de um conjunto de dados reais com o intuito de procurar QTL s reguadores da pressão arteria, encontrar a posição aproximada destes no mapa cromossômico e, tanto quanto possíve, caracterizar seus efeitos nos diferentes grupos genotípicos de indivíduos. As apicações consideradas são baseadas em dados reais coetados no Laboratório de Cardioogia e Genética Moecuar do Instituto do Coração de São Pauo (InCor-USP). O estudo é baseado em uma popuação de 221 ratos F 2 resutante do cruzamento controado entre uma inhagem de animais normotensos e outra de hipertensos, desenvovidas de forma que o background genético 1 da geração de fihos possua características praticamente idênticas, diferindo apenas nos determinantes genéticos da pressão arteria. Foram coetadas 23 variáveis fenotípicas, entre as quais, neste trabaho serão consideradas: pressão basa, pressão sistóica pós-sa, pressão diástóica antes e pós-sa, pressão após o uso do medicamento antihipertensivo Captopri. Aém disso, os 221 animais foram genotipados considerando um mapa com 182 marcadores moecuares espahados nos 21 cromossomos dos ratos. 2. Métodos de mapeamento genético A base fundamenta do mapeamento genético consiste em utiizar a informação observáve de pontos de referência do genoma e, a partir disso predizer QTL s e seus efeitos associados. Esses pontos de referência são denominados marcadores moecuares ou ocos cromossômicos cuja posição é conhecida e são passíveis de genotipagem, isto é, para tais posições cromossômicas a constituição genotípica do indivíduo pode ser identificada. Os marcadores moecuares constituem uma amostra de ocos genéticos estrategicamente dispostos ao ongo do genoma e a hipótese empregada para a ocaização de genes de interesse (QTL s) é que agum marcador estará próximo e, portanto, suficientemente igado (do ingês, inkage) ao QTL de interesse [5] e [10], de ta forma que os dados do marcador oferecem informação sobre o QTL. O procedimento mais comum no mapeamento genético tem sido a procura por QTL s considerando um traço de cada vez [4], [1], [10]. Mediante estes procedimentos univariados, vários estudos têm obtido sucesso, identificando genes que infuenciam um fenótipo, por exempo, genes reguadores da pressão sangüínea [7]. pavan@ime.usp.br bmpereira@incor.usp.br 1 Background genético: é o conjunto de muitos genes, cada um com pequeno efeito.
No entanto o mapeamento de QTL s considerando um traço de cada vez não toma vantagem da estrutura de correação dos dados e tem muitas desvantagens para o mapeamento de QTL s, assim como para o entendimento da correação genética. A utiização de técnicas mutivariadas é mais apropriada em virtude das características serem consideradas simutaneamente, obtendo interpretações que não seriam possíveis com o uso de métodos univariados apicados separadamente a cada traço. Ressata-se o fato de que mediante estas técnicas é possíve investigar questões bioógicas importantes tais como o efeito de peiotropia e interações QTL ambiente [2]; [6]. Levando em consideração a estrutura de correação de mútipos traços, a anáise conjunta tem várias vantagens comparada à anáise de traços individuais no mapeamento de QTL s, incuindo o aumento de poder dos testes e da precisão das estimativas dos parâmetros [2]. A seguir serão apresentados os métodos estatísticos para o mapeamento de QTL s no caso univariado e mutivariado. 2.1 Mapeamento de QTL s sob modeos univariados Na iteratura encontran-se diversos métodos de mapeamento univariado, [10] entre ees o método de mapeamento intervaar composto que será descrito a seguir. Iustram-se as considerações feitas sobre mapeamento intervaar composto mediante o segmento cromossômico esquematizado na Figura 1. Suponha que o intervao anaisado peo método de mapeamento por intervao composto esteja entre os marcadores M j e M j+1, considera-se como cofatores os marcadores adjacentes ao intervao de pesquisa para impedir que os efeitos dos possíveis QTL s igados ou não igados ao possíve QTL (Q j ) mapeado, interfiram na sua detecção no intervao de interesse. Aém disso, com o objetivo de ganhar precisão na anáise, adiciona-se como covariáveis outros marcadores em posições distantes ou em cromossomos diferentes do intervao mapeado, que, possivemente tenham agum efeito [5]. Sendo T o número tota de marcadores no mapa genético e t (t < T ) o número de marcadores que são utiizados como cofatores, para uma amostra de n indivíduos avaiados para um fenótipo quantitativo, o modeo para o mapeamento por intervao composto, considerando que o intervao de pesquisa seja (j, j + 1) é dado por: Figura 1: Representação do método de mapeamento por intervao composto que permite investigar o QTL (Q j ) ocaizado entre os marcadores (M j e M j+1 ), considerando também outros marcadores como covariáveis. y i = µ + ax ai + dx }{{ di + } Intervao =1 j, j+1 (a x ai + d x di ) +e i, } {{ } Cofatores (1) onde, µ: média gera; y i : fenótipo avaiado no indivíduo i, i= 1, 2,...,n; a: coeficiente de regressão dos efeitos aditivos do QTL; d: coeficiente de regressão dos efeitos de dominância do QTL; a e d : coeficientes de regressão associados ao - ésimo marcador; X ai e X di : vaores preditos para os efeitos aditivos e de dominância do QTL. São cacuados por meio de informações genotípicas dos marcadores fanqueadores e por meio das probabiidades associadas aos coeficientes dos vaores de a e d.. x ai e x di : variáveis indicadoras do genótipo do -ésimo marcador no i-ésimo indivíduo, expicitamente: x ai = 1, se o genótipo do marcador é mm 0, se o genótipo do marcador é Mm 1, se o genótipo do marcador é MM x di : variáve indicadora da heterozigosidade do marcador; x di = { 1, se o genótipo do marcador é heterozigoto (Mm) 0, se o genótipo do marcador é homozigoto (mm ou MM) e i : o resíduo aeatório. Sob as considerações dadas em [1] os resíduos são assumidos normais com média 0 e variância σ 2 (e i N(0, σ 2 )). Segundo o enfoque de [10], os resíduos do modeo seguem uma distribuição de mistura de normais. Como é observado, a primeira parte na expressão (1) estima o efeito do QTL no intervao anaisado, já os termos dentro do somatório referem-se ao ajuste dos marcadores como covariáveis para remoção dos efeitos de outros possíveis QTL s igados e não igados ao QTL mapeado. Em resumo, as razões para incuir mútipos marcadores no modeo de regressão são principamente duas:
Ganhar precisão: pois ao incuir no modeo os marcadores não igados é esperado que o resíduo seja diminuído; Controe de faso positivo (efeitos fantasma"): os marcadores igados que são utiizados como cofatores, boqueiam os efeitos de possíveis QTL s pertencentes a regiões adjacentes ao intervao de pesquisa. 2.2 Mapeamento de QTL s sob modeos mutivariados As propostas para o mapeamento de mútipos traços encontradas na iteratura são principamente, o Modeo de Regressão Intervaar Mutivariado [2], Método da Decomposição Espectra via Componentes Principais [6]. A seguir será apresentado o modeo de regressão mutivariado considerado em [2]. Para uma amostra de n indivíduos F2 com observações sobre m traços ou fenótipos e t marcadores que são utiizados como covariáveis, o modeo intervaar composto para o i-ésimo indivíduo é dado a seguir: y i1 = µ 01 + a 1 X ai + d 1 X di + (a 1 x ai + d 1 x di ) + e i1, y i2 = µ 02 + a 2 X ai + d 2 X di + (a 2 x ai + d 2 x di ) + e i2, (2). y im = µ 0m + amx ai + dmx di + (a m x ai + d m x di ) + e im. A descrição dos parâmetros e das variáveis envovidas segue aquea apresentada para o modeo dado na expressão (1) com a extensão para m traços. Nota-se que o modeo assume que cada traço está associado ao mesmo conjunto de variáveis expicativas (QTL e marcadores). Considera-se que os efeitos residuais e iks são correacionados entre traços dentro de indivíduos, mas são assumidos independentes entre indivíduos isto é: onde, P (QQ), P (Qq) e P (qq) denotam as probabiidades a priori sobre o genótipo do QTL, (que sob o deineamento F 2 são dadas por 1/4, 1/2, 1/4 respectivamente). Neste caso as funções de densidade f são normais mutivariadas (m dimensionais), ta que: f QQ (y i G QQ ) N m (µ QQ ; Σ i ), f Qq (y i G QQ ) N m (µ Qq ; Σ i ), f qq (y i G QQ ) N m (µ qq ; Σ i ), onde Σ i é a matriz de covariância assumida homogênea para todos os níveis genotípicos e indivíduos. Testes de hipóteses dos efeitos de QTL s peiotrópicos e interação gene ambiente Com agumas restrições sobre os vaores dos parâmetros em um modeo mutivariado como em (2), diferentes hipóteses podem ser construídas e testadas sobre os efeitos aditivos e de dominância dos QTL s. Sem perda de generaidade, a seguir, hipóteses de interesse ao probema de mapeamento genético mutivariado considerando m = 2 traços (ou equivaentemente, um traço sob duas condições ambientais diferentes) são descritas: Teste sobre a presença de agum QTL em uma posição específica H 0 : a 1 = 0, d 1 = 0, a 2 = 0, d 2 = 0 H 1 : ao menos um é diferente de zero.(4) Para uma posição de QTL específica, dado que a hipótese H 0 em 4 tenha sido rejeitada, as seguintes hipóteses podem ser formuadas: Teste de efeitos condicionais Sob a suposição de que existe somente um QTL na região mapeada o qua tem efeito sobre um ou sobre os dois traços, as hipóteses podem ser formuadas como segue: Cov(e ik, e i k ) = 0, se i i k, k σ kk = ρ kk σ k σ k, se i = i e k k σ 2 k, se i = i e k = k H 10 : a 1 = 0, d 1 = 0, a 2 0, d 2 0 H 11 : a 1 0, d 1 0, a 2 0, d 2 0, (5) Dado o modeo (2) pode-se definir um modeo de misturas de normais mutivariadas para a distribuição do vetor de resíduos do i-ésimo indivíduo [2]. A função de verossimihanças para a amostra de n indivíduos F 2 (considerados independentes), é definida por: n L = [P (QQ) f QQ (y i G QQ ) + P (Qq)f Qq (y i G Qq ) + P (qq)fqq (y i Gqq )] (3) i=1 e H 20 : a 1 0, d 1 0, a 2 = 0, d 2 = 0 H 21 : a 1 0, d 1 0, a 2 0, d 2 0. (6) Interação de genes com o ambiente
Essenciamente, o teste da hipótese de interação gene com o ambiente considera dados de um mesmo fenótipo avaiado em diferentes ambientes ou condições de avaiação. Assim, com a rejeição de H 0, H 10 e H 20, para testar a interação QTL ambiente, há interesse nas seguintes hipóteses: H 30 : a 1 = a 2 = a, d 1 = d 2 = d H 31 : a 1 a 2, d 1 d 2. (7) Neste caso, rejeitar a hipótese nua H 40 impica aceitar que o gene está sendo expresso de forma diferente em cada ambiente, nos componentes aditivo e de dominância. Os testes das hipóteses 4, 5, 6, 7 são reaizados por meio da estatística da razão de verossimihanças sob o modeo mutivariado dado em 2, o qua é um modeo de mistura de normais e a estimação dos parâmetros do modeo podem ser obtidos peos agoritmos EM e ECM. A especificação dos testes e a iteração dos agoritmos é descrita em [2]. Os procedimentos 4, 5, 6 estão impementados no apicativo Cartographer [10], e foram usados neste trabaho. Vantagens do mapeamento mutivariado A seguir, destacam-se agumas características importantes da anáise conjunta consideradas em [2] e [6] quando comparadas com a anáise univariada. Sem perda de generaidade, os resutados são descritos para a situação de dois traços (m = 2). Considere LR 12, LR 1 e LR 2 as estatísticas da razão de verossimihanças conjunta e para os dois traços independentemente. Se a covariância entre dois traços for nua, ρ = 0, então LR 12 = LR1 + LR 2. O teste estatístico conjunto é aproximadamente a soma de testes estatísticos individuais para traços independentes; Se o coeficiente aditivo de um dos traços for igua a zero, por exempo a 2 = 0, LR 12 = LR 1 1 ρ LR 2 1, a estatística da razão de verossimihanças da anáise conjunta será maior ou igua à estatística cacuada para o outro traço isoadamente, se os traços forem correacionados; LR 12 Maximo(LR 1, LR 2 ). A estatística razão de verossimihanças da anáise conjunta será sempre maior ou igua ao vaor máximo encontrado para as estatísticas individuamente. Se a mutipicação dos efeitos aditivos ou de dominância (a 1 a 2 ou d 1 d 2 ) associados aos dois traços com a correação (ρ) entre ees resutar em um sina negativo, isto é, ρa 1 a 2 < 0 ou ρd 1 d 2 < 0 então a estatística razão de verossimihanças da anáise conjunta é maior que a soma das estatísticas cacuadas separadamente, LR 12 > LR 1 + LR 2. Neste caso, o poder da anáise conjunta para mapeamento de QTL s é maior que a de quaquer anáise separada. Trata-se da situação mais favoráve para a anáise conjunta. Apesar da decisiva importância do útimo critério apresentado, sua interpretação não é simpes. Nas apicações das diversas metodoogias do mapeamento genético, serão exporadas as vantagens do mapeamento genético mutivariado, evando-se em conta principamente a útima vantagem descrita, em que é apresentada a condição mais favoráve para a anáise conjunta, a qua será uma ferramenta fundamenta nas anáises deste trabaho, permitindo obter concusões importantes no estudo da pressão arteria. Como estabeecido anteriormente, com respeito ao efeito de peiotropia e interações gene ambiente, os estudos devem ser abordados do ponto de vista dos modeos mutivariados. Contudo, ao anaisar os traços em conjunto, muitas vezes não fica caro a contribuição de cada traço ao mapeamento de genes. Nestas anáises é importante identificar, tanto quanto possíve, genes com efeito sobre um único traço e aquees com efeito peiotrópico (sobre mais de um traço), assim como a interação gene ambiente. Através das anáises consideradas foram utiizadas três possíveis abordagens univariadas para escarecer os diferentes padrões de reguação genética encontrados nas anáises mutivariadas. Mapeamento univariado da medida resumo diferença entre fenótipos avaiados em situações antes e depois de uma intervenção Quando um mesmo fenótipo é medido em duas condições ambientais diferentes é comum, nas anáises estatísticas dos dados, adotar a medida resumo diferença entre os fenótipos. Para o caso em estudo, os fenótipos nos diferentes ambientes (ambiente 1 e ambiente 2) são avaiados no mesmo conjunto de indivíduos. Consideram-se os dois seguintes modeos univariados para o i-ésimo indivíduo: y 1i = µ 01 + a 1 X ai + d 1 X di + (a 1 x ai + d 1 x di ) + e 1i ; (8) y 2i = µ 02 + a 2 X ai + d 2 X di + (a 2 x ai + d 2 x di ) + e 2i, (9)
de forma que a diferença entre estes fenótipos é dada por: y DIF i = y 2i y 1i, É conhecido que para duas variáveis aeatórias quaisquer a variância da diferença é dada por: No primeiro estágio, o termo da esquerda y i (µ 0 + βx ci ) pode ser estimado via um modeo de regressão simpes o qua pode ser escrito como: y i = µ 0 +βx ci +ɛ i onde os erros são assumidos normais, independentes e homocedásticos. Ajustando este modeo por métodos de regressão cássicos, são encontrados os resíduos, que serão denotados por r i : var(y 2 Y 1 ) = var(y 1 ) + var(y 2 ) 2Cov(Y 1, Y 2 ) = σ 2 1 + σ2 2 2σ 1 σ 2 ρ 12. (10) r i = ŷ i ˆµ i ˆβx ci. Assim, ao adotar a variáve diferença, para que haja ganho em precisão devido à incorporação da estrutura de dependência entre y 1 e y 2 nas anáises, é necessário que a correação entre as variáveis, ρ 12, seja positiva. Mapeamento genético mediante o ajuste por covariáveis Resutados encontrados na iteratura indicam que pode-se ganhar precisão nos resutados inferenciais por meio da incusão de covariáveis em modeos de regressão. O probema de peiotropia bem como de interação gene ambiente será considerado um probema de natureza" bivariada, que está sendo avaiado sob uma formuação univariada ao introduzir um fenótipo como covariáve no ajuste do outro fenótipo. Sejam Y = (y 1, y 2,..., y n ) e X c = (x c1, x c2,..., x cn ) os fenótipos tomados de uma amostra de n indivíduos. Para conhecer qua é a contribuição da variáve X c nas anáises genéticas de Y, propõe-se o seguinte modeo univariado para o i-ésimo indivíduo: y i = µ 0 + ax ai + dx di + (a x ai + d x di ) + β x ci +e i, (11) }{{} Covariáve i = 1, 2,..., n onde, β: parâmetro associado à covariáve x ci incuída no modeo. As variáveis X ai, X di, x ai, x di, os outros parâmetros a, d, a, d e e i, o resíduo, foram definidos como no modeo para o caso univariado dado na expressão (1). Para o ajuste do modeo de regressão incuindo covariáveis (11), para finaidade de mapeamento de genes com efeitos peiotrópicos ou modeagem do efeito de interação gene ambiente opta-se pea anáise em dois estágios. Ressata-se que esta aternativa será adotada mais por razão de conveniência do uso do apicativo Cartographer que é usado neste trabaho. Nota-se que o modeo (11), o qua pode ser chamado de modeo competo, para agumas finaidades, pode ser escrito como: y i (µ 0 + βx ci ) = ax ai + dx di + (a x ai + d x dj ) + e i. (12) No segundo estágio, r i, a estimativa do resíduo do modeo no primeiro estágio, será considerado como o novo fenótipo (considerado observado) para ser anaisado sob a abordagem univariada de mapeamento genético. r i = µr + ar X ai + dr X di + (a r x ai + d r x di ) + e ri. (13) Nota-se que as anáises via a variáve Y DIF, descritas na seção anterior, são um caso particuar do ajuste por covariáveis fixando β = 1. Mapeamento utiizando a decomposição espectra das respostas mutivariadas A anáise de componentes principais é uma técnica estatística que transforma inearmente um conjunto de p variáveis correacionadas em um conjunto com um número p de variáveis não correacionadas, em que cada variáve expica uma parcea das informações do conjunto origina. As p variáveis originais (Y 1,..., Y p ) são transformadas em p variáveis (Ỹ1,..., Ỹp), denominadas componentes principais em que Ỹ1 expica a maior porcentagem da variabiidade tota dos dados, Ỹ2 expica a segunda maior variabiidade e assim por diante. O conjunto das p variáveis canônicas Ỹ pode ser reduzido, dado que agumas variáveis podem expicar uma parcea desprezíve da variabiidade tota. A anáise de Componentes Principais depende somente da matriz de covariância (Σ) ou da matriz de correação ρ(x 1,..., X p ) entre as variáveis. Não requer quaquer suposição sobre a forma da distribuição mutivariada dessas variáveis, porém, se a normaidade nos dados é verificada, os resutados podem ser mais consistentes [3]. Com base nessa teoria, [6] propuseram um método mutivariado para o mapeamento de QTL s: Uma transformação canônica de m traços é feita para se obter um conjunto de variáveis canônicas não correacionadas, que estejam associadas aos traços originais. Cada variáve canônica é então anaisada peo método de mapeamento por intervao univariado ou por agum procedimento equivaente.
Para uma popuação F 2, Y n m denotará a matriz cujas m counas representam os fenótipos de n indivíduos: Y = ( Y 1 Y 2... Y m ) (14) com cov(y ) = Σ m m. Pea decomposição espectra, a matriz Σ pode ser escrita como: Σ = P P onde P = ( V 1 V 2... V m ), (15) representa o conjunto dos m autovetores e, λ 1 0... 0 0 λ 2... 0 n m =....., (16) 0 0... λ m a matriz dos autovaores contidos na diagona principa. Seja Ỹn m a matriz cujas m counas representam as m variáveis canônicas obtidas mediante a decomposição espectra da matriz Σ, isto é, onde, Ỹ n m = ( Ỹ 1 Ỹ 2... Ỹ m ), (17) Ỹ 1 = V1 T Y = v 11 Y 1 + v 12 Y 2 +... v 1m Y m, (18) Ỹ 2 = V2 T Y = v 21 Y 1 + v 22 Y 2 +... v 2m Y m,. Ỹ m = V T m Y = v m1 Y 1 + v m2 Y 2 +... v mm Y m, ta que, var(ỹj) = λ j, cov(ỹj, Ỹk) = 0 e cov(ỹj, Y i ) = ρỹj,y i λj σ Yi Para o estudo reaizado no presente trabaho, procura-se variáveis canônicas com o intuito de encontrar QTL s que estejam associados às medidas de pressão arteria antes e após uma dose de sa. Cada variáve canônica é considerada como um fenótipo e será anaisada sob o modeo dado em (1) descrito para o mapeamento univariado 3. Resutados Referentes ao estudo da pressão arteria aguns estudos já foram pubicados [8], utiizando os fenótipos da pressão basa e pós-sa por médio de anáises univariadas, apresentam 5 regiões cromossômicas que são reguadoras da pressão arteria, especificamente, nos croossomos 2, 4, 8 e 16. Em [9] utiizando um modeo bivariado, evando em consideração a correação entre os fenótipos da pressão basa e pós-sa é encontrado poder para detectar um novo QTL no cromossomo 5 do genoma dos ratos não identificado por meio da anáise de traços inviduais. Dando continuidade aos estudos citados, mediante a apicação das metodoogías mutivariadas e suas aternativas univariadas, ao conjunto de dados reais, aguns resutados interessantes foram obtidos no presente trabaho: os QTL s nos cromossomos 2, 4, 8 e 16 estão associados á variabiidade da pressão sistóica independente da resposta ao sa e ao remédio. O novo QTL detectado no cromossomo 5 do genoma dos ratos ajuda na diminuição dos níveis de pressão sistóica quando ingerido o sa, principamente nos indivíduos homozigotos mm e indivíduos heterozigotos M m. Também, o medicamento antihipertensivo Captopri ajuda na redução dos níveis da pressão sistóica independente do genótipo dos indivíduos. Referências [1] Haey. C.S and Knott S.A, A simpe regression method for mapping quantitative trait oci in ine crosses using fanking markers, Heredity. 69 (1992), 315 324. [2] Jiang C. and Zeng Z.B., Mutipe trait anaysis of genetic mapping for quantitative trait oci, Genetics. 140 (1995), 1111 1127. [3] Johnson R. A. and Wichern D.W., Appied Mutivarite Statistica Anaysis, Prentice Ha, Upper Sadde River, 1998. [4] Lander E.S. and Botstein D., Mapping Mendeian Factors underying Quantitative Traits using RFLP inkage maps, Genetics. 121 (1989), 185 199. [5] Lynch M. and Wash B., Genetics and anaysis of quantitative traits., Sinauer Sunderand, Massachusetts, 1998. [6] Mangin B., Thoquet P., and Grimsey N., Peiotropic QTL Anaysis, Biometrics. 54 (1998), 88 99. [7] Samani N.J., Genome scans for hypertension and bood pressure reguation, Am J Hypertens. 16 (2003), 167 171. [8] Schork N.J., Krieger J.E., Troiet M.R., Franchini K.G., Koike G., Kriger E.M., Lander E.S., Dzau V.J., and Jacob H.J., A biometrica genome search in rats reveas the mutigenetic basic of bood pressure variation, Genome Research. 5 (1995), 164 172. [9] Soer J.M.P., Pereira A., Krieger J.E., and Tôrres C.H., Anaysis in Bood Pressure Sat-Sensitivity: Identification of a nove QTL in rat chromosome 5, BMC Med Genet. 7 (2006), no. 47. [10] Zeng Z.B., Precision mapping quantitative trait oci, Genetics. 136 (1994), 1457 1468.